专利名称：一种直接用于解析微生物群落结构的土壤dna提取方法
技术领域：
本发明属于微生物学与分子生物学技术领域，具体涉及一种直接用于解析微生物群落结 构的土壤DNA提取方法。
背景技术：
土壤生物修复系统运行的有效性是建立在微生物种群的多样性和功能性基础上，因此在 遗传水平上研究土壤微生物种群的多样性及其动态变化，可以为土壤生物修复系统中的微生 物群落结构和功能解析提供了强大的技术支持。这就要求对土壤中微生物基因组DNA进行 提取，并用于进一步的分子操作。但是由于土壤中含有的腐殖酸类物质和有机质等成分会造 成DNA产率降低，尤其是土壤中的腐殖酸类物质在提取过程中如果不能去除掉，将会直接 影响后续的PCR扩增、杂交、内切酶消化等。近年来，国内外学者采用不同的提取方法获取 土壤微生物DNA，认为提取土壤微生物DNA的关键因素是最大限度地保证DNA的破膜释 放，并且尽可能避免腐殖质的污染。但是从土壤中高效地提取DNA并有效避免腐殖质的污 染具有相当难度，常规方法获得的DNA由于受到腐殖质的污染很难满足进一步的分子操作。 而且常规方法获得的DNA产量偏低，同时所获DNA也不能反映原始土壤样品的物种丰度。
因此，需要研制适用于土壤微生物DNA提取的快捷、实用、有效的方法，解决使用常 规提取方法所获得的DNA样品存在杂质多、细胞裂解程度低及腐殖质污染等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法。其具体 方案为
(1) 称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入5 ml O.IM磷酸缓冲液(pH 9.5)， 旋涡振荡5min，在11000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液。按照上述方法 对分离出的土壤再洗涤2次。
(2) 向由步骤(l)得到的土壤中加入5ml裂解液后混匀。裂解液的组成为0.1-0.3M Tris-HCl， 0.05~0.15 M EDTA， 1.0~1.5 M NaCl， pH 8.0~8.5，十六烷基三甲胺
(0.5-1.5%)。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC条件下振荡 30 min后加入1 ml十二烷基硫酸钠溶液(100 g/L)，旋涡振荡5 min后在65'C条 件下水浴振荡lh，在11000r/min条件下离心10min，收集上清液得细胞裂解液。
(3) 向由步骤(2)得到的细胞裂解液中加入lml浓度为IOM的KSCN溶液(pH值 为6.0~6.5)，在35。C条件下水浴振荡15min，在11000 r/min条件下离心10 min，收集上清液。
(4) 将由步骤(3)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中， 在11000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所 有由步骤(3)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化。
(5) 向经步骤(4)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗涤液，洗涤液的组成为10ml 4 M NaAc与90 ml无水乙醇混合后调pH值至7.5。在11000 r/min条件下离心5 min,倒去离心管中的液体。重复这一过程1次，即向该离心纯化柱中再次加入 0.7 ml洗涤液，然后在11000r/min条件下离心5 min，倒去离心管中的液体。
(6) 向经步骤(5)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液，洗脱液的组成为10~15 mM Tris-HCl， 1.0~2.0 mM EDTA, pH 8.0。在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min 条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65'C水浴 中放置2min，在11000 r/min条件下离心5 min。离心管中液体即为土壤微生物 DNA溶液，在-2(TC保存备用。
所述步骤(2)中裂解液的组成优选为0.2MTris-HCl， 0.15MEDTA， l.OMNaCl， pH 8.0，十六垸基三甲胺(1.5%)。
所述步骤(6)中洗脱液的组成优选为12mMTris-HCl， l.OmMEDTA， pH8.0。 本发明的优点和积极效果提取方法操作简单，适用性强，提取的土壤微生物DNA的
OD26o/OD230及OD26o/OD28o值接近于标准值，可直接应用于分子操作，来解析土壤微生物群
落的结构。
具体实施例方式
下面结合实例进一步说明本发明。
材料
(1) 土壤样品，小玻璃珠；
(2) 磷酸，蛋白酶K，三羟基甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸，十二烷基硫酸钠，硫氰酸 钾，无水乙醇，醋酸钠，十六烷基三甲胺；
(3) 0.1M磷酸缓冲液(pH9.5);
(4) 裂解液l: O.lMTris-HCl， 0.05MEDTA， l.OMNaCl， pH 8.0，十六烷基三甲胺
(0.5%);
(5) 裂解液2: 0.2MTris-HCl， 0.1 M EDTA， 1.2MNaCl， pH 8.05，十六烷基三甲胺
(1.0%);
(6) 裂解液3: 0.3 MTris-HCl， 0.15MEDTA， 1.5MNaCl， pH8.5，十六烷基三甲(7) 浓度为100g/L十二烷基硫酸钠溶液；
(8) 浓度为10M的KSCN溶液(pH值为6.0);
(9) 洗涤液4MNaAc与无水乙醇按l:9的比例混合后调pH值至7.5;
(10) 洗脱液l: lOmMTris-HCl， l.OmMEDTA， pH 8.0;
(11) 洗脱液2: 15mMTris-HCl， 1.5mMEDTA， pH 8.0。
DNA纯度的检测方法用分光光度计测定OD26o/OD23。， OD260/OD28(^，与标准值比较。 实施例l
称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入pH值为9.5浓度为1M磷酸缓冲液5ml， 旋涡振荡5 min后在11000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液。重复洗涤2次，加入5 ml 裂解液1后混合均匀。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC条件下振荡30min 后加入浓度为100 的十二垸基硫酸钠溶液1 ml,旋涡振荡5 min后在65'C条件下水浴振 荡1 h，在11000 r/min条件下离心10 min，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入浓度 为10 M的KSCN溶液1 ml，在35。C条件下水浴振荡15 min，在11000 r/min条件下离心10 min, 收集上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后在11000r/min条件下离心10min， 倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所有的上清液都经过离心纯化柱纯化。向离心纯 化柱中加入0.7 ml洗涤液，在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。重复这 一过程一次，然后向离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液1，在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min条件下离心5 min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65'C水浴中放置 2 min，在11000 r/min条件下离心5 min。离心管中液体即为纯化的土壤微生物DNA溶液， 在-2(TC保存备用。
用分光光度计测定OD23o， OD加和OD280，结果表明OD260/OD230=1.94， OD260/OD280
=1.67，接近于标准值(注OD26o/OD230标准值为2.0， OD26o/OD280标准值为1.6)，可直接
应用于分子操作，来解析土壤微生物群落的结构。 实施例2
称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入pH值为9.5浓度为1M磷酸缓冲液5ml， 旋涡振荡5min后在11000r/min条件下离心10min,弃去上清液。重复洗涤2次，加入5 ml 裂解液2后混合均匀。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC条件下振荡30 min 后加入浓度为100 g/L的十二烷基硫酸钠溶液1 ml，旋涡振荡5 min后在65'C条件下水浴振 荡lh，在11000 r/min条件下离心10 min，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入浓度
为10 M的KSCN溶液1 ml，在35。C条件下水浴振荡15 min，在11000 r/min条件下离心10 min，收集上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后在11000r/min条件下离心10min， 倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所有的上清液都经过离心纯化柱纯化。向离心纯 化柱中加入0.7ml洗涤液，在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。重复这 一过程一次，然后向离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液2，在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65'C水浴中放置 2 min,在11000 r/min条件下离心5 min。离心管中液体即为纯化的土壤微生物DNA溶液， 在-2(TC保存备用。
用分光光度计测定OD230， OD26o和OD280，结果表明OD260/OD230=1.97， OD260/OD280 =1.62，接近于标准值，可直接应用于分子操作，来解析土壤微生物群落的结构。 实施例3
称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入pH值为9.5浓度为lM磷酸缓冲液5ml， 旋涡振荡5 min后在11000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液。重复洗涤2次，加入5 ml 裂解液3后混合均匀。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC条件下振荡30 min 后加入浓度为100 g/L的十二垸基硫酸钠溶液1 ml，旋涡振荡5 min后在65'C条件下水浴振 荡lh，在11000 r/min条件下离心10 tnin，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入浓度 为10 M的KSCN溶液1 ml，在35。C条件下水浴振荡15 min，在11000 r/min条件下离心10 min, 收集上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后在11000r/min条件下离心10min, 倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所有的上清液都经过离心纯化柱纯化。向离心纯 化柱中加入0.7ml洗涤液，在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。重复这 一过程一次，然后向离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液2，在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65。C水浴中放置 2min，在11000r/min条件下离心5min。离心管中液体即为纯化的土壤微生物DNA溶液， 在-20"C保存备用。
用分光光度计测定OD230， OD26o和OD280，结果表明OD260/OD23o=1.89， OD260/OD280 =1.71，接近于标准值，可直接应用于分子操作，来解析土壤微生物群落的结构。
权利要求
1.一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在于，该技术的具体步骤如下(1)称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入5ml 0.1M磷酸缓冲液(pH 9.5)，旋涡振荡5min，在11000r/min条件下离心10min，弃去上清液。按照上述方法对分离出的土壤再洗涤2次。(2)向由步骤(1)得到的土壤中加入5ml裂解液后混匀。裂解液的组成为0.1～0.3MTris-HCl，0.05～0.15M EDTA，1.0～1.5M NaCl，pH 8.0～8.5，十六烷基三甲胺(0.5～1.5％)。然后加入1.5mg蛋白酶K和4g小玻璃珠，在50℃条件下振荡30min后加入1ml十二烷基硫酸钠溶液(100g/L)，旋涡振荡5min后在65℃条件下水浴振荡1h，在11000r/min条件下离心10min，收集上清液得细胞裂解液。(3)向由步骤(2)得到的细胞裂解液中加入1ml浓度为10M的KSCN溶液(pH值为6.0～6.5)，在35℃条件下水浴振荡15min，在11000r/min条件下离心10min，收集上清液。(4)将由步骤(3)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在11000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所有由步骤(3)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化。(5)向经步骤(4)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗涤液，洗涤液的组成为10ml4M NaAc与90ml无水乙醇混合后调pH值至7.5。在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。重复这一过程1次，即向该离心纯化柱中再次加入0.7ml洗涤液，然后在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。(6)向经步骤(5)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液，洗脱液的组成为10～15mM Tris-HCl，1.0～2.0mM EDTA，pH 8.0。在65℃水浴中放置2min，在11000r/min条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65℃水浴中放置2min，在11000r/min条件下离心5min。离心管中液体即为土壤微生物DNA溶液，在-20℃保存备用。
2. 根据权利要求1所述直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在 于，所述步骤(2)中裂解液的组成优选为0.2 M Tris-HCl， 0.15MEDTA， l.OMNaCl， pH 8.0，十六烷基三甲胺(1.5%)。
3. 根据权利要求1所述直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在 于，所述步骤(6)中洗脱液的组成优选为12mMTris-HCl， l.OmMEDTA， pH 8.0。
全文摘要
本发明公开了属于微生物学与分子生物学技术领域的一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法。称取一定的土壤样品于离心管中，加入磷酸缓冲液，旋涡振荡后离心分离出洗涤后的土壤样品。向洗涤后的土壤样品中加入裂解液并混匀。然后加入蛋白酶K和小玻璃珠，振荡后加入十二烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在水浴中振荡1h，离心分离出上清液。向收集到的上清液中加入KSCN溶液，水浴振荡15mim后离心分离出上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后离心弃去液体。向离心纯化柱中加入洗涤液，离心弃去液体。然后向离心纯化柱中加入洗脱液，在水浴中放置2min，离心后收集离心管中液体即为纯化的土壤微生物DNA溶液，在-20℃保存备用。本发明具有提取方法操作简单，适用性强等特点，提取的土壤微生物DNA可直接应用于分子操作，来解析土壤微生物群落的结构。
文档编号C12Q1/68GK101514339SQ20081000722
公开日2009年8月26日 申请日期2008年2月20日 优先权日2008年2月20日
发明者丁爱中, 豆俊峰 申请人:北京师范大学