专利名称：检测核酸的系统和方法
技术领域：
本申请一般涉及检测生物分子的方法和系统，特别是涉及检测样品中核酸的方法 和系统。
背景技术：
核酸的扩增可以与多种测定联合进行。此类测定可以是定性的，例如当用于评估 生物样品时。然而，通过检测靶核酸的扩增，可改善多种生物学应用，而无需麻烦的印迹技 术或光学方法通常所需的昂贵且易损坏的设备因此，仍然需要改进检测样品中核酸的方法。发明概述根据第一实施方案，提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括通过将样品加热至第一温度，解链样品，其中样品包含与靶核酸的至少一部分杂交的引物；包含第一和第二区域的杂交探针，其中第一区域与靶核酸的至少一部分杂交，且 第二区域不与靶核酸杂交，且其中第二区域包含可检测的标记；和聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交 的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和可检测 标记的探针片段；和其中，第一温度高于引物和存在于样品中的双链核酸的Tm ；随后，通过将温度降至低于第一温度的第二温度，将样品退火，以便使引物和杂交 探针与样品中靶核酸的单链部分各自杂交；和随后，通过使聚合酶在第三温度下延伸与靶核酸杂交的引物，延长引物；使酶的核酸外切酶活性切割杂交探针，由此释放探针片段；任选地重复解链、退火和延长至少一次；将样品与固相支持体的表面接触，其中固相支持体的表面包含一个或多个与探针 片段第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；使捕获探针在第四温度下与存在于样品中的探针片段的至少一部分杂交，其中第 四温度低于第二和第三温度；以及检测固相支持体表面上的标记；其中杂交探针的至少一部分与杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且 其中，所述折叠结构的解链温度(Tm)低于第三温度但高于第四温度。根据第二实施方案，提供了检测样品中靶核酸的试剂盒，其包含
杂交探针，其包含与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和包含可检测标记的第 二区域，其中第二区域不与靶核酸杂交，且其中，当与靶核酸杂交时，核酸外切酶能够切割 杂交探针，由此产生包含第二区域和可检测标记的探针片段；固相支持体，其包含位于其表面上的捕获探针，其中所述捕获探针与探针片段的 第二区域杂交；任选地，引物，其与靶核酸的至少一部分杂交；以及任选地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针方向上延 伸杂交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和 可检测标记的探针片段；其中，所述杂交探针的至少一部分与该杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠 结构，且其中折叠结构的解链温度(Tm)低于完整的杂交探针与靶核酸杂交时所形成的双链 体的解链温度，且高于探针片段与捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。附图简要说明本领域技术人员能够理解下文所述的附图仅仅是出于示例的目的。所述附图并非 是用来以任何方式限制本文教义的范围。图IA是设计使用能形成折叠结构的杂交探针的测定的组成和步骤的示意图，其 中可将杂交探针可与靶序列杂交，杂交的探针的一部分经切割形成标记的探针片段，且其 中可在表面(如利用电极表面)上捕获和检测标记的探针片段。图IB是显示预测的Tm为61. 7°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解。图2是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图IB所示的核苷酸序列的杂 交探针在不同的时间和温度下经40个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) 循环后产生的。图3A是显示预测的Tm为43. 9°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解。图3B是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图3A所示的核苷酸序列的 杂交探针产生的。图4是显示预测的、为34. 2°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该杂交 探针与图3A所示的探针的差异在于从图3A所示的探针中移除了 6个3’核苷酸。图5A是显示由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图5B是显示由具有图4所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图6A是显示预测的Tm为53. 1°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该探 针与图3A所示的探针的预测的3’端6个碱基双链区域相比，具有预测的3’端9个碱基的 双链区域。图6B是显示由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图6C是显示由具有图6A所述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图7A是显示由具有下述核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图
GTTACTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO. 5)其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的19mer (链节)核苷酸序列。图7B是显示由具有下述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图CTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO. 6)其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的15mer核苷酸序列。图7C是显示由具有下述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图TCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO. 7)其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的13mer核苷酸序列。图8A是显示用于禽流感的杂交探针的预测折叠结构的图解，所述探针具有 44.0°C的预测的Tm。图8B是显示由具有图8A所示的核苷酸序列的禽流感DNA杂交探针产生的PCR后 电化学信号的柱状图。图9A是显示用于禽流感的第二杂交探针的预测折叠结构的图解，所述探针具有 45.3°C的预测的Tm。图9B是显示由具有图9A所示的核苷酸序列的第二禽流感DNA杂交探针产生的 PCR后电化学信号的柱状图。
图10是显示杂交探针的示意图，其中折叠结构是分子内三链体。图IlA和IlB是显示碱基配对结构的图解，所述碱基配对当具有质子化的胞嘧啶 (C+)核碱基的三链体形成时(图11A)以及当用假异胞嘧啶核碱基(pseudoisocytosine nucleobase，也称为J或J碱基)取代质子化的胞嘧啶核碱基时(图11B)发生。图12是密封的电化学室的示意图，其可用于测量温度的升高。各种实施方案的描述出于解释本说明书的目的，使用下列定义，且只要适当，以单数使用的术语也包括 复数，反之亦然。当下文阐述的任何定义与该词语在任何其他文献包括以参考方式并入本 文的任何文献中的用法矛盾时，出于理解本说明书和其相关的权利要求的目的，以下文阐 述的定义为准，除非明确规定了相反的含意(例如为了理解最初使用术语的文献)。除非另 有说明或者使用“和/或”明显不合适，本文中“或”意指“和/或”。除非另有说明或者使用 “一个或多个”明显不合适，本文中“a”意指一个或多个(one or more)。“包含(comprise) ”、 “包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(include) ”、“包括(includes) ”以及“包 括(including)”可交换使用，且并非意图限制。此外，如果一个或多个实施方案的描述使 用了术语“包含(comprising) ”，本领域的技术人员应该理解，在一些特定的情况下，可选择
使用术语“基本上由......组成”和/或“由......组成”来描述所述一个实施方案或多
个实施方案。如本文所用的，“捕获探针”指表面结合的(surface bound)核碱基多聚体。捕获 探针可以是核酸(如DNA或RNA)、核酸类似物(如锁核酸(locked nucleic acid, LNA))、 核酸模拟物(如肽核酸(peptide nucleic acid, PAN))或嵌合体。
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如本文所用的，“嵌合体”指包含两个或多个连接的亚单位的核碱基多聚体，所述 亚单位选自不同类别的亚单位。例如，PNA/DNA嵌合体可包含连接于至少一个2’ -脱氧核 糖核酸亚单位的至少一个PNA亚单位(对于有关PAN/DNA嵌合体制备的示例性方法和组合 物，参阅W096/40709)。嵌合体示例性的组成亚单位选自PNA亚单位、天然存在的氨基酸亚 单位、DNA亚单位、RNA亚单位、LNA亚单位和其他核酸类似物或模拟物的亚单位。如本文所用的，“翼(flap) ”指经设计可测定靶核酸的杂交探针中与该靶核酸不互 补的一部分。如本文所用的，“杂交探针”是核碱基多聚体，其可在该探针与互补链杂交的位点 受到酶的核酸外切酶活性的切割，所述杂交探针包含与样品中所关注的靶核酸的至少一部 分互补的核碱基序列。只要杂交探针通过核酸外切酶活性是可切割的，它可以是寡核苷酸、 寡核苷酸类似物或嵌合体。在某些实施方案中，核碱基多聚体可以是包含除了一个LNA亚 单位以外的所有DNA亚单位的嵌合体。在某些实施方案中，核碱基多聚体含有位于距离经 设计与靶核酸杂交的杂交探针的那部分的5’端(向3’端)一个亚单位处的单个LNA亚单 位。如本文所用的，“核碱基多聚体”指包含一系列包含亚单位的连接的核碱基。适宜 多聚体的非限制性实例包括寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸、肽核酸、核酸类似物、核酸模拟 物和嵌合体。如本文所用的，“肽核酸”或“PAN”指包含两个或多个PAN亚单位的任何聚核碱 基链(polynucleobase)或聚碱基链的区段，包括但不限于在下列美国专利中称为肽核酸 或作为肽核酸而请求保护的任何聚核碱基链或聚核碱基链的区段5，539，082,5, 527，675、 5，623，049、5，714，331、5，718，262、5，736，336、5，773，571、5，766，855、5，786，461、 5，837，459,5, 891，625,5, 972，610,5, 986，053,6, 107，470 和 6，357，163。为 了避免任何疑 义，PNA是核酸模拟物，而不是核酸或核酸类似物。因为PNA不是由核苷酸形成的，所以它 不是核酸。为了避免疑义，PNA寡聚体可以包括包含一个或多个连接于骨架的氨基酸侧链 的多聚体。如本文所用的，“支持体”或“固相支持体”或“固相载体”指任何固相材料。固相支 持体包含诸如“树脂”、“合成支持体”、“固相”、“表面”、“膜”和/或“支持体”的术语。固相支 持体可由有机多聚体如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy) 和聚丙烯酰胺以及它们的共聚物和接枝物(grafts)组成。固相支持体也可以是无机物，如 玻璃、硅石、可控孔度玻璃(controlled-pore-glas^CPG)或反相硅石。固相支持体的构型 可以是珠、球、微粒、颗粒、凝胶、膜或表面的形式。表面可以为平面、基本上平面或非平面。 固相支持体可以是多孔的或非多孔的，以及可以具膨胀或非膨胀特性。固相支持体可以以 孔(well)、凹陷(depression),^ (tube)、槽(channel)、圆柱体(cylinder)或其他的容器 (container)、器皿(vessel)、特征部件(feature)或区域(location)的形式成形。如本文所用的，“靶核酸”指所关注的核酸分子。样品可以包含多于一种的核酸分 子。PCR产物电化学检测的测定公开于恰好与本申请同一日提交的美国临时专利申请 第60/877，610号(Docket卷号70043. 0036USP1)中。该测定由具有例如15mer 5，翼的 杂交探针组成，所述15mer 5’翼与靶核酸不互补但与电极限制的捕获探针互补。这种5’翼包含电化学标记。在PCR过程中，包含该5’翼的探针片段由具有核酸外切酶活性的酶如 Taq聚合酶切割。探针片段随后与电极限制的捕获探针杂交，产生信号。发现完整的(即 未切割的)杂交探针不像探针片段一样有效地与捕获探针杂交。这种现象可在单容器测定 (one pot assay)中监控PCR，而无需从完整的杂交探针中分离探针片段。在本文所述测定中，完整的或未切割的杂交探针可形成折叠结构，该折叠结构的 解链温度(Tm)低于完整的杂交探针与靶核酸杂交时所形成的双链体的解链温度而高于探 针片段与捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。不期望限于任何理论，认为在探针 片段与捕获探针杂交的温度时的完整杂交探针的折叠结构基本上抑制了完整的杂交探针 与电极表面上的捕获探针的杂交，由此，改善了测定的信噪比。1.用包含5’翼的杂交探针进行的PCR测定图IA是设计测定的组成和步骤的示意图，该测定利用能形成折叠结构的杂交探 针，其中可将杂交探针与靶核酸杂交，且其中杂交的探针的一部分经切割形成可以在表面 (如电极表面)上被捕获和检测的标记的探针片段。考虑到此测定模式，设计和评估一组 具有多种预测的1值(如83.51、61.71、54.31或46°0的杂交探针。具有最高！^ = 83.5°C)的杂交探针对应于5’翼的15mer区域和探针的余部之间的完美匹配。其他的探针 包含导致较低Tm值的错误匹配。利用2006年7月17日提交的美国专利申请第11/488，439 号所述的切割的杂交探针和完整的杂交探针的HPLC分离，评估PCR过程中这些探针的切割 效率。用 7% ACN+93% TEAA 平衡来自 Waters 公司的 HPLC 柱 XTerroMSC 18(2. 5mmX 50mm)。 分三步进行梯度洗脱(0. 3ml/min，60C)步骤1 7% ACN+93% TEAA，7分钟(min)。步骤2 10% ACN+90% TEAA，10 分钟。步骤 3 35% ACN+65% TEAA，10 分钟。(ACN-乙腈；TEAA-0. IM 三乙醇胺-乙酸，PH 6.8)。用于折叠结构的具有Tm为61. 7°C的杂交探针表现出了 30%的 切割效率，其被选择用来进行PCR电化学检测。图IB图解预测的Tm为61. 7°C的杂交探针的预测的折叠结构。这种杂交探针依照 图IA所示的测定适合检测李斯特氏杆菌(Listeria)单细胞发生hlyA基因。图IB所示的 探针具有如下序列TAGGACTACCAGGGGTTTTCt GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA (SEQ ID NO. 1)其中，粗体所示的核碱基表示5’翼，▼符号表示预期核酸外切酶活性切割占优势的 位点。依照图IA所示的测定，利用这种包含5’锇电化学标签的杂交探针，进行李斯特氏 杆菌单细胞发生hlyA基因片段(即靶核酸)的PCR。PCR反应在95°C运行10分钟，随后在 补充了 6mM MgCl2 的 PCR 缓冲液 A (Applied Biosystems,目录号N808_0228)中进行 40 个 循环(95°C 15秒，63°C 1分钟)。引物和探针的浓度分别为200nM和400nM。这种杂交探针 具有与探针内部局部互补的19-mer的5 ’翼(参见图IB)。在PCR过程中，在退火-延伸温 度(即66°C )时，因为测定温度高于预测的折叠结构的Tm，所以杂交探针应该是基本上未 折叠的。这可使杂交探针与靶核酸杂交。一旦杂交，具有核酸外切酶活性的酶切割杂交的 杂交探针，由此在PCR反应过程中产生探针片段。PCR完成后，将样品的温度降低至41°C， 以使探针片段与捕获探针杂交。在这些条件下，仍然存在于样品中的任何完整的(即未切 割的)杂交探针形成了如图IB所示的预测的折叠结构，以致表面结合捕获探针基本上接触
9不到5’翼。这种测定的电化学测量结果显示于图2中。40个PCR循环后，将阳性(pos)反应混 合物和无模板对照(ntc)反应混合物置于夹于两个加热板之间的电化学池中。本实验中所 用的电化学池显示于图12中。如图12所示，这种池包括直径为2mm的工作电极(working electrode, WE)和计算器电极(counter electrode, CE)。金计算电极(CE)是通过在具 有Cr粘附层的硅石晶片上喷镀涂覆2000埃厚度的金层而制成的。参比电极(reference electrode)是0. 5mm直径的Ag/AgCl金属丝。如从图2所示的结果中所观察到的，完整杂 交探针杂交的效率比切割的探针片段低20-30倍。2.用包含相互作用的5’和3’翼的杂交探针进行的PCR测定具有可用于测定禽流感病毒RNA的互补的5’和3’翼的杂交探针具有如下序列CTTCGTTCGATTG TC▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTC AATCG (SEQ ID NO 2)其中以粗体显示的核碱基表示5’和3’翼Λ·符号表示预期核酸外切酶活性的切割
占优势的位点。这种探针的折叠结构的预测Tm为43. 9°C。图3A显示了这种杂交探针的预 测的折叠结构。使用这种杂交探针，进行PCR测定。在环境反应混合液(master mix)中进行 40个PCR循环(60°C下进行延伸和退火)后，将温度转变为28°C。环境反应混合液包括 IOOmM KClUOOmM Tris (pH 8)、8mM MgCl2UOOyM dntps 以及 0. 3 单位 / μ L 金牌酶(gold ampliTaq)。在此温度下，在杂交的杂交探针上通过核酸外切酶活性产生的探针片段，可与 表面结合捕获探针(Tm = 32°C)退火。在这些条件下，仍然存在于样品中的任何完整的(即 未切割的)杂交探针应该形成图3A所示的预测的折叠结构(Tm = 43. 9°C )，以使表面结合 捕获探针基本上接触不到5’翼。图3B是显示在图3A所示的杂交探针PCR后，在各种时间点产生于表面电极上的 电化学信号的柱状图。在存在10000拷贝的靶核酸和不存在靶核酸(无靶对照或NTC)的 两种情况下进行PCR。如图3B所示，电化学数据表明两种测定的杂交效率有约100倍的区 别。用另一个具有如下核碱基序列的探针重复这种测定CTTCGTTCGATTG TC▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO 3)其中粗体所示的核碱基表示5’翼，▼符号表示预期核酸外切酶活性的切割占优势 的位点。图4显示这种杂交探针的预测的折叠结构。这种折叠结构的Tm*34.2°C。对5mM MgCl2介质进行所有的Tm和mFold分析，所述媒介对应于环境反应混和液的离子强度。如与图4所示的杂交探针所进行的比较，利用图3A所示的杂交探针进行PCR测 定，以比较电化学测定的效率。图5A是显示用图3A所示的杂交探针进行的PCR测定的电 化学信号的柱状图。图5B是显示用图4所示的杂交探针进行的PCR测定的电化学信号的 柱状图。图5A所示的结果显示，与图4所示的杂技探针相比，图3A所示的杂交探针的辨别 力高2-3倍。3. 3’翼长度的影响为了阐明3’翼长度对折叠结构稳定性的影响，进行另外的实验。这些实验所用的 杂交探针包括图3所示的探针，所述探针具有长度为6个核碱基的3’翼和相似的探针，所
10述相似探针具有长度为9个核碱基的延长的3’翼。具有较长的9个核碱基的3’翼的杂交 探针的结构具有如下序列CTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT CAATCGAAC (SEQ ID NO 4)这种探针具有图6A所示的预测的折叠结构，且其预测的Tm为53. 1°C。上文粗体 所示的核碱基表示5’翼和3’翼，▼符号表示预期核酸外切酶活性切割占优势的位点。在这 种杂交探针中，邻近所示的切割位点的加下划线的C核碱基是LNA亚单位。杂交探针的所 有其他亚单位都是DNA。具有长度为9个核碱基的3’翼的探针具有约为53. 1°C的预测的解链温度，而具有 较短的6个核碱基的3’翼探针的预测的解链温度约为43. 9°C。进行图3A和图6A所示的 杂交探针的PCR测定后，电化学检测结果分别显示于图6B和图6C中。在金粉表面于32°C 下，进行PCR后杂交反应的电化学分析。由于3’翼长度的增加，具有长度为9个核碱基的 3’翼的探针具有预测的更稳定的结构(即更高的折叠Tm)，这显然产生了更好的辨别能力。4.5’翼长度的影响为了测定5’翼长度对测定性能的影响，进行另外的实验。对于这些实验而言，评 估针对禽流感病毒的具有19mer、15mer、13mer 5’翼的杂交探针。这些探针不包括3’翼。 所述探针具有如下核苷酸序列19-mer 5，翼GTTACTTCGTTCGATTG TC^ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO 5)15-mer 5'翼CTTCGTTCGATTG TC▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO 6)13-mer 5'翼 TCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO 7)在这些序列中，上文粗体所示的核碱基表示5’翼，▼符号表示预期核酸外切酶活
性切割占优势的位点。在这些杂交探针中，邻近所示的切割位点的加有下划线的C核碱基 是LNA亚单位。这些杂交探针的所有其他亚单位都是DNA。在使用每种具有19mer、15mer和13mer 5’翼的杂交探针进行PCR后，电化学检测 的结果分别显示于图7A、7B和7C中。对于19mer、15mer和13mer 5，翼，将PCR后混合物 在金电极上分别于4rC、35°C、31°C (即比每种预测的折叠结构的预测的TJS 8°C)下杂 交。从这些结果中可以观察到，具有13mer 5’翼的杂交探针比具有更长的15mer和19mer 5’翼的杂交探针表现处更好的测定性能。5.另外的禽流感PCR测定进行两个另外的禽流感PCR测定，这两个测定针对禽流感病毒血凝素基因的不同 区域。用导致折叠结构的预测Tm为约44-45°C的3’翼，设计两种杂交探针。这两者探针的 预测的折叠结构显示于图8A和图9A中。作为这些测定的靶核酸的模板是长度为约100个 碱基的合成的DNAs。在比探针片段/捕获探针杂交物的预测的TJS 10-14°C的温度下，利
11用环境反应混和液，在金电极上，进行PCR后杂交/检测。这些实验所用的第一杂交探针的核碱基序列为CATGCTACTCAACA C ▼ AGTTACCATATTCCAATTCACTTTTCATAATTGCT G GTTGAGTA(SEQ IDNO 8)对于折叠结构而言，这种杂交探针的预测的解链点(Tm)为44. 0°C。这种探针的预 测的折叠结构示于图8A中。与这种探针一起使用的捕获探针是具有下文所示结构的15mer 寡聚体GTGTTGAGTAGCATG(SEQ ID NO 9)这些实验所用的第二杂交探针的核碱基序列如下ACACGTGTACCTTA C ▼ TGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATGGTA CAC (SEQ ID NO 10)对于折叠结构而言，这种杂交探针的预测的解链点(折叠Tm)为45.2°C。这种探 针的预测的折叠结构示于图9A中。与这种杂交探针一起使用的捕获探针具有下文所示的 结构GTAAGGTACACGTGT(SEQ ID NO 11)对于这两种杂交探针而言，上文以粗体所示的核碱基表示5’和3’翼，▼符号表示 预期核酸外切酶活性的切割占优势的位点。在这些杂交探针中，加下划线的A(第一探针) 和加下划线的T(第二探针)核碱基，是LNA亚单位，其邻近所示的切割位点。这些杂交探 针的所有其他亚单位都是DNA。在本文所讨论的PCR测定中使用这些杂交探针和捕获探针。使用第一杂交探针的 禽流感DNA的PCR后电化学检测显示于图8B中。使用第二杂交探针的禽流感DNA的PCR 后电化学检测显示于图9B中。尽管上文中公开了采用茎环构象的杂交探针，但也可以使用折叠时采用其他构 型的杂交探针。此类结构包括发夹(hairpin)、内环(internalloop)、凸起(bulge)、分枝 (branched)、苜蓿叶形(cloverlfeaf)和伪节(pesudoknot)结构。可用于实施本文所公开 的方法和试剂盒的的其他折叠结构的实例，可见于美国专利第7，118，860B2号中。6.包含三链体结构的杂交探针在某些实施方案中，杂交探针可采用分子内三链体构象。可形成分子内三链体结 构的杂交探针的实例如下文所示TTJJT AGA TCCTT -[探针序列]-AAGGA (SEQ ID NO 12)在上述序列中，“J”表示假胞嘧啶核碱基，“探针序列”表示经设计使序列与靶核酸 特异性地杂交的探针的一部分。可以预见，这种通用构象的杂交探针可采用与图10所示的折叠结构相同的分子 内三链体构象，其中“一”表示Hoogsteen氢键，“ · ”沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pairs)，“环”包含探针中与靶核酸杂交的一部分(即“探针序列”)。这种类型的三 链体结构公开于 Petrovet al. , “ The Triplex-Hairpin Transition in Cytosine-Rich DNA(富含胞嘧啶的DNA中的三链发夹转换)“，Biophysical Journal, Vol. 87， 3954-3973 (December 2004)中。这些结构涉及T · *A—T和C · G—C+三链体的形成，其 中C+表示在N3位置质子化的胞嘧啶残基。参考图11和Egholm et al.，“ EfficientpH—independent sequence-specific DNA bindng bypseudoisocytosine-containing bis-PNA (通过含假异胞嘧啶的双PNA进行有效的非pH依赖性的序列特异性DNA结合)〃， Nucl. Acids Res.，Vol. 23，No. 2. 217-222(1995)，当需要质子化的胞嘧啶核碱基(C+)产生 三链体时，可用假异胞嘧啶来取代。以此方式，可以以不依赖PH的方式形成三链体结构。在上文所示的序列和图10所示的结构中，用假异胞嘧啶取代那些要被质子化的 胞嘧啶核碱基。因此，在所示的位置用J碱基取代C+允许三链体在生理pH下形成。预期 形成分子内三链体的杂交探针形成稳定的折叠结构(即三链体结构)，所述结构基本上抑 制它们与表面结合捕获探针的相互作用。7.标记、探针和引物任何已知的电化学部分可用作杂交探针切割部分上的标记。可使用的示例性的 电化学标记包括双(2，2' -二吡啶基)咪唑基氯化锇(II)[盐]。这种标记具有相对Ag/ AgCl的0. 165的优良Etl，并具有用于合成和纯化的良好的溶解性。其他示例性的标记包 括二茂铁以及于2006年7月17日提交的美国专利申请第11/488，439号公开的标记。此 外，电化学标记可以是任何可将电子转运到到电极或从电极转运电子的部分。示例性的 电化学标记包括过渡金属配合物。适合的过渡金属配合物包括，例如钌2+(2，2' -二吡 啶)3 (Ru (bpy) 32+)、钌 2+ (4，4 ‘ - 二甲基-2，2 ‘ _ 二吡啶)3 (Ru (Me2-bpy) 32+)、钌 2+ (5，6- 二 甲基-1，10-邻菲罗啉)3 (Ru (Me2-Phen) 32+)、铁 2+ (2，2 ‘ - 二吡啶)3 (Fe (bpy) 32+)、铁 2+ (5-氯 邻菲罗啉)3 (Fe (5-Cl-phen) 32+)、锇 2+(5_ 氯邻菲罗啉)3 (Os (5-Cl-phen) 32+)、锇 2+(2，2 ‘ -二 吡啶)2(咪唑基)、二氧化铼1+膦以及二氧化铼1+吡啶(ReO2(Py)41+)。一些可用作介质的 阴离子复合物是Ru (bpy) ((SO3) 2-bpy) 22—和Ru (bpy) ((CO2) 2-bpy) 22—，一些可用作介质两性 离子复合物是 Ru (bpy) 2 ((SO3) 2-bpy)和 Ru (bpy) 2 ((C02) 2-bpy)，其中(SO3) 2_bpy2-是 4， 4' - 二磺酸 _2，2' -二吡啶，(0)2)2^^72-是4，4' - 二羧基 _2，2' - 二吡啶。吡啶、二 吡啶(bypyridine)和邻菲罗啉基的适宜的取代衍生物与上文所述的任何金属一起也可以 用于复合物中。除其他的以外，适宜的取代衍生物包括但不限于4-氨基吡啶、A-二甲基吡 啶、4-乙酰吡啶、4-硝基吡啶、4，4' - 二氨基_2，2' -二吡啶、5，5' - 二氨基_2，2' -二 吡啶、6，6' - 二氨基 _2，2' -二吡啶、4，4' -二乙二胺 _2，2' -二吡啶、5，5' - 二乙二 胺 _2，2' -二吡啶、6，6' -二乙二胺 _2，2' -二吡啶、4，4' - 二羟基 _2，2' -二吡啶、 5,5' - 二羟基 _2，2' -二吡啶、6，6' - 二羟基 _2，2' -二吡啶、4，4'，4〃 -三氨基 _2， 2'，2〃 -四吡啶、4，4'，4〃 -三乙二胺 _2，2'，2〃 -四吡啶、4，4'，4〃 -三羟基-2， 2'，2'-四吡啶、4，4'，4〃 -三硝基 _2，2'，2〃 -四吡啶、4，4'，4〃 -三苯基 _2，2'， 2 “-四吡啶、4，7_ 二氨基-1，10-邻菲罗啉、3，8_ 二氨基-1，10-邻菲罗啉、4，7_ 二乙二 胺-1，10-邻菲罗啉、3，8- 二乙二胺-1，10-邻菲罗啉、4，7- 二羟基-1，10-邻菲罗啉、3， 8- 二羟基-1，10-邻菲罗啉、4，7- 二硝基-1，10-邻菲罗啉、3，8- 二硝基-1，10-邻菲罗啉、 4，7- 二苯基-1，10-邻菲罗啉、3，8- 二苯基-1，10-邻菲罗啉、4，7- 二波胺-1，10-邻菲罗啉 (4,7-disperamine-l, 10-phenanthroline)、3，8_ 二波胺-1，10-邻菲罗啉、二吡啶[3，2_a 2'，2' -c]吩嗪，以及 6，6' -二氯 _2，2' -二吡啶。尽管上文对电化学检测进行了举例说明，但公开的方法也适用于通过其他的检测 技术如荧光检测进行核酸检测。而且，杂交探针上的可检测标记可以是能被检测和/或定 量的任何部分。示例性的标记包括电化学标记、发光(如荧光、发光、化学发光)标记和比色标记。本文所用的引物可以具有任何类型的长度和构型。例如，引物的长度可以是从18 到约30个亚单位或从20到25个亚单位。引物并非限于DNA或RNA寡核苷酸，但它们必须 是通过聚合酶可延伸的。也可以使用更长或更短的引物。杂交探针中与靶核酸结合的区域的长度可以是从8到30个亚单位，而杂交探针中 不与靶核酸结合的区域(即5’翼)的长度可以是2-40个亚单位或从8到30个亚单位。也 可以使用具有比上文列举的那些区域更长或更短的区域的杂交探针。PCR引物经设计可结合并产生任何期望长度的扩增的产物，通常长度为至少30或 至少50个核苷酸且最多200、300、500、1000或更多个核苷酸。探针和引物可以以任何适宜 的浓度提供。例如，提供的正向和反向引物的浓度通常小于或等于500nM，如20nM-500nm， 或50-500nM，或100_500nM，或50_200nM。提供的探针的浓度通常小于或等于ΙΟΟΟηΜ，如 20nM-500nm,或50_500nM，或100_500nM，或50_200nM。NTPs、酶、引物和探针浓度的示例性 条件也可见于美国专利第5，538，848号中，或利用商购(例如可从Applied Biosystems, Foster City，CA获得)的反应组分来实现，所述美国专利整体被通过引用的方式并入本 文。也可以以阵列的形式使用多种互补的捕获探针，所述探针的每种都具有特征序 列。例如，可用与不同杂交探针片段杂交的捕获寡核苷酸的阵列定位和捕获许多离散的检 测区中的单个标签序列。本文所述方法可用于实时检测靶核酸。例如，固相支持体可与其中正发生核酸扩 增的溶液以及PCR过程中受到监控的过程(即实时检测)接触。可选地，固相支持体可与 PCR过程完成后的溶液接触(即终点检测)。在某些实施方案中，可在PCR过程中(实时) 以及该过程完成后(终点)监控PCR测定。PCR测定可利用传统PCR模式以及Fast PCR模 式、不对称PCR模式和异步PCR模式来进行。本文所述的方法适用于均相PCR测定，其中检测到杂交探针的探针片段的表面杂 交指示样品中存在靶核酸。尽管前述的说明书讲述了本发明的原理，但通过参考出于说明目的而提供的实施 例，本领域技术人员通过阅读本说明书应当理解，在没有偏离本发明的实质范围的情况下， 可以在形式和细节上做出各种变化。
1权利要求
检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括通过将所述样品加热至第一温度，使所述样品解链，其中所述样品包含与所述靶核酸的至少一部分杂交的引物；包含第一和第二区域的杂交探针，其中所述第一区域与所述靶核酸的至少一部分杂交，且所述第二区域不与所述靶核酸杂交，且其中所述第二区域包含可检测标记；和聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交的探针，由此释放包含所述探针第二区域和所述可检测标记的探针片段；和其中所述第一温度高于所述引物和存在于所述样品中的双链核酸的Tm；随后，通过将温度降低至低于所述第一温度的第二温度，使所述样品退火，以便使所述引物和所述杂交探针与所述样品中的靶核酸的单链部分各自杂交；和随后通过使所述聚合酶在第三温度下延伸与所述靶核酸杂交的引物，延长所述引物；使所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交探针，由此释放所述探针片段；任选地重复解链、退火和延长至少一次；将所述样品与固相支持体的表面接触，其中所述固相支持体的表面包含一个或多个与所述探针片段的第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；使所述捕获探针在第四温度下与存在于所述样品中的所探针片段的至少一部分杂交，其中所述第四温度低于所述第二和第三温度；以及检测所述固相支持体表面上的标记；其中所述杂交探针的至少一部分与所述杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中所述折叠结构的解链温度(Tm)低于所述第三温度且高于所述第四温度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶和所述具有核酸外切酶活性的酶是同一 分子。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构的解链温度(Tm)是41°C至66°C。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构的解链温度(Tm)是58°C至63°C。
5.如权利要求1所述的方法，其中在相应折叠结构中，所述捕获探针基本上接触不到 所述探针片段中与所述捕获探针杂交的的第二区域。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述第三温度高于或等于所述第二温度且小于所述 第一温度。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二温度和所述第三温度相同。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述杂交探针还包含邻近所述第一区域且与所述第 二区域相对的第三区域，其中所述第三区域不与所述靶核酸杂交。
9.如权利要求8所述的方法，其中将所述杂交探针的第二区域和第三区域都与所述杂 交探针的另一部分杂交以形成所述的折叠结构。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第三区域的至少一部分与所述第二区域的至 少一部分杂交以形成所述的折叠结构。
11.如权利要求5所述的方法，其中将所述杂交探针的第二区域的至少一部分与所述 杂交探针的另一部分杂交以形成所述的折叠结构。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是热稳定酶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述热稳定酶是Taq聚合酶。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述固相支持体的表面包含电极，且其中所述可检 测标记是可以将电子转运到所述电极或者从所述电极转运电子的部分。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述可检测标记是二茂铁部分。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述固相支持体的表面包含金。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述固相支持体包含多个形成流体槽的交叉板，其 中所述板的至少某些表面包含捕获探针，且其中将所述样品与固相支持体的表面接触包括 使所述样品流经所述流体槽。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述板的表面包含电极。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述交叉板的表面包含捕获探针。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构包含分子内三链体结构。
21.如权利要求1所述的方法，其中在连续循环中多次进行解链、退火和延长。
22.如权利要求21所述的方法，其中检测所述固相支持体表面上的标记在最后一次解 链、退火和延长循环后发生。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述样品在解链、退火和延长过程中与所述固相支 持体的表面接触，且其中检测在所述方法过程中和/或最后一次解链、退火和延长循环后 多次发生。
24.检测样品中靶核酸的试剂盒，其包含杂交探针，其包含与所述靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和包含可检测标记的第 二区域，其中所述第二区域不与所述靶核酸杂交，且其中，当与所述靶核酸杂交时，核酸外 切酶可以切割所述杂交探针，由此产生包含所述第二区域和所述可检测标记的探针片段；固相支持体，其包含位于其表面上的捕获探针，其中所述捕获探针与所述探针片段的 第二区域杂交；任选地，引物，其与所述靶核酸的至少一部分杂交；以及任选地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在杂交的探针的方向上 延伸杂交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交的探针，由此释放包含所述探 针第二区域和所述可检测标记的探针片段；其中所述杂交探针的至少一部分与所述杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结 构，且其中所述折叠结构的解链温度(Tm)低于所述杂交探针与所述靶核酸杂交时所形成的 双链体的解链温度且高于所述探针片段与所述捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温 度。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述固相支持体的表面包含电极，且其中所述 可检测标记是可以将电子转运到所述电极或从所述电极转运电子的部分。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述可检测标记是电活化二茂铁部分。
27.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述固相支持体的表面包含金。
28.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含聚合酶和具有核酸外切酶活性 的酶。
29.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶是同一 分子。
30.如权利要求2所述的方法，其中所述聚合酶是热稳定酶。
全文摘要
本发明描述了检测样品中靶核酸的方法和试剂盒。待分析的样品可以包括与靶核酸的至少一部分杂交的引物、具有与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和具有可检测标记的第二区域的探针、延伸杂交的引物的聚合酶以及包含能切割杂交的杂交探针由此产生标记的探针片段的核酸外切酶活性的酶。杂交探针的至少一部分与其另一部分杂交由此形成折叠结构。该方法包括解链样品、降低样品的温度以便使引物和探针与样品中单链靶核酸的至少一部分各自杂交、延长引物以及释放标记的探针片段。可将样品与包含与标记的探针片段杂交的表面结合捕获探针的固相支持体接触。随后检测标记。
文档编号C12Q1/68GK101978070SQ200780036279
公开日2011年2月16日 申请日期2007年12月28日 优先权日2006年12月29日
发明者克瑞斯蒂恩·斯卡博, 尤金·斯拜尔, 维萨里昂·埃瓦萨韦利 申请人:应用生物系统公司