黄瓜霜霉病抗性主效qtl连锁的分子标记方法和应用方法

专利名称：：黄瓜霜霉病抗性主效qtl连锁的分子标记方法和应用方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种分子生物
技术领域：
的标记方法，尤其是一种黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法和应用方法。技术背景霜霉病(downymildew)是世界各地黄瓜(CucumissativusL.)产区的重要病害之一，在我国，霜霉病与霜霉病、枯萎病并列为黄瓜三大病害。黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉病菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.&Curt.)Rostov.]引起，该病原菌属鞭毛菌亚门，霜霉菌目，假霜霉属。其主要危害黄瓜叶片，在苗期、成株期均可发病。在适宜的条件下，它的病情发展很快，几天时间便会蔓延到全田，造成叶片发黄、枯死，减产30%-50%。随着分子标记辅助育种技术的迅速发展，为有效的解决这个问题提出了新的方法。通过构建重要抗源的遗传图谱和数量性状位点(QuantitativeTratitLoci，QTL)分析，可以找到与黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁(或共分离)的分子标记。JohanD，TRENDSinPlantScience(植物科学趋势)，2003，Vol.8No.7;MeglicV，TheorApplGenet(应用遗传理论)，1996，92:865-872，该文报道使用与某一特定抗源抗霜霉病主效QTL连锁的分子标记，可以对该特定抗源的后代及其衍生品种(系)在苗期进行早代筛选，淘汰不抗病的植株，节约常规育种的生产成本，提高育种和选择效率。S94是中国华北陆地型黄瓜品系，很多黄瓜育种家已经把它作为抗霜霉病亲本，其霜霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记。使用杀菌剂和推广抗病品种是抵抗霜霉病危害的主要方法。长期使用杀菌剂会危害环境安全,且易引起病菌小种变异产生拮抗作用。种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策略。大量前人工作(吕淑珍，天津农林科技，1990，2:22-24;vanVlietGJA.，PierceLK，Hortscience(园艺科学),1990，25:605-615;MeglicV，TheorApplGenet(应用遗传理论)，1996,92:865-872)已表明，黄瓜霜霉病的抗性遗传机理复杂。常规育种实践中，对于抗霜霉病材料的选择是十分困难的一方面选育周期长；另一方面霜霉病的发生受到很多因素的综合影响，例如温度、湿度和病菌小种等，鉴定抗性材料的过程不容易控制。这些都导致黄瓜霜霉病育种进展缓慢的重要原因。
发明内容本发明的一个目的是针对现有技术的现状，提供一种黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法。使其在黄瓜抗霜霉病育种中应用，用以界定与S94的霜霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记，通过检测这些分子标记可以预测黄瓜植株的霜霉病抗性，加快抗霜霉病黄瓜的选择进度，在生产上用于检测黄瓜品种的霜霉病抗性水平。本发明是通过以下技术方案实现的本发明所涉及的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，包括以下步骤a)得到黄瓜霜霉病抗病品种S94(早)和黄瓜霜霉病感病品种S06("和杂交，得到杂种F"b)由杂种R自花授粉获得F2子代，通过子代单粒传(SSD)方法获得&代的重组自交系；c)对重组自交系每个株系进行分子标记分析，并对重组自交系每个株系的基因型进行描述；具体方法分离重组自交系每个株系的基因组DNA，采用相关序列扩增多态性(SRAP)、微卫星(SSR)、序列特异性扩增区(SCAR)和序列标签位点(STS)分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(SCAR、STS)和6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶(SRAP、SSR)上电泳分离后，获得分子标记资料；d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记资料构建遗传连锁图；e)测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性；f)将重组自交系每个家系的霜霉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL分析采用WinCartQTL2.1进行，先进行Kruskal-Wallis(K-W)测验，P<0.005表明该标记与霜霉病抗性连锁，可能存在QTL，然后对可能存在QTL的区间进行复合区间作图，以2.5为L0D阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点，从而确定与抗源S94霜霉病抗性主效QTL的分子标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97。所述的黄瓜抗霜霉病品系S94是从中国北方长春密刺的后代变异株系从选择。用黄瓜叶片分离的丽A，采用引物GACTGCGTACCAATTCTA和GATGAGTCTAGAACGGCT;CgACAATCACgggAgAgTTT和TTgTTgCATCAAACTAACACAATC;CgACAATCACgggAgAgTTT和CATATTAgACCCATATTTgTTgCAT;进行PCR扩增，扩增产在在1.5%琼脂糖凝胶和6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得分子标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97的扩增产物；大小分别为350bp、425bp和510bp。所述的琼脂糖凝胶，是指100mlTAE溶液中含有1.5克琼脂糖。所述的聚丙烯酰胺凝胶，是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺。本发明所涉及的应用黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记的方法，将分子标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97作为辅助选择标记在S94及其衍生品系为抗源的黄瓜霜霉病育种中，通过其基因型来判断其衍生品种或品系是否具有霜霉病抗性，包括以下步骤a)将通过S94及其衍生品系为父本或母本与其他黄瓜杂交并繁衍至R代以上；b)分离单个黄瓜植株的基因组DNA，检测每个黄瓜植株是否存在与霜霉病主效QTL相连锁的分子标记；如有2个以上分子标记同时出现，则预测该黄瓜的霜霉病的达到抗性的水平。所述的S94及其衍生品系，是指以S94为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的黄瓜品种或品系。本发明黄瓜抗霜霉病主效QTL分子标记及其黄瓜抗霜霉病育种中的应用，优点在于克服常规育种中黄瓜霜霉病抗性鉴定易受环境影响，育种周期长、效率低的不足，发挥分子标记辅助选择的特长，发展一种高效、快速的育种新技术。例如利用常规抗霜霉病育种方法选育一个新品种或新品系，往往要6-8年，甚至更长时间，同时每代都需要对群体进行抗性鉴定，工作量很大。此外，抗霜霉病鉴定又往往受环境条件的影响，而分子标记辅助选择不受环境条件的影响，在低世代就可以对霜霉病抗性进行选择，将大大减少育种家的工作量，提高选择的准确性和育种效率。本发明涉及的"黄瓜霜霉病抗病病菌"、"黄瓜霜霉病感病病菌"的孢子悬液由上海交通大学农业与生物学院潘俊松博士提供，相关文献发表在期刊《自然科学进展》，2008年第5期，11-17页。图lS9霜霉病抗性QTL连锁群定位分析位置图。其中包含QTL的连锁群区段被显示，左侧为标记之间的距离(cM);右侧为标记名称。具体实施方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1:黄瓜霜霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记方法(1)采用S94与黄瓜感霜霉病品种S06杂交产生R杂种。(2)Fi自交产生F2，R的252个单株随即选取一粒种子种植，采用单粒传的方法，繁殖到F7代，产生224个家系。(3)选取在两个亲本间具有扩增多态性的SRAP、SSR、SCAR和STS引物组合，对224个家系根据已有方法(王刚，中国科学C生命科学2004，34(6):510516;SakataY,TheorApplGenet(应用遗传理论)，2006，112:243250)进行分析，分离每个重组自交系黄瓜叶片的DNA，采用相关序列扩增多态性(SRAP)、微卫星(SSR)、序列特异性扩增区(SCAR)和序列标签位点(STS)分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在1.5y。琼脂糖凝胶(SCAR、STS)和6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶(SRAP、SSR)上电泳分离后，获得分子标记多态性数据。(4)基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建黄瓜遗传连锁图；，将获得的多态性数据采用软件MAP區KER/EXP3.0，设定L0D》3.0，使用Kosambi函数构建S06的遗传连锁图谱。(5)霜霉病抗性接种鉴定分别在2006年秋天和2007年春天温室进行，分别于2006年秋季和2007年春季，家系种植采用完全随机区组3次重复实验设计，每重复8株；亲本和Ft各种植30株做为对照。采用穴盘种植(d=12cm)，基质成分为1份泥炭+1份煤渣+2份蛭石。当幼苗长至2叶一心时(约播种后20d)，对植株真叶人工喷雾接种由上海交通大学农业与生物学院潘俊松博士提供的病菌孢子悬液，孢子悬液浓度在5X104个/毫升。温室中白天温度25-32°C，夜晚温度16-2(TC，日照时间17h左右，接种后24h内，用加湿器喷雾保持相对湿度在90%左右。接种12d后开始调査发病情况，病情分级标准为0级无病症；1级出现轻微病斑，其直径小于0.5Cm;2级病斑直径0.51CHI;3级黄化面积占叶面积的1/3以下；4级坏死斑面积占叶面积的1/32/3;5级坏死斑面积占叶面积的2/3以上。根据病情分级结果，再计算出每个家系的病情指数(DI)后，用于QTL分析，具体公式如下E(病叶数X代表数值)病情指数(DI)=----------------------------------X100调查总叶数X发病最重级代表数值家系三次重复的DI的平均值用于统计分析和QTL定位。(6)综合遗传图谱数据和抗性鉴定资料，QTL分析采用WinCartQTL2.5进行，利用复合区间作图(CompositeIntervalMapping,CIM)分析，以2.5为L0D阀值，大于2.5说明存在一个QTL位点。以2006秋、2007春和两年平均值霜霉病抗病数据为基础，复合区间作图(CompositeIntervalMapping,CIM)分析发现在连锁群1上分别在标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97之间存在一个抗霜霉病QTL位点，其L0D值分别为11.7、8.1和12.3，分别解释遗传变易为36.4%、27.3%和35.9%(见附表1、附图1)。E23ml8d、CMBR40和CMBR97标记与S94的主效霜霉病抗性QTL相连锁，可用于以S94为霜霉病抗源的品种和品系的霜霉病抗性预测。表1S94/S06抗霜霉病主效QTL分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2:与S94抗霜霉病主效QTL相连锁的分子标记在高代遗传群体中的验证利用筛选到的与S94霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记对育种高代材料进行初步检测，以检测该方法在黄瓜霜霉病抗性分子标记辅助选择中的实用价值。在S94与S06杂交的Fs代后代的部分植株进行了霜霉病抗性预测，先从它们的叶片中分离DNA，然后利用标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，并通过评判图谱来确定是否存在相应的标记，存在2个以上标记，说明该品种或品系对霜霉病具有抗病性，不存在则说明对于霜霉病是感病的。然后基于这些判断准则对每个黄瓜植株的霜霉病抗性进行预测。随后利用接种霜霉病病原菌的方法测定受测样品的霜霉病实际抗性并与预测结果进行对比。结果见附表2，预测结果与实测结果吻合度达到100%。附表2用与S06主效QTL连锁分子标记预测S06/S94的杂交后代(F8)的霜霉病抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中+表示有标记(E23ml8d、CMBR40和CMBR97)的扩增条带；-表示无标记(E23ml8d、CMBR40和CMBR97)的扩增条带。权利要求1、一种黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，是通过以下步骤获得a)得到黄瓜霜霉病抗病品种S94(♀)和黄瓜霜霉病感病品种S06(♂)和杂交，得到杂种F1；b)由杂种F1自花授粉获得F2子代，通过子代单粒传方法获得F7代的重组自交系；c)对重组自交系每个株系进行分子标记分析，并对重组自交系每个株系的基因型进行描述；具体方法分离重组自交系每个株系的基因组DNA，采用相关序列扩增多态性、微卫星、序列特异性扩增区和序列标签位点分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶和6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记资料；d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记资料构建遗传连锁图；e)测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性；f)将重组自交系每个家系的霜霉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL分析采用WinCartQTL2.1进行，先进行测验，P＜0.005表明该标记与霜霉病抗性连锁，可能存在QTL，然后对可能存在QTL的区间进行复合区间作图，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点，从而确定与抗源S94霜霉病抗性主效QTL的分子标记E23m18d、CMBR40和CMBR97。2、根据权利要求1所述的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，其特征是，所述的黄瓜抗霜霉病品系S94是从中国北方长春密刺的后代变异株系从选择。3、根据权利要求1所述的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，其特征是，用黄瓜叶片分离的DNA，采用引物GACTGCGTACCMTTCTA和GATGAGTCTAGAACGGCT;CgACAATCACgggAgAgTTT和TTgTTgCATCAAACTAACACAATC;CgACAATCACgggAgAgTTT和CATATTAgACCCATATTTgTTgCAT;进行PCR扩增，扩增产在在1.5%琼脂糖凝胶和6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得分子标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97的扩增产物；大小分别为350bp、425bp和510bp。4、根据权利要求3所述的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，其特征是，所述的琼脂糖凝胶，是指100mlTAE溶液中含有1.5克琼脂糖。5、根据权利要求3所述的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，其特征是，所述的聚丙烯酰胺凝胶，是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺。6、—种应用如权利要求1所述的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁分子标记的方法，其特征在于a)将通过S94及其衍生品系为父本或母本与其他黄瓜杂交并繁衍至F2代以上；b)分离单个黄瓜植株的基因组DNA，检测每个黄瓜植株是否存在与霜霉病主效QTL相连锁的分子标记；如有2个以上分子标记同时出现，则预测该黄瓜的霜霉病的达到抗性的水平。7、根据权利要求6所述的应用黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁分子标记的方法的应用方法，其特征是，所述的S94及其衍生品系，是指以S94为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的黄瓜品种或品系。8、根据权利要求6或7所述的应用黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁分子标记的方法的应用方法，其特征是，所述的S94及其衍生品系，将分子标记E23ml8d、CMBR40和CMBR97作为辅助选择标记在S94及其衍生品系为抗源的黄瓜霜霉病育种中，通过其基因型来判断其衍生品种或品系是否具有霜霉病抗性。全文摘要本发明涉及的是一种分子生物
技术领域：
的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法和应用方法。其分子标记方法由杂种F₁自花授粉获得F₂子代，通过子代单粒传获得F₇代的重组自交系；对重组自交系每个株系的基因型进行描述；用获得的分子标记资料构建遗传连锁图；测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性；对可能存在QTL的区间进行复合区间作图。其应用方法将通过S94及其衍生品系为父本或母本与其他黄瓜杂交并繁衍至F₂代以上；分离单个黄瓜植株的基因组DNA，检测每个黄瓜植株是否存在与霜霉病主效QTL相连锁的分子标记。本发明发展一种高效、快速育种技术，利用常规抗霜霉病育种方法选育新品种，减少育种家的工作量，提高选择的准确性和育种效率。文档编号C12Q1/68GK101240343SQ200810034528公开日2008年8月13日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者何欢乐,刘龙洲,潘俊松,白智龙,润蔡申请人:上海交通大学