专利名称：：强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及低分子量多肽2(Lowmolecularmasspolypeptide-2，LMP2)的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及其与强直性脊柱炎的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术：
：强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏(VonBechterev)病或马-施二氏(Maritstrumpell)病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响骨盆的骶髂关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、X线显示两侧骶髂关节炎(sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯骶髂关节，并重点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎(AnkglosingSpondylitis，AS)。强直性脊柱炎有明显的种族性，在不同民族中发病率的差异很大。印第安人发病率最高，北美印第安人发病率为2.7%6.3%。其次为白种人，白种人中发病率为0.1%1.4%。黄种人低于白种人,我国约为0.3%。而黑人发病率最低，约为白人的l/4,在非洲仅为0.2%。强直性脊柱炎好发于20至40岁的成年人，尤其是2030岁的青年男性。强直性脊柱炎呈常染色体显性遗传,有明显的家族遗传倾向，遗传因素>90%。据调查，强直性脊柱炎病人亲属发病率比一般人高一倍左右，同胞复发风险比为82。90。/。以上的AS病人具有HLA-B27阳性,在正常人群中阳性率为8。/。；子女HLA-B27阳性占50。/。，发生强直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定论，HLA-B27作为独立的致病基因在AS的发病中起作用。因为在HLA-B27阳性个体中只有1。/。5X发展成为AS，提示还有其他基因参与AS的发病。近年来，单核苷酸多态性(SNP)和单倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的广泛运用，为在分子水平上研究强直性脊柱炎的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。SNP的存在与否以及等位基因频率存在人种及地域的差异，这就提示多基因疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或性状在不同的人群中可能是不同的遗传因素造成的。另外，不同人群中SNP及其单倍型的类型和频率存在的这种差异可能与不同人群对药物及环境因素的反应性不同密切相关。强直性脊柱炎作为一种遗传因素起较大作用的疾病，寻找其相关基因进而阐明强直性脊柱炎发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然己有许多关于各种基因多态性与强直性脊柱炎的研究，但没有证实LMP2基因与强直性脊柱炎相关性的报道，更没有证实本发明所述的LMP2基因SNP与强直性脊柱炎相关性的报道。综上所述，为了尽早诊断强直性脊柱炎，本领域迫切需要寻找强直性脊柱炎易感基因，并开发检测强直性脊柱炎的方法和试剂盒。
发明内容本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期诊断)强直性脊柱炎的方法及检测试剂盒。本发明的另一目的是提供一种新的治疗强直性脊柱炎的方法。在本发明的第一方面，提供了一种体外检测样品是否存在抗原肽转运蛋白1(LMP2)的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤(a)用LMP2基因特异性引物扩增样品的LMP2基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:1。在另一优选例中，所述的LMP2基因特异性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第424和451位。在另一优选例中，所述的样品来自女性个体(人)。在本发明的第二方面，提供了一种检测强直性脊柱炎的试剂盒，它包括特异性扩增LMP2基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQIDN0:l中第424和451位的扩增产物。在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂(a)与SEQIDN0:l中第424和451位的突变位点结合的探针；(b)识别SEQIDN0:l中第424和451位的突变位点限制性内切酶。在另一优选例中，所述的突变位点是以下的单核苷酸多态性424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:1。在另一优选例中，所述的LMP2基因特异性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。在本发明的第三方面，提供了一种对个体的强直性脊柱炎易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的LMP2基因或转录本，并与正常的LMP2基因或转录本相比较；其中，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。在另一优选例中，检测的是LMP2基因，并与正常LMP2的核苷酸序列比较差异或者所述的个体是女性。在另一优选例中，所述的差异是424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:1。在另一优选例中，所述的个体是人，尤其是女性。具体实施例方式本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了LMP2的基因组序列与女性个体的强直性脊柱炎密切相关，其中关联研究结果显示，在LMP2的SEQIDN0:1中第424位的SNP(424位A—C)(记为rsl351383)和SEQIDNO:1中第451位的SNP(451位C—G)(记为rsl351382)所组成的单倍型(CG)，在女性对照组和病例组中的分布存在显著性差异(代0.05)，因此可作为辅助性检测强直性脊柱炎(或其易感性)的一个辅助指标。在此基础上完成了本发明。在本发明中，个体指女性人。LMP2基因低分子量多肽2(lowmolecularmasspolyp印tide-2，LMP2)的序列是已知，其详细序列和一些相关信息可参见网址http:〃www.ncbLnlm.nih.gov/Genebank/;http:〃而.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。为了方便起见，在SEQIDNO:1给出LMP2中与本发明SNP相关的核苷酸序列。LMP2基因位于6P2L3，大小为5.7K，其编码的产物属于T1B家族(蛋白酶体B型家族)，是一种20s的核心e-亚单位。该基因受Y-干扰素诱导表达，其产物释放免疫蛋白酶体中的催化亚单位-1(蛋白酶体e6亚基)。蛋白酶体是一种存在于胞质和胞核内的蛋白水解酶复合物，负责降解细胞内大部分蛋白质，在MHCI类分子包括HLA-B27分子的表达及相关抗原呈递过程中起关键作用。MHCI类分子呈递的抗原均来源于蛋白酶体的降解产物。蛋白酶体的功能受其结构组成的调控，其核心部分是由a和P亚单位组成的四环状圆柱形结构，与PA28结合后成为免疫蛋白酶体。LMP2、LMP7及MECL1(multicatalyticendop印tidasecomplex-like1，多催化内肽酶样复合物-l)是P环中最重要的具有蛋白水解活性的亚单位，均能被IFN-Y诱导表达，改变降解蛋白质的速度及切割位点，更有利于内源性蛋白质的降解和抗原的呈递。LMP2基因的多态性影响着免疫蛋白酶体的功能状态，引起降解内源性蛋白质产生的抗原肽的数量和性质发生改变，其中可能包括能诱导AS发生的特异性抗原肽。除与肿瘤的发生发展相关以外，国内外均有研究发现LMP2基因与B27阳性AS病人及其AAU(acuteanterioruveitis,急性前葡萄膜炎)的发生有关。具体而言，本发明揭示了LMP2基因内含子l的Snprsl351383C和rsl351382G组成的单倍型具有显著的统计学效应，换言之，单倍型(AC)到单倍型(CG)的改变，增加了女性AS的易感性，与AS显著相关。LMP2蛋白的多聚核苷酸可用于LMP2蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，LMP2蛋白的多聚核苷酸可用于检测LMP2蛋白的表达与否或在疾病状态下LMP2蛋白的异常表达。如LMP2DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断LMP2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用LMP2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测LMP2蛋白的转录产物。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。LMP2蛋白突变的形式包括与正常野生型LMP2DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用LMP2基因特异性引物扩增样品的LMP2基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性-424位A—C和451位C—G，其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:1。应理解，在本发明首次揭示了LMP2基因的SNP与强直性脊柱炎的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在424位A—C和451位C—G。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5'端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQIDN0:2和3的序列。虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQIDN0:l中第424位和451位。由于本发明的SNP与强直性脊柱炎具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期辅助性诊断强直性脊柱炎，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。当然，最终还应当用常规检测方法进行确诊。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l1.1研究对象8病例样本全部采集自门诊病人，患者的诊断由仁济医院富有临床经验的风湿病科医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本选自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无关节炎病史的个体。在知情同意的基础上随机收集了40个女性病人和95个女性正常对照个体的外周血样本。1.2实验方法和结果1.2.1DNA提取用常规酚氯仿法从人的外周血样本中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。1.2.2PCR及测序引物的设计根据GenBank中LMP2的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表l所示。表l引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.2.3LMP2基因的PCR扩增以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneA即9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为94'C预变性2分钟，94。C变性30秒，63"C退火40秒，72。C延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5。C;以后94。C变性30秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，共30个循环；最后72。C延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，分别获得LMP2的扩增产物。1.2.4SNP的发现和检测PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-3730DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedMosystems(ABI))进行测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http:〃droog.mbt.Washington,edu/Polyphred.html)进行序歹ij的判读、基因分型和SNP确认。结果，发现存在数个SNP，其中包括以下SNP:SEQIDN0:1中424位A—C(rsl351383)和451位C—G(RS1351382)。1.2.5SNP基因分型和关联分析用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在强直性脊柱炎病人和正常对照组中进行分型和关联分析。对基因分型结果进行描述性统计分析，列联表进行卡方检验。观察基因型在病人和对照之间是否具有差异。分析结果如下在女性样本中，在SEQIDN0:1中424位和451位上，对照和病例中(AA/CC、AC/CG、CC/GG)的分布分别为(87例、0例、8例)和(32例、1例、7例)，两者具有显著性差异，卡方检验P=0.088。等位基因rsl351383C和rsl351382G所组成的单倍型(CG)在对照和病例中的频率分别为8.42%和18.75%，P=0.015。上述结果表明LMP2基因的SEQIDN0:1中第424位和451位的单倍型(AC)到单倍型(CG)的改变，增加了女性个体强直性脊柱炎的易感性，与AS显著相关。实施例2强直性脊柱炎易感性检测试剂盒如实施例l所述，SEQIDN0:1中第424位和451位的单倍型(AC)到单倍型(CG)的改变与强直性脊柱炎疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计LMP2基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。制备一试剂盒(100人次)，它含有名称击浓度有义引物SEQIDNO:2lOOpmol反义引物SEQIDNO:3lOOpmolPCR反应液含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液随机挑选100个女性个体构成的测试组，其中包括未知是否患强直性脊柱10炎的对象、己知患强直性脊柱炎病人和经检测无强直性脊柱炎的正常人。抽取测试组中待检测对象的外周血3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到limol/U,以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI3730DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出LMP2基因中424位A—C和451位C—G。检测结果对于LMP2基因存在424位A—C和451位C—G的女性对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患有强直性脊柱炎情况。检测结果表明，含"CG"单倍型的女性检测对象的强直性脊柱炎易感性比例明显高于正常人群(高出至少100%)。因此，这表明通过检测上述二个位点是否存在(AC)向(CG)的改变，可进行强直性脊柱炎的辅助性检测。实施例3强直性脊柱炎易感性辅助性检测重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了90个女性(检测前不知道是否有强直性脊柱炎症状)进行检测。制备一试剂盒(100人次)，它含有<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>抽取待检测对象的外周血3ml,使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到limol/il，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI3730DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。结果同样证实了，所有检测的在SEQIDNO:1的424位和451位为"CG"单倍型的女性检测对象的强直性脊柱炎易感性比例明显高于女性正常人群(高出至少一倍)。这表明通过检测上述二个位点是否存在(AC)向(CG)的改变，可在女性中进行强直性脊柱炎的辅助性检测。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海人类基因组研究中心<120〉强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂盒5<130>081328〈160〉3<170〉Patentlnversion3.4<210〉1〈211〉709<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>1tctgccctacacacgttagcgccgcgcgcaaagcagccccgcagcacccaggcgcctcct60ggcggcgccgcga鄉ggcggggctgtcggctgcgcgttgtgcgctgtcccaggttggaa120accagtgccccaggcggcgaggagagcggtgccttgcagggatgctgcgggcgggagcac180caaccggggacttaccccgggcgggagaagtccacaccggggtaatgggtctgggcttga240gggttggcagaggggtggaggagatgcagcggccaggggaccctggaagcgcgcgcggag300aagtgaatgcagagaccaacgggagcgcagggaggtcgcctgtagcagccagcgcttgca360etcccgcaatgagcatagagtatttcttttctgaggggggtcgtctagagtgtccgtgaag420ggaacaggcacgcgaggctggtggaaaaagcgggtgctttgactcttagctggaagcgtc480aacgggaagctactctaaagcgctttcgctttcactctggtcccggacagtgggggctgg540tta犯tcaagaaagggggttggggatggtgcaaag柳tg鄉aaatggtgccctgggtg600a3gtag33cagcscttggg3ga3gga犯t3tsggcacttattg3g肪ggeiccasctcatc660acacagacttttgataaacttgccactgggcaactcttagcccaagcac709<210〉2〈211>20〈212〉腿<213〉引物<400>2tctgccctacacacgttagc20〈210〉3<211〉20<212>鹏<213〉引物<400〉3gtgcttgggctaagagttgc20权利要求1.一种体外检测样品是否存在抗原肽转运蛋白1(LMP2)的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用LMP2基因特异性引物扩增样品的LMP2基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性424位A→C和451位C→G；其中，核苷酸位置编号基于SEQIDNO1。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LMP2基因特异性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQIDNO:1中第424和451位。4.一种检测强直性脊柱炎的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增LMP2基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第424和451位的扩增产物。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂(a)与SEQIDN0:l中第424和451位的突变位点结合的探针；(b)识别SEQIDN0:l中第424和451位的突变位点限制性内切酶。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变位点是以下的单核苷酸多态性424位A—C禾口451位C—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:1。7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的LMP2基因特异性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。8.—种对个体的强直性脊柱炎易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤检测该个体的LMP2基因或转录本，并与正常的LMP2基因或转录本相比较；其中，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是LMP2基因，并与正常LMP2的核苷酸序列比较差异或者所述的个体是女性。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:1。全文摘要本发明公开了一种检测强直性脊柱炎易感性的方法，它包括检测该个体的LMP2基因或转录本，并与正常的LMP2基因或转录本相比较；其中，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101525659SQ20081003422公开日2009年9月9日申请日期2008年3月5日优先权日2008年3月5日发明者牛振民,蓉雷,薇黄申请人:上海人类基因组研究中心