专利名称：：一种新的10个y染色体短串联重复序列位点及其分型方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸检测方法，涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，特别涉及一种新的IO个Y染色体STR基因位点及其分型方法。适用于法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面研究，同时也为遗传制图、基因分离、疾病连锁分析及法医学个体识别和亲权鉴定等领域的理论与应用研究提供基础数据。
背景技术：
：短串联重复序列(ShortTandemR印eat，STR)由26个碱基重复排列组成特异序列，STR是一类在人类基因组中分布广泛并且具有高度多态性的遗传标记。短串联重复序列在研究与应用中具有以下显著的优点片段长度小，易通过PCR扩增及电泳分型；分型检测灵敏度高、所需检材量少，尤其适合各种陈旧、降解检材的检测；PCR扩增结果稳定，产生的附加带及影子带少；分型方法简便、快速，重复性好等优点，是绘制人类遗传图、疾病基因连锁分析、遗传病诊断、个体识别及亲权鉴定等分析工作的重要工具。目前，STR是法医DNA分析中最常用的一类遗传标记。STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因位点的遗传多态性。STR等位基因片段可采用PCR技术扩增，其等位基因可用银染、荧光标记和放射自显影等技术分型。人类基因组中，平均每6-10kb就存在有一个STR基因位点，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因位点的丰富来源。Y染色体为男性所特有的染色体，在减数分裂的过程中不与X染色体发生重组交换，遗传物质由父亲毫无变化(除突变外)的传递给儿子，即具有单倍体父系遗传的特点。以往Y染色体仅被用在性别鉴定，直到二十世纪九十年代，才对Y染色体特有的STR序列及多态性进行了较深入的研究,人们对Y染色体遗传标记的遗传多态性和应用有了新的认识。研究Y染色体的两个主要原因在于其一，Y染色体遗传标记对混合DNA中男性成分的鉴定有独特的优势；其二，通过Y染色体遗传标记可以追溯父系袓先。由于Y染色体STR位点具有扩增片段短、等位基因多、分型方法简单和多态信息含量高的优点，有些Y-STR位点已被列入常规法医检验项目，用于个体识别和亲子鉴定。Y染色体STR的应用主要有以下几个方面(1)用于大量人群的个人识别，其中包括性侵犯案件中混合斑的DNA分析、走失人员的寻找以及亲子鉴定，特别适用于法医学实践中父方缺(如去世或失踪)情况下的亲权鉴定和强(轮)奸案中混合斑的个人认定，尤其对认定患无精症或少精症的犯罪嫌疑人更具有独到之处；(2)用于研究人类起源、进化、迁移及部族关系、作为家系研究的有机补充；(3)用于临床医学疾病关联分析，相关基因的定位和发病的分子遗传机理的阐明以及环境因子易感基因的检出等；(4)用于研究男性不育的遗传学原因；对异性别及非血缘的供、受者异基因骨髓移植进行植活诊断的监测。由于Y染色体遗传标记自身的遗传特点，要提高Y染色体的鉴别能力，就需要不断地增加新的Y染色体遗传标记，寻找更多的能应用于法医学等领域的Y染色体STR位点并进行群体遗传学研究，是本领域亟待解决的问题。STR的分型，目前最常用的是应用PCR扩增STR，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamidegelelectropHoresis，PAGE),根据片段的大小决定基因型并计算等位基因频率及遗传距离并构建系统发育树。对于PCR产物的检测可用自显影技术，PAGE结合银氣以及荧光标记序列仪自动分析系统等方法。Y染色体STR基因位点的研究在国内还处于初期，目前国际上科学家们对Y-STR的研究形成了一个新的高潮，尤其在法医遗传学方面，已发现200多Y染色体STR和SNP遗传标记，已有商品化试剂盒研制成功，并已在欧洲广泛应用。目前国际上Y-STR商品化检测试剂盒多由生物公司研制生产，试剂盒名称、生产厂家及所包括Y-STR基因位点信息如下(1)Y-PLEX12kit(ReliageneTechnologiesInc.,NewOrleans,LA):DYS19,DYS389I，DYS389II，DYS390,DYS391,DYS392,DYS393,DYS385a，b，DYS438,DYS439;(2)Y-PLEX6kit(ReliageneTechnologiesInc.,NewOrleans,LA):DYS19,DYS389II，DYS390,DYS391,DYS393,andDYS385;(3)Y-PLEX5kit(ReliageneTechnologiesInc.，NewOrleans,LA):DYS389I,DYS389II，DYS438,DYS439,DYS392;(4)PowerPlex吸YSystemkit((Promega，USA):DYS19,DYS389I,DYS389II,DYS390,DYS391,DYS392,DYS393,DYS385a，b，DYS437,DYS438andDYS439。(5)AmpFLSTRY-filerkit(AppliedBiosystems，FosterCity,CA，USA):DYS456,DYS389I,DYS390'DYS389II,DYS458,DYS19，DYS385a，b:DYS393，DYS391，DYS439'DYS635，DYS392'YGATAHA,DYS437,DYS438,DYS448)。但是，该类试剂盒在法医学应用实践中存在以下问题(1)商品化试剂盒仅包括了既定的Y-STR位点，采用这类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难；(2)这些Y-STR基因位点都是基于中国群体以外的群体(主要是白种人群体)资料而开发的，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较表三。表三名称类别加入量(质量百分比)萘磺酸钠减水剂0.5%聚磷酸钠分散剂0.04%娃统惯"W络合剂0.04%腐植酸钙稳定剂0.02%对所制得的水煤焦浆的质量指标进行检测，各质量指标如下:浆浓度63-68%(以质量计)；细度平均粒度50um:粘度600-lOOOmpa.s:稳定性在正常条件下，3个月不发生硬沉淀。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述新的10个Y-STR位点，除DYS392位点的核心重复序列是三核苷酸，DYS438位点的核心重复序列是五核苷酸外，其余位点的核心重复序列均是四核苷酸。其中，扩增片段最小的是DYS459位点，片段长度为140-152bp，扩增片段最大的位点是DYS38911，片段长度为359-383bp，所有位点片段长度均适宜PCR扩增。上述新的IO个Y染色体STR基因位点的分型方法，其特征在于，包括下列步骤1.采用PCR分别扩增10个Y染色体STR基因位点的DNA，并设计位点的上下游引物序列，将上下游引物稀释成100pM0L/L，作为母液，取出10"l稀释到5uMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20pL，含1X反应缓冲液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uM0L/LdNTP，DNA20200ng。2.PCR扩增参数为94"预变性3min，94"C变性lmin，根据位点的不同复性温度进行30秒、72。C延伸lmin，共计30个循环，最后72。C延伸15min;3.扩增产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用银染显色方法，结合等位基因分型标准物进行标准化分型。上述等位基因分型标准物的制备方法包括下列步骤1)将具有不同基因型的纯合子PCR产物分别与载体pGEM—T进行连接反应。2)连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a;3)涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，过夜培养；4)挑菌，大摇，提取质粒DNA，备用；5)以质粒DNA为模板，作PCR扩增，对各等位基因分型标准物进行鉴定；注意同时用25bpDNA标准参照物、测序样本及标准细胞株GM9947A作对照，以确定标准片段大小；6)确定片段大小后大量扩增，将不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型标准物。本发明所需仪器和设备简单，是一种简便、快速、灵敏、经济的可行方法，适合在基层单位普及，对于中国目前的情况可以得到良好的效果。本发明所述技术方法可填补国内没有实用化的Y-STR检测技术和方案的空白，并在中国多个民族的遗传多态性研究中获得了满意的结果。利用这种技术制备的Y染色体段串联重复序列分型试剂盒，可进行商业化生产并推广为国内各个实验室使用，该技术克服了使用国外试剂盒无法反映中国多民族遗传特点的缺陷，可应用于法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面，具有广泛的应用前景。特别适用于法医学实践中父方缺如(去世或失踪)情况下的亲权鉴定和强(轮)奸案中混合斑的个人认定，对患有无精症或少精症的犯罪嫌疑人的认定更具独到之处。具体实施方式本发明提供的10个新的Y染色体STR基因位点，分别为DYS459、DYS456、DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392;上述10个Y染色体STR基因位点采用PCR扩增样本DNA，扩增产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色技术，结合等位基因分型标准物进行标准化分型。1.引物序列DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392八个位点的引物序列设计参照Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，DYS456和DYS459两个位点的引物序列设计参考AlanJRedd等的报道，10个Y-STR基因位点上下游引物序列见表2。将5.00D的上下游引物稀释成100uMOL/L，作为母液；取出10u1稀释到5"M0L/L，作为工作液，备用。表2IO个Y-STR位点的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.PCR扩增PCR扩增体系推荐体积为20(iL，含IX反应缓冲液，1.5mM0L/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。使用PE9600扩增仪，PE9700扩增仪。目前各种方法提取的DNA模板，均适合Y染色体STR的扩增。PCR扩增参数为94"C预变性3min，94'C变性lmin，不同的复性温度进行30秒、72。C延伸lmin，共计30个循环，最后72。C延伸15min。相关参考文献中复性温度多为57°C，申请人在实践摸索中发现并证实了IO个Y-STR位点应选用不同的复性温度(见表3)。本实验PCR反应试剂均为国产试剂，结果均取得了满意的效果，为试剂的国产化进行了有益的探索。表310个Y-STR位点不同的复性温度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物A:玻璃板的处理1)电泳所用长板42.0x30.5cm;短板39.0x30.5cm;2)戴好乳胶手套，将清洗干净的长板放置在水平台上，用一水平仪将水平台调水平。将0.03ml亲水剂倒在玻璃板中央，取适量脱脂棉球，将整块玻璃板涂匀，在两边放好夹条(spacer),放置备用。3)将短玻璃板放置在另一水平台上，取0.2ml配制好的疏水剂倒在玻璃板中央，用适量脱脂棉球，将整块玻璃板涂匀，然后将玻璃板放置一边晾干备用。B:聚丙烯酰胺凝胶的制备(6%)1)用100ml的小烧杯称取42克超纯的尿素，依次加入54ml的lx丁BE溶液、12ml40%丙烯酰胺和亚甲基双丙稀酰胺胶液(19:1)，放在磁力加热搅拌器上，56'c促进尿素完全溶解。2)尿素完全溶解冷却至室温后，加350|il的10%APS和35pl的TEMED，摇匀后开始灌胶。3)将胶液快速倒在长玻璃板上，短玻璃板置长玻璃板上水平推动胶液，使胶液流动充满两块玻板，避免j^^^m:灌好胶后，将鲨鱼齿梳反向插入胶板之间封口，注意封胶梳插入的深度(约6mm左右)。用六个燕尾夹将两块玻璃板一起固定住。灌好的胶室温聚合约2小时待用。C:预电泳、上样和电泳1)凝胶聚合后将梳子取出，用水冲洗胶板去除多余的凝胶碎片，用纯水将加样槽冲洗干净。将胶板加到电泳槽上，短板向里，向下压紧海绵垫，将四个螺旋钮扭紧固定住胶板，关闭上槽电极液排放开关。在上槽倒入适量电极液(lxTBE)没过短板，在下电泳槽中倒人适量电极液，将梳子用纯水冲洗干净插入加样槽中(梳子尖插入凝胶约12mm)，关闭上下电泳槽盖，接通电流，预电泳约l小时，使凝胶温度达到5(TC左右。2)将PCR管做好标记，每管加入3.(^1的2x加样缓冲液(2xloadingsolution),然后分别加入3.0^1扩增好的样品(包括待检样本和标准细胞株GM9947A)及等位基因分型标准物，混匀后放入PE9600型扩增仪中95°C变性10分钟，取出后立即放入冰浴中，准备上样。3)结束预电泳后，用5ml吸管吹打加样槽，去除气泡。然后取3.0|_il制备好的样品加到鲨鱼齿梳子中，加样过程应避免产生气泡并尽可能减少加样时间。4)样品加完后，立即接通电流，40W恒功率进行电泳。电泳时间根据不同扩增产物大小而定，大约2小时到4小时(具体电泳时间可参考染料移动的位置确定)。4、凝胶的银染及显色1)电泳结束后，取出胶板，将梳子取出，用适当的工具将两玻璃板分开，将粘有胶的长板放入水平摇床上的染色盘中。2)向染色盘中加入1000ml固定液(10%乙酸)，没过凝胶，室温摇动20分钟。将固定液倒出并回收，加入纯水，没过凝胶洗三次，每次2-5分钟。3)加人1000ml染色液，室温下避光摇动30分钟。将染色液倒出，加入纯水，10秒钟后将胶板取出，用纯水冲洗胶板的背面，倒掉纯水，将胶板重新放入染色盘中。4)加入1000ml显色液(预冷至41(TC)，用肉眼进行观察，直到电泳条带清晰后，倒去显色液，加入1000ml停显液(10%乙酸)，IO分钟后取出胶板，晾干，放在X光观片灯上观察并记录结果，用扫描仪将结果保存到计算机中。5.等位基因分型标准物的制备利用基因克隆(Clone)方法制备包括下列步骤1)将具有不同基因型的纯合子PCR产物分别与T-载体(pGEM—T)进行连接反应。2)连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a。3)涂布在氨苄青霉素琼脂平板(60ug/ml)上，过夜培养。4)挑菌，大摇，提取质粒DNA，备用。5)以质粒DNA为模板，作PCR扩增，对各等位基因分型标准物进行鉴定。注意同时用25bpDNA标准参照物、测序样本及标准细胞株GM9947A作对照，以确定标准片段大小。6)确定片段大小后大量扩增，将不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型标准物。本发明选用的10个Y-STR基因位点，采用PCR扩增样本DNA，扩增产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色技术，结合等位基因分型标准物进行标准化分型，所需仪器和设备简单，操作方便，适合在基层单位普及，对于中国目前的情况有良好的推广应用效果。本发明填补了国内没有实用化的Y-STR检测技术和方案的空白，申请人己应用该发明所述的10个Y-STR基因位点在中国多个民族遗传多态性研究中获得满意结果，利用这种技术制备的Y染色体短串联重复序列分型试剂盒，可进行商业化生产并推广，为国内各实验室及研究机构使用该技术提供标准化的技术和方案，同时克服了使用国外试剂盒无法反映中国多民族遗传特点的缺陷。权利要求1.一种新的10个Y染色体STR基因位点，其特征在于，该10个Y染色体STR基因位点分别为DYS459、DYS456、DYS460、DYS461、DYS462、DYS438、DYS439、DYS389I、DYS389II和DYS392；上述STR基因位点，除DYS392位点的核心重复序列是三核苷酸，DYS438位点的核心重复序列是五核苷酸外，其余位点的核心重复序列均是四核苷酸。其中，扩增片段最小的是DYS459位点，片段长度为140-152bp，扩增片段最大的位点是DYS389II，片段长度为359-383bp，所有位点片段长度均适宜PCR扩增。2.权利要求1所述的新的10个Y染色体STR基因位点的分型方法，其特征在于，包括下列步骤采用PCR分别扩增10个Y染色体STR基因位点的DNA，并设计位点的上下游引物序列，将上下游引物稀释成100uMOL/L，作为母液，取出lOyl稀释到5uM0L/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20pL，含1X反应缓冲液，1.5mM0L/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25uMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。PCR扩增参数为94"C预变性3min，94"C变性lmin，根据位点的不同复性温度进行30秒、72'C延伸lmin，共计30个循环，最后72。C延伸15min;扩增产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用银染显色方法，结合等位基因分型标准物进行标准化分型。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的等位基因分型标准物的制备包括下列步骤1)将具有不同基因型的纯合子PCR产物分别与载体pGEM—T进行连接反应。2)连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a;3)涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，过夜培养；4)挑菌，大摇，提取质粒DNA，备用；5)以质粒DNA为模板，作PCR扩增，对各等位基因分型标准物进行鉴定；注意同时用25bpDNA标准参照物、测序样本及标准细胞株GM9947A作对照，以确定标准片段大小；6)确定片段大小后大量扩增，将不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型标准物。全文摘要本发明公开了一种新的10个Y染色体STR基因位点及其分型方法，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，结合银染显色方法筛选出可应用于法医学等领域的10个Y染色体STR位点，并制备了各位点等位基因分型标准物(AllelicLadder)，对Y染色体STR位点的PCR引物和扩增条件进行了优化，其中对PCR引物和扩增条件的优化和等位基因分型标准物的制备，可以做到标准化和简单化并适合基层单位普及。可应用于法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面，具有广泛的应用前景。特别适用于法医学实践中父方缺失(如去世或失踪)情况下的亲权鉴定和强(轮)奸案中混合斑的个体认定，对患有无精症或少精症的犯罪嫌疑人的认定更具独到之处。文档编号C12N15/12GK101225386SQ200810017379公开日2008年7月23日申请日期2008年1月22日优先权日2008年1月22日发明者李生斌,丽杨,沈春梅,赖江华,骏马申请人:西安交通大学