专利名称：水环境微生物修复剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于应用生物技术领域，涉及一种水环境微生物修复剂及其制备方法。
背景技术：
随着水产集约化养殖的出现，养殖密度大幅度的提高，导致水体中残饵和动 物排泄物增多，在这样的环境条件下，促使微生物大量繁殖(包括致病菌)、C0D、 氨氮含量上升、溶氧下降，养殖环境不断恶化，使得水产养殖业遭受巨大损失。 水质因子对养殖成败和产量的影响越来越引人注意。水质良好，病原菌少，养殖 的水生动物生长自然就好；而水质条件差，有毒物质积累，病原菌多且致病力强， 养殖的水生动物便容易受到侵害；同时，由于同类生物之间存在着竞生作用，当 向养殖水体中有选择地投入一定量的有利水质改良、能分解水中有机物和有害物 质而对养殖生物无害的微生物制剂或菌种后， 一种新的平衡关系得以建立，水质 得到了改善，病原菌的生长受到抑制，养殖生物就可以健康地生长发育。近几年微生物制剂在水产上已有所应用，但存在着很多问题，如一些是水环 境以外的微生物，这些微生物到了水体中不能适应水体环境，不能迅速成为水体 的优势菌群；另外， 一些微生物不能产生酶，只是单纯的吸收水体的小分子营养 物质，不能有效地降解残饵和粪便，效果比较慢。
发明内容
本发明的目的是针对上述微生态制剂在水产环境改良上存在的问题，提供一 种含生物酶的水环境微生物修复剂。本发明另一个目的是提供上述水环境微生物修复剂的制备方法。 本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种水环境微生物修复剂，该修复剂各组分微生物在微生物总质量中的质量百分比为枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌30%~40%，放线菌10 20%, 反硝化细菌10~20%，光合细菌10 20%。具体产品中所述各微生物组分之和为100%。所述的水环境微生物修复剂，每克或每ml该微生物修复剂中菌含量不低于 5.0X108CFU，蛋白酶活性不低于200U，淀粉酶含量不低于100U。所述的水环境微生物修复剂的制备方法，该方法是将各组分微生物分别培养 再按一定比例混合制成微生物修复剂。所述的水环境微生物修复剂的制备方法，包括下述步骤a. —级种子液的制备分别将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝 化产碱杆菌菌种接种到无菌的pH7.0 7.5的营养肉汤中，放线菌接种在灭菌的淀 粉液体培养基中，30~37°C， 150~200rpm,过夜培养；光合细菌在光合细菌液体 培养基中，30~37°C,光照培养4-7天，光照强度1000-2000Lx，获得各菌种的一 级种子液；b. 二级种子液发酵分别将步骤a所培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 反硝化产碱杆菌、放线菌一级种子液按发酵罐体积10~15%的接种量接入发酵罐， 培养基同步骤a所用，30~37°C， 150 200rpm,通入经0.45jam滤膜过滤的过滤空 气，通气量为发酵罐体积0.5-l倍/min，压力0.1 lMPa,发酵12 18小时；c. 生产液发酵分别将二级种子液打入发酵罐中，培养基同步骤a所用，接 种量为发酵罐体积的8-12。/。， 30~37°C， 150 200rpm，通入经0.45pm滤膜过滤的 过滤空气，通气量为发酵罐体积0.8-l倍/min，压力在0.5 1.0MPa，发酵24 36小 时；光合细菌直接将一级种子液接种到透明的装有光合细菌液体培养基的发酵罐 中，接种量为发酵罐体积的8-12%， 30~37°C，光照培养4-7天，光照强度 画-2000Lx;d. 单独发酵完成后将发酵液装入贮液罐，按照各组分微生物在微生物总质 量中的质量百分比取枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌30%~40%，放线菌 10 20%，反硝化细菌10~20%，光合细菌10~20%混合制成液体微生物修复剂； 或者将单独发酵的发酵液通过离心或者加载体吸附，形成固体，按照各组分微生 物在微生物总质量中的质量百分比取枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌 30%~40%,放线菌10~20%，反硝化细菌10~20%,光合细菌10 20%混合制成固 体微生物修复剂。所述的水环境微生物修复剂的制备方法，步骤d中液体微生物修复剂的菌含 量不低于5.0Xl()SCFU/ml，蛋白酶活性不低于200U/ml，淀粉酶含量不低于 100U/ml;固体微生物修复剂的菌含量不低于5.0X10SCFU/g，蛋白酶活性不低于 200U/g，淀粉酶含量不低于100U/g。本发明有益效果采用本发明获得的微生物水环境修复剂与传统为生物水质改良剂相比有以下优点1) 所使用的微生物能够产生生物活性的酶 通过现代微生物分离技术、分子生物学技术和酶工程技术筛选能够产生蛋白酶、淀粉酶的菌株作为水环境微生物修复剂的目的菌，这些菌能够产生大量的蛋白酶、淀粉酶，蛋白酶的含量不低于200U/g或者200U/ml，淀粉酶不低于100U/g 或者100U/ml。这些酶能够有效地将水中的残饵以及粪便中没有被动物消化的蛋 白质、淀粉降解成可利用的小分子物质，加速残饵、粪便的降解。2) 所使用的微生物以水环境原籍菌为主微生物像所有生物一样有一定的环境适应性，传统的水质改良剂所用的微生 物大多数是陆生的，到达水体不能适应水环境，因此不能很快繁殖，形成优势菌 群，而原籍菌是从水环境中分离的，对水环境适应性强，人工投入以后能迅速形 成优势菌群。3) 所使用的微生物还能产生抗生素样物质所选用的微生物如芽孢杆菌、放线菌能产生抗生素样物质，对致病菌有抑制 作用，从而有效地防止水生动物疾病的发生，为生产绿色安全的水产品保驾护航。 本发明所选用的菌株特性及功能如下1) 枯草芽孢杆菌，能产生蛋白酶、淀粉酶以及枯草杆菌素，2) 地衣芽孢杆菌，能产生蛋白酶、杆菌肽等，3) 放线菌，能长生抗生素样物质，4) 反硝化产碱杆菌，能有效降解水体中的亚硝酸盐，5) 光合细菌，能有效降解水体中的氨氮、硫化氢等有害物质。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。一、 活化培养基1、 营养肉汤琼脂培养基每升培养基中含蛋白胨10g,牛肉浸膏3.0g,氯化钠5.0g，琼脂20g, pH7.0~7.5。灭菌。2、 淀粉琼脂培养基每升培养基含可溶性淀粉20克，硝酸钾1.0g，氯化钠 0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g， pH7.2。灭菌。3、 光合细菌固体培养基每升培养基含硫酸铵lg,七水硫酸镁0.2g，碳酸 氢钠5g，磷酸氢二钾0.5g，蛋白胨2g，琼脂20g， pH7.5。灭菌。二、 液体培养基配方同活化培养基，但不含琼脂。1、 营养肉汤培养基每升培养基中含蛋白胨10g，牛肉浸膏3.0g,氯化钠5.0 g， pH7.0~7.5。灭菌。2、 淀粉培养基每升培养基含可溶性淀粉20克，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g， 磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g， pH7.2。灭菌。3、 光合细菌培养基每升培养基含硫酸铵lg，七水硫酸镁0.2g，碳酸氢钠 5g，磷酸氢二钾0.5g，蛋白胨2g， pH7.5。灭菌。将冻干或4'C保存的菌种进行斜面活化，将保存的原始芽孢杆菌类细菌、反 硝化产碱杆菌菌种接种到无菌的pH7.0 7.5左右的营养肉汤琼脂平板上，放线菌 接种在灭菌的可溶性淀粉琼脂培养基中；光合细菌在光合细菌固体培养基中， 30~37°C，光照培养4 7天。实施例l1) 将冻干菌种或4'C保存的菌种进行斜面活化。分别将枯草芽孢杆菌 CGMCC 1.504，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，反硝化产碱杆菌CGMCC1.768接种 至营养肉汤琼脂培养基进行斜面活化；放线菌CGMCC4.1040接种至淀粉琼脂培 养基进行斜面活化；光合细菌CGMCC4.1187接种至光合细菌固体培养基进行斜面活化。2) —级种子液的制备从活化的琼脂平板上挑取典型菌落，分别将枯草芽 孢杆菌CGMCC 1.504，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，反硝化产碱杆菌 CGMCC1.768接种到无菌的pH7.0的营养肉汤中，放线菌CGMCC4.1040接种在灭 菌的淀粉液体培养基中，35°C， 150rpm，过夜培养；光合细菌CGMCC4.1187接种到光合细菌液体培养基中，35'C，光照培养4天，光照强度1500Lx;获得各菌 种的一级种子液。3) 二级种子液发酵分别将步骤2)所培养的枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504, 地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，反硝化产碱杆菌CGMCC1.768、放线菌 CGMCC4.1040—级种子液按发酵罐体积10。/。的接种量接入100L发酵罐，培养基 步骤同l)所用，37°C， 150rpm，通入经0.45pm滤膜过滤的过滤空气，通气量为 发酵罐体积0.5-l倍/min，压力在0.1MPa，发酵12小时；4) 生产液发酵分别将二级种子液打入l吨发酵罐中，培养基同步骤2)所 用，接种量为发酵罐体积的10%， 37°C， 150rpm，通入经0.45pm滤膜过滤的过 滤空气，通气量为发酵罐体积0.8-l倍/min，压力在0.5 1.0MPa，发酵36小时。光 合细菌直接将一级种子液接种到透明的装有光合细菌液体培养基的容器中，接种 量为发酵罐体积的10%， 35°C，光照培养7天，光照强度2000Lx。5) 单独发酵完成后将发酵液装入贮液罐，按照各组分微生物在微生物总质 量中的质量百分比取枯草芽孢杆菌40%，地衣芽孢杆菌30%，放线菌10%，光合 细菌10%、反硝化产碱杆菌10%混合制成液体微生物修复剂。经测定，菌含量不 低于5.0Xl()8CFU/ml，蛋白酶活性不低于1000U/ml，淀粉酶含量不低于100U/ml。实施例2按下列步骤进行.1)将冻干菌种或4'C保存的菌种进行斜面活化。枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，反硝化产碱杆菌CGMCC1.768用营养肉汤琼 脂培养基进行斜面活化；放线菌CGMCC4.1040用淀粉琼脂培养基进行斜面活化； 光合细菌CGMCC4.1187用光合细菌固体培养基进行斜面活化。2) —级种子液的制备。从活化的琼脂平板上挑取典型菌落，分别将枯草芽 孢杆菌CGMCC 1.504，地衣芽孢杆菌CGMCC1.105，反硝化产碱杆菌 CGMCC 1.768接种到无菌的pH7.5的营养肉汤中，放线菌CGMCC4.1040接种在灭 菌的淀粉液体培养基中，37°C， 200rpm，过夜培养；光合细菌CGMCC4.1187接 种在光合细菌液体培养基中，37°C，光照培养7天，光照强度2000Lx;获得各菌 种的一级种子液。3) 二级种子液发酵。将步骤2)所培养的芽孢菌、放线菌、反硝化产碱杆菌 一级种子液按发酵罐体积15。/。的接种量接入100L发酵罐，培养基同步骤l)所用， 37°C， 200rpm，通入经0.45pm滤膜过滤的过滤空气，通气量为发酵罐体积0.5-l 倍/min，压力在0.8MPa，发酵16小时。4) 生产液发酵。将二级种子液打入l吨发酵罐中，培养基同2)，接种量10%， 37°C， 200rpm，通入经0.45)im滤膜过滤的过滤空气，通气量为发酵罐体积0.8-l 倍/min，压力在0.8MPa，发酵30小时。光合细菌直接将一级种子液接种到透明的 装有光合细菌液体培养基的容器中，37'C，光照培养7天，光照强度2000Lx。5) 将发酵液离心获得纯菌体，按照各组分微生物在微生物总质量中的质量 百分比取枯草芽孢杆菌30%，地衣芽孢杆菌30%，放线菌20%，光合细菌10%、 反硝化产碱杆菌10%的比例混合，以沸石粉作为载体制成固体微生物修复剂。经 测定，菌含量不低于5.0Xl()SCFU/g，蛋白酶活性不低于1000U/g，淀粉酶含量不 低于100U/g。实施例3采用本发明实施例制备的含生物酶的水环境微生物修复剂，按照400 500m1/ 亩或者400 500g/亩(每2个星期一次)，在水产养殖富营养化以及其他有机质污 染的池塘中使用，可有效降解池塘中残饵、粪便、动植物尸体以及氨氮、硫化氢、 亚硝酸盐等有害物质，有效净化水质，改善养殖水体环境，抑制病员细菌的生长， 为绿色水产品的生产保驾护航。1、材料与方法1.1试验材料中国对虾幼虾均购自健康养殖的养殖场，为同一批繁殖，规 格一致。微生物修复剂按上述方法制得。1.2试验方法试验开始前，在江苏某养殖场选择4个大小均为IO亩的虾塘。 整理、清塘，提前1周对4个塘进行生石灰消毒，然后放水培养饵料生物。其 中第1、 2为试验塘，第3、 4为对照塘，放养密度为7500尾/亩。试验塘从2007 年5月10日开始使用微生物制剂，每2星期用一次，每次使用量为400~500ml/ 亩(采用固体微生物修复剂使用量为400 500g/亩)。4个池塘养殖管理条件完全 一致，整个养殖过程不用其它任何药物。从幼虾下塘开始，每天上、下午测量4个池塘水体的pH值、溶氧量、水温、水色及投饵量，观察对虾的行为。每周下午3: oo测定一次水中的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢含量。水质理化指标采用南京特安科贸有限公司生产的MR220智 能型水质分析仪进行测定。试验从2007年5月10日到7月9日，共60d。2、 结果与分析2.1氨氮含量的比较对照组的氨氮稍高于试验组，整个试验期间试验组氨 氮的均值为0.52mg/L，而对照组为0.85mg/L，两组差异不显著(P>0.05)。对照 组的波动幅度较大(标准差为0.68)，而试验组的波动幅度相对较小(标准差为 0.35)，表明该微生态制剂可以使水中的氨氮维持在一个相对稳定的状态。2.2亚硝酸盐含量的比较试验组平均亚硝酸盐含量为0.03±0.01mg/L，明 显低于对照组0.07士0.01mg/L，差异极显著(PO.Ol)。说明该微生态制剂可极显著 降低水中亚硝酸盐的含量。2.3硫化氢含量的比较对照组的硫化氢含量高于试验组，且波动幅度较大。 整个过程中试验组硫化氢的平均含量为0.12±0.04mg/L ，而对照组为 0.23±0.08mg/L，差异显著(P0.05)。表明微生态制剂对降低水中的硫化氢起到显著作用。3、 结论从本研究实验结果可以看出，用这种方法所制得的含生物酶的微生物水环境 修复剂能明显降低水中的亚硝酸盐以及硫化氢等有害物质的含量，对氨氮有一定 的降低效果，但不明显。因此可以说该生物制剂能有效地改善词养池水水质，对 养殖水体微生态结构的稳定有利。
权利要求
1. 一种水环境微生物修复剂，其特征在于该修复剂各组分微生物在微生物总质量中的质量百分比为枯草芽孢杆菌30％～40％，地衣芽孢杆菌30％～40％，放线菌10～20％，反硝化细菌10～20％，光合细菌10～20％。
2、 根据权利要求l所述的水环境微生物修复剂，其特征在于每克或每ml该微 生物修复剂中菌含量不低于5.0X108CFU，蛋白酶活性不低于200U，淀粉酶含量 不低于100U。
3、 如权利要求1或2所述的水环境微生物修复剂的制备方法，其特征在于该 方法是将各组分微生物分别培养再按一定比例混合制成微生物修复剂。
4、 根据权利要求3所述的水环境微生物修复剂的制备方法，其特征在于它包 括下述步骤a. —级种子液的制备分别将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝 化产碱杆菌菌种接种到无菌的pH7.0 7.5的营养肉汤中，放线菌接种在灭菌的淀 粉液体培养基中，3(K37°C， 150 200rpm，过夜培养；光合细菌在光合细菌液体 培养基中，30~37°C，光照培养4-7天，光照强度1000-2000Lx;获得各菌种的一 级种子液；b. 二级种子液发酵分别将步骤a所培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 反硝化产碱杆菌、放线菌一级种子液按发酵罐体积10~15%的接种量接入发酵罐， 培养基同步骤a所用，30~37'C， 150 200rpm，通入经0.45pm滤膜过滤的过滤空 气，通气量为发酵罐体积0.5-l倍/min，压力0.1 lMPa，发酵12 18小时；c. 生产液发酵分别将二级种子液打入发酵罐中，培养基同步骤a所用，接 种量为发酵罐体积的8-12%， 30~37°C, 150 200rpm，通入经0.45pm滤膜过滤的 过滤空气，通气量为发酵罐体积0.8-l倍/min,压力在0.5 1.0MPa，发酵24 36小 时；光合细菌直接将一级种子液接种到透明的装有光合细菌液体培养基的发酵罐 中，接种量为发酵罐体积的8-12%， 30~37°C,光照培养4-7天，光照强度 1000-2000Lx;d. 单独发酵完成后将发酵液装入贮液罐，按照各组分微生物在微生物总质 量中的质量百分比取枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌30%~40%，放线菌 10~20%，反硝化细菌10~20%，光合细菌10~20%混合制成液体微生物修复剂；或者将单独发酵的发酵液通过离心或者加载体吸附，形成固体，按照各组分微生 物在微生物总质量中的质量百分比取枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌 30%~40%，放线菌10~20%，反硝化细菌10 20%,光合细菌10~20%混合制成固 体微生物修复剂。
5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤d中液体微生物修复剂 的菌含量不低于5.0Xl()8CFU/ml，蛋白酶活性不低于200U/ml，淀粉酶含量不低 于100U/ml;固体微生物修复剂的菌含量不低于5.0Xl()8CFU/g，蛋白酶活性不低 于200U/g，淀粉酶含量不低于100U/g。
全文摘要
本发明属于应用生物技术领域，涉及一种水环境微生物修复剂及其制备方法。该修复剂各组分微生物在微生物总质量中的质量百分比为枯草芽孢杆菌30％～40％，地衣芽孢杆菌30％～40％，放线菌10～20％，反硝化细菌10～20％，光合细菌10～20％。本发明的微生态制剂具有适应性强，投入水中能补充水体原籍菌，在水体中很快能形成优势菌群，并能产生高活性生物酶，加速残饵和动物粪便的分解，同时能产生抗生素样物质，以致有害菌的生长，减少疾病的发生，确保绿色水产品的生产。
文档编号C12N1/20GK101269884SQ20081002513
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月8日 优先权日2008年5月8日
发明者储卫华 申请人:储卫华;江苏星海动物药业科技有限公司