黄瓜侧枝抑制基因cls的蛋白编码序列的利记博彩app

专利名称：：黄瓜侧枝抑制基因cls的蛋白编码序列的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及的是一种基因工程
技术领域：
的编码序列，特别是一种黄瓜侧枝抑制基因cls的蛋白编码序列。
背景技术：
：植物分枝发育在植物形态建成中有重要的地位。作物分枝是影响作物产量的重要农艺性状之一，在玉米的驯化过程中通过减少分枝可以达到增产的目的，在水稻中分蘖数目过多或者过少都不利于产量的提高。对于黄瓜来说，产量高低和侧枝数目也有密切的关系。到目前为止，黄瓜侧枝一直被作为数量性状进行研究，己经定位了几个和侧枝发育相关的QTLs。但从来没有分离得到基因，更没有进行过详细研究。但在玉米、水稻、拟南芥、番茄、豌豆中已经分离得到了多个和侧枝发育相关的基因，其中最引人注目的是番茄侧枝抑制基因ls的分离和功能验证。番茄的ls基因是最早影响腋生分生组织形成的基因之一，是植物特有的GRAS转录因子家族的重要成员。GRAS基因家族的蛋白产物均为转录因子，具有调控其它基因转录的能力，名字由最早发现的三个成员，GAI，RGA，SCR的首字母拼写而成。典型的GRAS蛋白有400-700个氨基酸组成，两个亮氨酸七聚体重复序列(LeucineH印tadR印eats)包围的VHIID结构域，一个保守的C-末段和长度、序列可变的N-末端，也就是N-末端的序列赋予了其物种特异性。本发明克隆的基因cls也属于GRAS基因家族，预测应该也是一个转录因子。在对现有技术文献的分析中，虽然《Proc.Natl.Acad.Sci.USA美国国家科学院学报》，1999，1，96:290-295发表了文章"Thelateralsuppressor(Ls)geneoftomatoencodesanewmemberoftheVHIIDproteinfamily番茄侧枝抑制基因Ls编码蛋白是VHIID家族的一个新成员"对番茄侧枝抑制基因Ls的功能作了详细阐述；《TheorApplGenet理论运用遗传学》在2003，107:875-883发表的文章"Comparativeanalysisofresponsetophenotypicandmarker-assistedselectionformultiplelateralbranchingincucumber(CucumissativusL.)黄瓜多侧枝性状的分子标记辅助选择与表型的比较分析"对多侧枝性状进行了QTLs定位，但并未分离得到基因。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列。本发明可以促进侧芽原基形成，用于粮食作物、花卉植物、经济作物、油料作物上，增加它们的侧枝数目，从而增加产量。本发明是通过以下技术方案实现的在本发明的一个方面，提供了一种分离出的cDNA分子，该分子包括编码具有黄瓜侧枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第491-1666位的核苷酸序列有至少70%的同源性。或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件(杂交温度在55"C-6(TC之间)与SEQIDNO.3中第491-1666位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的核苷酸序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片断，或其活性衍生物。更佳地，所述的编码序列具有SEQIDNO.3中第491-1666位的核苷酸序列。在本发明另一个方面，提供了一种分离出的黄瓜侧枝抑制基因的蛋白质多肽，它包括具有SEQIDN0.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段。该多肽在植物腋生分生组织形成的早期表达，是植物侧生器官形成必不可少的蛋白。本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。本发明还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例中该宿主细胞是拟南芥。本发明中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段己从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段己经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。本发明所述的编码序列，包括编码具有黄瓜侧枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第491-1666位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的编码框第491-1666位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.3中第491-1666位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNO.3所述的序列。该术语还包括能与SEQIDNO.3中核苷酸第491-1666位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.3中从核苷酸第491-1666位的核苷酸序列的同源性至少70%，可优选80%，进一步优选90%，最佳优选95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与黄瓜侧枝抑制基因相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，可优选1-60个，进一步优选1-20个，最佳优选1-10个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，可优选30个以内，进一步优选10个以内，最佳优选5个以内)核苷酸。本发明所述的编码序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。还包括具有与黄瓜侧枝抑制相关相同功能的、SEQIDNO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-50个，可优选l-30个，进一步优选l-20个，最佳优选1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，可优选10个以内，进一步优选5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还包括黄瓜侧枝抑制基因相关蛋白的活性片断和活性衍生物。本发明的黄瓜侧枝抑制基因的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在中度(杂交温度55-6(TC)或者高度严紧条件下(杂交温度高于65°C)能与黄瓜侧枝抑制基因相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用黄瓜侧枝抑制基因的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，"黄瓜侧枝抑制基因变异多肽"指与SEQIDNO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，可优选8个，进一步优选5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>发明还包括侧枝抑制基因蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然侧枝抑制基因相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的黄瓜侧枝抑制多肽时，可以将黄瓜侧枝抑制基因的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成黄瓜侧枝抑制蛋白表达载体。如本发明所用，"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语"宿主细胞"为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用原位杂交技术分析黄瓜侧枝抑制蛋白CLS在黄瓜不同组织中的表达情况。此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有黄瓜侧枝抑制基因核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码黄瓜侧枝抑制基因相关的核酸分子。本发明还提供了检测样品中是否存在黄瓜侧枝抑制相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于黄瓜侧枝抑制相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的黄瓜侧枝抑制核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选黄瓜侧枝抑制相关同源基因或同源蛋白。为了得到与黄瓜侧枝抑制相关基因的黄瓜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选黄瓜cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对黄瓜侧枝抑制相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自黄瓜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene，PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与黄瓜侧枝抑制相关的基因家族的核苷酸序列。本发明的黄瓜侧枝抑制相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ".(1963)J".AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的黄瓜侧枝抑制基因，通过各种常规筛选方法，可筛选出与黄瓜侧枝抑制相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。植物分枝发育在植物形态建成中具有重要地位。作物的分枝是影响作物结实多少并进而影响单产的重要农艺性状之一。本发明是具有形成侧生分生组织能力的植物细胞。在侧芽原基形成的早期作用，是植物侧生分生组织发育中的关键基因。完全能够让无侧枝的拟南芥突变体长出侧枝，说明该基因在不同物种中的保守性非常强，完全可以用于粮食作物、观叶、观茎花卉植物上的应用，增加它们侧枝的数目已提高这些植物的产量或者观赏价值。因此，本发明具有很大的应用价值。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1黄瓜侧枝抑制基因的克隆1.组织分离(isolation)黄瓜s06为我们实验室收集的欧洲温室品种，将黄瓜置于28'C发芽24小时，然后播种于穴盘中，待黄瓜两片子叶完全展平时大概一周的时间，准备抽取DNA或RNA。2.RNA的分离(RNAisolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TRIzolReagents,GIBCOBRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthc腿)根据拟南芥，番茄，水稻的侧枝抑制基因的核苷酸保守序列，利用同源基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQIDNO.1)+BP002(SEQIDNO.2)]得到2002BP(931bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用M13或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabid叩sisthaliana)黄瓜侧枝抑制基因的同源性很高，故初步认为它是一个侧枝抑制基因。(2)3,-RACEPCR[AP+BP003(5，TTCATAAGACTGGTGATAGACTCTCA-3，)]得到2002BP3，(817bp),回收，连接到T-Easy载体上，用M13或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsisthaiiana)侧枝抑制基因的同源性很高，故初步认为它是一个与侧枝抑制相关基因。(3)5'-RACE第一轮PCR[AAP+BP004(5，GAGAAATAAAATGAGCACAACGGATA—3，)]第二轮PCR[(AUAP+BPR005(5，-CACAACGGATAAGTAATTGACGCAT-3，))得到2001BP5'(约500bp)(过程同(l))将测序结果的重叠区拼接，发现过程(1)得到的片段既是该基因的完整编码区。BLAST的结果证明从黄瓜中新得到的基因确为一个与植物分枝相关的基因。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的黄瓜侧枝抑制基因的全长编码序列(SEQIDNO.3)。实施例2黄瓜侧枝抑制相关基因的序列信息与同源性分析本实施例新的黄瓜侧枝抑制基因cDNA全长为2175bp(SEQIDNO.3)，其中开放读框位于491-1666位核苷酸(1175个核苷酸)。根据全长cDNA推导出黄瓜侧枝抑制基因的氨基酸序列，共391个氨基酸残基，详细序列见SEQIDNO.3。将黄瓜侧枝抑制基因相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non—redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non—redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番茄侧枝抑制基因(AF098674)只在核苷酸的部分区段上有同源性(附表2)，在氨基酸(AAD05242)水平上具有67%的相同性(附表3);番茄侧枝抑制基因已经被证明具有明显的促进侧芽萌发的作用，可以认为cls基因在促进侧芽起始上也具有相似的作用。表272%IdentityinoverlapQuery1236TGAATCCMAAGTGGTGACAATAGCTGAMAGGAAGCAMTTTCAACCATCCATTATTCA1295Sbjct990TGAACCCTAAAATTGTTACAATCGCGGAGAAGGAAGCAMTCATAACCATCCTCTTTTTT1049Query1296TGCMAGATTTGTAGAGGCATTGAATCATTACACTTTATTATTTGATTCATTAGAAGCAA1355Sbjct1050TACMAGATTCATCGAGGCGTTGGATTATTATACAGCTGTGTTTGATTCACTGGAAGCTA1109Query1356CTTTACCTCCAMCAGTAGGGAGAGATTGGCAGTGGAGCAAGTTTGGTTTGGGAGGGMA1415iiiiiiimimiliimiiimiliiimmii11iSbjct1110CATTGCCACCGGGTAGTCGAGAGAGGATGACAGTTGMCAAGTGTGGTTTGGGAGAGAGA1169Query1416TAAACGACATCGTTTCAGGAGMGTGAATAA—-GAMMACAACACTATGCTGAAAGGT1472iiiiiimiiiuimmiiimiiimmSbjct1170TTGTTGATATCGTTGCGATGGAAGGAGATAMAGGAMGAMGACA------TGAAAGGT1223Query1473ATGMTCATGGGAMCMTGCTTAAAAGTTTAGGGTTTTCTAATATTCCTTTAAGCCCTT1532Sbjct1224TTAGATCATGGGAAGTTATGTTGAGGAGTTGTGGATTTAGTAATGTTGCTTTAAGCCCTT1283Query1533TCGCTCTCTCACAAGCTAMCTCCTTCTTAGACTTCATTATCCTTCTGAAGGTTATCATC1592Sbjct1284TTGCATTATCACAAGCTAAGCTTCTTTTGAGACTTCATTATCCTTCTGAAGGCTATCMC1343Query1593TCCAAATCCTTC-ATGATTCCCTTTTTCTT-GGTTGGCAAMTCAACCCCTCTTTTCAGT1650Sbjct1344TCGGAGT--TTCGAGTMTTCTTTCTTCTTAGGTTGGCAAMTCAACCCCTTTTCTCCAT1401Query1651CTCTTCATGGCATTGAAAAAAA1672iuiiimimmiSbjct1402CTCGTCTTGGCGTTGAGAAAAA142369%identityinoverlapQuery779ATTCAATCTTGTTACTTATCATTGAATCMATCACGCCCTTTATTAGATTCACCCATTTA838lllllllliMlllliIIIIIIIIIIiiUIIiiIIil111Sbjct524ATTCAATCATCATATCTATCTCTAMCCMGTTACCCCTTTCATAAGGTTTACTCMTTA583Query839ACTGCAAATCAAGCCATTTTAGMGGTATTGAAGAAAGTGGT-ATG—ATTCATGTTTTG895Sbjct584ACCGCTAATCAAGCGATTTTAGMGCGATTAACGGTMTCATCAAGCAATCCACATCGTT643Query896GATTTCGATATTATGCATGGTGTTCAATGGCCTCCTCTTATGCAAGCTTTGGCCGATCGTSbjct644GATTTCGACATTAATCACGGGGTTCAATGGCCACCGTTMTGCAAGCACTAGCTGATCGT955703Query956TTTCCTTCTCCTATGCTTCGTATTACTGCCACTGGTGTTGATCTTAATTTCCTTCATMG1015Sbjct704TACCCTGCTCCCACTCTTCGMTCACCGGTACTGGAMTGACCTTGATACCCTTCGTAGA763Query1016ACTGGTGATAGACTCTCAAGATTTGCCCMTCACTTGGTTTGAGGTTTCAGTTTCACCCTiiiiiiiiiiiiiimiiimiiiimilmilm11imSbjct764ACAGGTGATCGTTTAGCTAAATTTGCTCACTCATTAGGGTTGAGATTTCMTTCCATCCT107582368%identityinoverlapQuery563CAMTGCGTCMTTACTTATCCGTTGTGCtcattttatttctcaatctgatttcatttca622MMIIIIllllIIiIIMIIIIMillIIIIIIIMIISbjct272CAMTCCGCCAGCTACTCATTAGCTGTGCGGAGTTGATTTCGCAGTCCGATTTCTCGGCC331Query623682IISbjct332GCGAAAAGACTCCTTACTATATTATCAACTAACTCATCTCCTTTTGGTGATTCAACTGM391Query683AGATTACTCCAT694Sbjct392CGGTTAGTCCAT403Query:黄瓜侧枝抑制基因CLS的核苷酸序列Sbjct:番茄LS的核苷酸序列(AF098674)表2为本发明的黄瓜侧枝抑制基因(els)与番茄侧枝抑制基因(ls)的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>YL++SFLGWQNQPLFS+SSWSbjct403YQLGVSSNSFFLGWQNQPLFSISSW427Query:黄瓜侧枝抑制基因CLS的氨基酸序列Subjct:番茄LS的氨基酸序列(MD05242)表3为本发明的黄瓜侧枝基因(els)与拟南芥侧枝抑制基因(Is)的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用"+"标出。实施例3cls基因的亚细胞定位GRAS家族蛋白成员的功能是转录因子，基于己经发现的一些GRAS成员，如RGA和SLR1有核定位信号。但用分子生物学软件(pS0RT，http〃psort.nibb.ac.jp)分析表明CLS无跨膜区域，为了确定CLS是否定位在核里，构建了一个包含绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白CLS-GFP，构建进顺时表达载体PA-7。用基因枪轰击到洋葱的表皮里，24'C暗培养36个小时后用激光共聚焦显微镜观察。结果绿色荧光信号主要在核中检测到，表明CLS是定位在核里，推测是一个转录因子。实施例4黄瓜侧枝抑制基因相关蛋白或多肽在拟南芥中进行真核细胞表达及转基因植株的鉴定含目的基因(黄瓜侧枝抑制基因cls)表达载体的构建根据黄瓜侧枝抑制基因的全长cDNA序列(SEQIDNO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将黄瓜侧枝抑制基因cDNA克隆至中间载体(如pUCM-T)，进一步克隆到双元表达载体(pM0N530)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，采用花序浸染法转化拟南芥。l.植物的生长按照蛭石6黑土1珍珠岩0.25的比例配好基质，装到直径8CM的穴盘中，将拟南芥种子点播在上面，覆盖上保鲜膜，放入4"C冷藏室，3天后转入温度24。C日照16h黑暗8h的光照培养箱中培养。当植株长至茎高约3cm时，去除其顶生化序，以刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。待腋生花序长出，其下部的花已有授粉现象出现时进行转化，转化前，将已授粉的花以及果荚除掉。2.菌液制备及侵染操作挑取鉴定好的农杆菌单克隆放于20ml含有壮观霉素spe/卡那霉素KM各200ul的LB液体培养基中，28°C，250rpm震荡培养至0D600为0.5左右。在转化前一天，转入50ml同样的LB液体培养基过夜，第二天，当菌液0D600在1.2-1.6之间时取出使用。室温5000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基(1/2MS+蔗糖5。/6+silwetL77200ul/L+6BAlmg/ml)PH值5.6，将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣在里面，侵染30s，取出暗培养1天。根据情况可以再浸染一次。培养3-4周，待种子成熟后，收取种子，干燥箱中存放2周。3.转化子的筛选及遗传分析将种子均匀分散到固体筛选培养基(MS，1%蔗糖，0.8%琼脂，PH5.7，卡那霉素50mg/ml)表面。拟南芥培养拟南芥培养平皿4'C处理两天，22-25'C遮光培养两天后，放入恒温培养室，大约两周后，既可区分转化株与未转化株，转化株移栽到土中以收取T1代种子。4.转化子的遗传分析为得到纯合的拟南芥转基因株，转化株自交三代，取T3代种子进行生理生化测试。鉴于拟南芥las基因对侧芽原基的形成具有明显的促进作用，拟南芥"缺失突变体在短日照条件下表现出莲座期完全没有侧枝的特点。因此互补成功的植株在短日照处理28天后再在长日照下生长一个月，首先表现出莲座期有较多侧枝长出，其次用半定量RT-PCR鉴定结果表明表型互补的植株中能检测到黄瓜侧枝抑制基因的转录，但在拟南芥"突变体和野生型中则检测不到。这证明cls基因对侧芽的萌发具有确切的作用，黄瓜cls基因将可用于利用转基因技术改变植物侧枝数目的研究和产业化生产中。实施例5黄瓜侧枝抑制基因cls在黄瓜中的拷贝数分析采用常规方法从黄瓜七天幼苗的叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用BamH和EcoRI酶切DNA[20pg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用AmershamPharmacia公司GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule(PRN3540)，我们将cls基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60。C杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC,P/。SDS)中，于60°C漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1%SDS)中于60。C漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照RocheDIGlabeled试剂盒说明书)。结果(Southernblot)在杂交膜上仅出现一条杂交条带，说明cls基因在黄瓜中只存在一个拷贝。实施例6黄瓜侧枝抑制基因cls在黄瓜中的原位表达1.材料的准备取十天苗龄的黄瓜顶芽材料用FAA固定液，4'C固定12-16h，经过酒精梯度脱水，透明处理后包埋进石蜡(ParaplastPlus,sigma)切片，切片厚度10um。2.探针的准备用黄瓜侧枝抑制基因序列设计引物YWF-TGGATCCGAACCAGAACAGCAGGAA,YWR-TGTCGACGTGGCAGTAATACGAAGC扩增黄瓜侧枝抑制基因cls的部分cDNA片断，共454bp测序正确后亚克隆到pSK载体上，抽取质粒分别用BamHI和Sail完全酶切作为T7和T3聚合酶的模版。线性化得到正义和反义探针。探针一般水解成75-150bp大小的片段，水解时间按照下列公式计算T(time)=(Li-Lf)/KLiLf(Li:原始探针的长度；Lf:最后杂交探针的长度；k=0.llkb/min。)3.原位杂交过程非放射标记的RNA原位杂交的操作过程按照地高辛RNA标记试剂盒(Roche,USA)提供的方法进行。用OlympusBX-51数码相机拍照。RNA原位杂交表明在肉眼未见到有侧芽形成之前就可以检测到CLS在腋生分生组织中的表达。而且与腋生分生组织的高表达相反，CLS在顶端分生组织并没有表达。这些结果说明CLS在侧生分生组织起始和侧芽形成中起到了关键作用。本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(1)序列特征(A)长度:23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述:SEQIDNO.1CA(A/G)TGGCC(T/A/G)CC(A/G/T)TT(G/A)ATGCAAGC(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征:(A)长度:24bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.2(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特征:(A)长度2175bp(B)类型核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>簡TGATAGACTCTCAAGATTTGCCCAATCACT醒TCTTCTTCATGATCGTGATCATCATCGCGT1141TGAAGCTCTCGCCGTTAACTGCGTACTCTA1201CGATGTTCGAGTATTGCTTAATAAAATCAA1261TGAAAAGGAAGCAMTTTCAACCATCCATT1321TCATTACACTTTATTATTTGATTCATTAGA1381ATTGGCAGTGGAGCAAGTTTGGTTTGGGAG1441GAATAAGAAAAAACAACACTATGCTGAAAG1501TTTAGGGTTTTCTAATATTCCTTTAAGCCC1561TAGACTTCATTATCCTTCTGAAGGTTATCA1621TGGTTGGCAAAATCAACCCCTCTTTTCAGT1681AAATTAAAAATTAGGTTTGATTTAGAACCT1741TTAATGTCCAGAGMACGATGAAGGTGCTA1801TTAGGTACATCTTCAGATCTCTTAAGTAAA1861GAAAAGGAAGTATTAATCGTCTTTGAAATT1921ACATGTCTGACTTMTTGAGATGTTCAGGC1981AGCCTATGTAATTTGGCATATGATGATACT2041GCCTAGATTCTTTTCAGGTGTTCTTAAAGA2101AATGTATTATTATTTTTTGTTATTGTACTAAAAAAAAAAA嵐AATGGTTTGAGGTTTCAGTTTCACCCTTTGCTTATCCCTGCTGCTCTTACCCTCTTCCCCGACTTGCACAGGTTTTACAGGTTAATGAAGGAGGCTTTGAATCCAAAAGTGGTGACAATAGCATTCATGCAAAGATTTGTAGAGGCATTGAAAGCAACTTTACCTCCAAACAGTAGGGAGAGGGAAATAAACGACATCGTTTCAGGAGAAGTGTATGAATCATGGGAAACAATGCTTAAAAGTTTCGCTCTCTCACAAGCTAAACTCCTTCTTCTCCAAATCCTTCATGATTCCCTTTTTCTCTCTTCATGGCATTGAAAAAAAAACCCAAACGTCAAGAAAAATAGAGGAATTGACGAGCTAGAATGTATCAACCTAGCTAGTTAAGATGTATTAGCAAGAAGAATATGGAGAGTTTGCATAGCATGCTTTTAGATGGGGTGCAATGAATATCTATTGAACTAGTGGAAGGTTGGTTTGTTGGCTAACTTTGCTTAATTAAATGTGTAAAAGGGGAAAGGGTGAAACCGACAAATATTGAAAATAAAATCTCTGTTTTATTTTTCMAAGG〈210〉3〈211〉391<212>PRT〈213〉CLS蛋白〈400〉21MDPSFNSSHQEHQQEPEQQEDHCLQMRQLLIRCAHFISQSDFISAHHLLSILSSNSSPYG61DSTQRLLHYFSSSLSHLLPSSNYNSSFHH朋HDIEKIQSCYLSLNQITPFIRFTHLTANQ121AILEGIEESGMIHVLDFDIMHGVQWPPLMQALADRFPSPMLRITATGVDLNFL服TGDRL181SRFAQSLGLRFQFHPLLLLHDRDHHRVIPAALTLFPDEALAVNCVLYLHRFYRLMKDDVR241VLLNKIKALNPKVVTIAEKEA腳HPLFMQRFVEALNHYTLLFDSLEATLPPNSRERLAV301EQVWFGREINDIVSGEVNKKKQHYAERYESWETMLKSLGFSNIPLSPFALSQAKLLLRLH361YPSEGYHLQILHDSLFLGWQNQPLFSVSSWH权利要求1、一种黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列，其特征在于，所述的编码序列，包括编码具有黄瓜侧枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第491-1666位的核苷酸序列有至少70％的同源性。2、根据权利要求1的黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列，其特征是，所述的编码序列，它的开放阅读框为自第491-1666共1175个碱基。3、根据权利要求2的黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列，其特征是，所述的开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。斗、根据权利要求l的黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列，其特征是，所述的编码序列，具有SEQIDNO.3的氨基酸序列。4、根据权利要求1的黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列，其特征是，所述的编码序列，它是具有形成侧生分生组织能力的植物细胞。全文摘要本发明涉及的是一种基因工程
技术领域：
的一种黄瓜侧枝抑制基因CLS的编码序列。所述的编码序列，包括编码具有黄瓜侧枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第491-1666位的核苷酸序列有至少70％的同源性。所述的编码序列，它的开放阅读框为自第491-1666共1175个碱基。本发明可以促进侧芽原基形成，用于粮食作物、花卉植物、经济作物、油料作物上，增加它们的侧枝数目，从而增加产量。文档编号C12N15/79GK101240281SQ200810034529公开日2008年8月13日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者原丽华,姚丹青,弛张,朱立煌,润蔡申请人:上海交通大学