专利名称：酵母生物合成谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母(产朊假丝酵母OmAWfl "07&或X X Sacc/^rany;c" v/Wae)生物合成谷胱甘肽的方法。
背景技术：
谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合 物，其在自然界中主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉和血液中， 一些植物 如蔬菜、豆类、谷物、薯类和菇类也含有GSH。作为一种含巯基的多肽物 质，GSH是一种重要的生化药物，科学家们一直在研究它在各种生物体内 的生理作用，以及在人体各种组织细胞中的含量和各种疾病与组织损伤的 关系。
谷胱甘肽作为一种重要的生理活性物质，人们对其在临床医学、食品 添加剂和运动营养学上的兴趣将日益增长，且需求量不断增加。临床上在 抗辐射、肿瘤、癌症、氧中毒、衰老和协调内分泌的治疗中效果明显且无 副作用。在食品加工业，作为一种抗氧化剂，谷胱甘肽具有增强食品营养 价值和强化食品风味的功能。在体育运动领域，谷胱甘肽能够提高体内血 红蛋白的含量，并保护红细胞免遭氧化性破坏。因此，无论是在运动性贫 血机理的探讨，还是训练过度的预防、运动性疲劳机理的探讨，以及运动 营养的补充方面GSH都备受人们关注。
目前，谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法等。 谷胱甘肽的化学合成生产工艺已较成熟，但存在成本高、反应歩骤多、反 应时间长、操作复杂、环境污染等问题。发酵法生产谷胱甘肽方法简单， 成本低，污染小，是非常有前景的一种生产方法。目前，发酵法生产谷胱 甘肽水平最高可达约2g/L。但由于国内外市场对于该产品的需求量很大， 进一步开展发酵法生产谷胱甘肽的研究，提高谷胱甘肽菌种的发酵水平仍 有很高的经济应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是进一步提高酵母生物合成谷胱甘肽的
本发明方法按照本领域公知的酵母菌发酵方法进行，即将菌种在无菌 条件下接入种子培养基中，培养至对数期后，接入发酵培养基中进行发酵。 本发明人发现，在发酵过程中添加一定浓度的乳酸盐可以进一步提高酵母 生物合成谷胱甘肽的产量。
因此，本发明的目的是提供一种酵母生物合成谷胱甘肽的方法，包括 在发酵过程中向培养基添加乳酸盐的步骤。
所述乳酸盐可包括但不限于乳酸钠、乳酸亚铁和乳酸钙，最优地使用
乳酸钠；在培养液中该盐浓度为1% 10%，最优的浓度为4%。当乳酸盐的 浓度低于1%或高于10%时，谷胱甘肽的产量将降低。 本发明的百分比指g/100ml。
本发明中，所述盐的添加时间是一个重要的影响因素，添加时间为发 酵周期的第10-25小时，优选为发酵周期的第15小时。当添加时间小于发酵 的第10小时或大于发酵的第25小时时，谷胱甘肽的产量将降低。
发明中所说的培养基，通常含有碳源、氮源、维生素、和微量元素。
其中，本发明的碳源可包括但不限于葡萄糖、蔗糖及果糖等，最优地 使用葡萄糖，在培养基中该碳源浓度为1% 10%，最优地浓度为4%;
本发明中，培养基中所含的维生素是由某些天然物质，如酵母粉、大 豆蛋白胨及酵母抽提物等提供，最优地使用大豆蛋白胨，在反应液中该物 质优选浓度为0.1% 1%，浓度太低或太高，谷胱甘肽的合成水平均会受到 影响，本发明最优选其浓度在0.6%;
氮源可包括但不限于蛋白胨、尿素和硫酸铵等，最优的使用硫酸铵， 其在反应液中的浓度一般为0.1 2%，最优浓度为1.2%;
磷源可包括但不限于KH2P04， K2HP04， (NH4)2HP04， (NH4)H2P04，在 培养液中浓度为0% 1%，本发明中以不使用磷源为最优；
微量元素可包括但不限于硫酸铜，硫酸亚铁，硫酸锰，硫酸锌，其在 反应液中的浓度一般为0.001 0.003%。使用本发明方法进行谷胱甘肽的生物合成，其合成水平通常可稳定地
提高20%以上。
具体实施例方式
实施例1
菌种Ca"AWa^7& YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢 钾0.02%,硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取ioml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第15h，添加终浓度4%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到2.5g/L。
实施例2
菌种CawJzV/a YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢 钾0.02%，硫酸镁0.02%,硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%，pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第15h，添加终浓度2%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到1.8g/L。
实施例3
菌种C朋AWfll^7/; YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%,酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢
钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%,硫酸铜0.0008%，半胱氨酸 0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚烷磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第10h，添加终浓度4%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到1.4g/L。
实施例4
菌种OmAWa2^7^ YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢
钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min，10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第15h，添加终浓度8%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到2.2g/L。
实施例5
菌种OzmZ/Jaw"/" YPD斜面培养基； 种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1% 发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢 钾0.02%，硫酸镁0.02%,硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚烷磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第20h，添加终浓度4%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到1.3g/L。
实施例6
菌种Ca"^'Ja w"";y YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢
钾0.02%，硫酸镁0.02%,硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚烷磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至15h，添加终浓度4%的乳酸 亚铁，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到1.5g/L。
实施例7
菌种CawaWfl""/& YPD斜面培养基； 种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1% 发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢 钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%,硫酸铜0.0008%,半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
本发明发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水 浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第15h，添加终浓度4%的乳 酸转，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到1.5g/L。
实施例8
菌禾中Sacc/uzromyces cerevi'si'ae YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢钾0.02%,硫酸镁0.02%,硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸 0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
本发明发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水 浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%,发酵至第15h，添加终浓度4%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量达 到1.2g/L。
实施例9
胃ft: Sacc/za^ow7少ces ce^ev/s/flg YPD余斗，i音l^g; 种子培养基葡萄糖2%,酵母抽提物1%，蛋白胨1% 发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢
钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
本发明发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水 浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210mn。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%， 40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用 HPLC检测，谷胱甘肽产量达到0.8g/L。
对比例1
菌种0 wAWa YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢 钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
本发明发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水 浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚烷磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第15h，添加终浓度0.2%的 乳酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量 为1.2g/L。
对比例2
菌种CawoWa"""; YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%,酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢
钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
本发明发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水 浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L,庚垸磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第15h，添加终浓度15%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量为 0.6g/L。
对比例3菌种CawAV/aM"/& YPD斜面培养基； 种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1% 发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢 钾0.02%,硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%，硫酸铜0.0008%，半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
本发明发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水 浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L,庚烷磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%，发酵至第30h，添加终浓度15%的乳 酸钠，40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用HPLC检测，谷胱甘肽产量为 0.7g/L。
对比例4
菌种CawflWaM"^ YPD斜面培养基；
种子培养基葡萄糖2%，酵母抽提物1%，蛋白胨1%
发酵培养基葡萄糖4%，硫酸铵0.5%，酵母抽提物0.2%，磷酸二氢
钾0.02%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.0008%,硫酸铜0.0008%,半胱氨酸
0.1%;
补料培养基葡萄糖50%;
发酵单位测定方法取10ml发酵液用硫酸调pH至1.5，沸水浴2min， 10000rpm离心5min，取上清液，HPLC测定含量。
HPLC检测条件磷酸二氢钠6.8g/L，庚烷磺酸钠2.2g/L，甲醇4%， pH3.0，检测波长210nm。
将菌种在无菌条件下接入种子培养基中。培养至对数期后，接入发酵 培养基中，维持糖浓度不低于0.1%， 40h放瓶。发酵液经稀硫酸抽提后用 HPLC检测，谷胱甘肽产量为1.0g/L。
权利要求
1.酵母生物合成谷胱甘肽的方法，包括在发酵过程中向培养基添加乳酸盐的步骤。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐为乳酸钠、乳 酸亚铁或乳酸钙。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐为乳酸钠。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐的添加终浓度 为1%-10%。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐的添加终浓度 为4%。
6. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐的添加时间为 发酵周期的第10-25小时。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐的添加时间为 发酵周期的第15小时。
全文摘要
本发明公开了一种酵母生物合成谷胱甘肽的方法，包括在发酵过程中向培养基添加一种盐的步骤。使用本发明方法进行谷胱甘肽的生物合成，其合成水平通常可稳定地提高20％以上。本发明的方法简单易行，容易实现规模化生产，因此降低了生产成本，具有很高的经济价值。
文档编号C12R1/72GK101538600SQ20081003480
公开日2009年9月23日 申请日期2008年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者程晴华, 波 赵, 赵文杰, 雪 陈 申请人:上海医药工业研究院