专利名称：：可用于将宏基因组文库转移至多种细菌物种中的基于rk2的广宿主范围克隆载体的利记博彩app可用于将宏基因组文库转移至多种细菌物种中的基于RK2的广宿主范围克隆载体本发明涉及用于宏基因组(metagenomic)研究的新克隆载体，其允许将宏基因组文库转移至广泛的细菌宿主范围中。所述载体基于RK2质粒，特别是包含RK2的复制和转移起点——on'K和w/r。本发明首次出人意料地提供了能够在广宿主范围中以提高的拷贝数(例如中等拷贝数至高拷贝数)维持大插入片段(以及较小的插入片段)的载体。自然环境(如土壤或水)中包含大量的微生物。其中大多数无法进行培养，从而无法对其基因组进行常规分析。因此，即使在基于标准培养方法进行广泛筛选之后，仍有庞大的遗传信息来源尚未发现。这一难题可以通过研究环境样品的"宏基因组"来解决，"宏基因组"是环境中所有微生物的总体基因组。宏基因组具有空间和时间维度；环境的改变和样品与特定的时间和地点有关。宏基因组学试图发现环境中基因的特性以及阐释它们的功能和相互作用。通过宏基因组学研究已鉴定了数千种未培养的微生物，并且已发现新基因，特别是基于其功能而非其序列发现了新基因。更特别地，在宏基因组学方法中，可以通过从环境样品中直接分离DNA并克隆进合适的载体以创建复杂的宏基因组文库来研究这样的环境来源。已经使用不同的载体(包括粘粒、F粘粒(fosmid)和BAC(细菌人工染色体)以及带有小插入片段的质粒)或者使用入噬菌体来建立用于功能筛选的宏基因组文库，以检测新的多肽。迄今为止，已建立了来自土壤和海洋环境的众多宏基因组文库(综述见于Daniel,2005，7Vfl似^及ev3:470國478;DeLong,2005,7Vfl似^及w3:459-469)。另外，Venter及其同事报道了首例将"全基因组鸟枪法测序"法应用于采集自马尾藻海(SargassoSea)的海洋孩i生物种群(Venter等，(2004),5W^i"304:66-74)。利用基于序列的技术或者通过包括在替代宿主中分析新表型性状表达的活性筛选，宏基因组文库可用于分析新的基因和途径。多数情况下，宏基因组载体只在大肠杆菌或其近亲中复制。最常用于大插入片段宏基因组学研究的载体是用于BAC(细菌人工染色体)和F粘粒(通过人噬菌体包装)克隆的基于大肠杆菌F-因子的栽体(Shizuya等，1992,iV^A7^/5W，USA89:8794-8797)。这些栽体的复制仅限于使用大肠杆菌菌林作为宿主，因此宏基因组文库的表达也仅限于此。新活性的鉴定依赖于所克隆基因的成功转录和翻译，尽管已经使用大肠杆菌作为宿主表达了新的活性，但是扩大细菌宿主的范围以获得其他表达能力仍具有潜在的优势。这由Gabor等(Gabor等，2004,五wv!VwiAf/cw6,V/6:879-886)最近在其研究中证实，该研究显示当在大肠杆菌中表达时，只能检测来自32种原核生物基因组中40%的基因。该研究还表明，不同分类学群体的生物之间的预测表达模式存在显著差异。Martinez及其同事的另一研究显示，大肠杆菌、恶臭假单胞菌(i^M^附o聽s1/7wf論)和浅青紫链霉菌(5^/^考c^s//vzVtos)表达异源基因簇的能力存在差异(Martinez等，2004，』/7p/.Af/cwWo/70:2452-2463)。为了研究将许多不同宿主用于表达得自环境样品的基因的可能性，需要新的生物工具。已报道了宿主范围比上述大肠杆菌宏基因组载体更广的某些穿梭载体。例如，已描述了能够转移至除大肠杆菌外的一种或两种宿主的BAC载体(Sosio等，2000，iVfl似f^肌o&c/mo/18:343-345;Martinez等，2004，j/;/7/.￡>iv//y^Micn^/o/70:2452-2463)。然而，这些载体都是基于将环境DNA整合进宿主染色体中。迄今为止，尚未开发出用于宏基因組学研究的能携带极大插入片段且适于在广宿主范围中使用的小型自主复制载体。我们开发了本发明来满足这种需要。具体来说，基于广宿主范围RK2复制子开发了相对较小且功能已知的新栽体。这样的栽体可用于构建宏基因组文库。人们公知，由该复制子构建得到的载体在多种革兰氏阴性菌物种中发挥功能(Thomas&Helinski，1989PromiscuousPlasmidsinGram-negativebacteria(Thomas,C.M.编辑)第1章,1-25页，AcademicPressInc(London)Ltd,London)，甚至已译皮转移到了革兰氏阳性菌、酵母和哺乳动物细胞中(Poyart和Trieu-Cout，1997，F五M^Af/cn^^/Z^ft156:193-198;Bates等，1998，/5fl"e/7W180:6538-6543;Waters,2001，A^wmGe""/cs29:375-376)。然而，先前并未i人识到载体、例如现在提出的载体(特别是不整合进宿主染色体的这些载体)有可能用于在广泛物种中克隆、稳定维持并表达大的插入片段，并因此可用作宏基因组学用途中可转移载体的基础。本发明的载体在许多宿主中复制的能力意味着可以将整个文库从大肠杆菌转移至多种宿主，这通过接合来有效地实现。RK2复制子表现出增加的拷贝数(即拷贝数大于1，通常约为5-10)，所克隆插入片段的基因量将比染色体插入时明显更高，这提高了功能性测定成功的几率。另外，还有可能通过使用必需的复制起始基因的高拷贝(copy-up)突变体来增加跨越物种屏障的拷贝数(Haugan等，1995,P/fls附iW33:27-39)。本发明的一个出人意料的特征是，可以将大插入片段(例如，30或40kb或更大，乃至50、60、80或100kb或更大)在广泛的细菌菌种(即跨越广泛的宿主范围)中克隆并维持在相对高拷贝数的载体(质粒)中。本发明使含有大插入片段的这些载体(质粒)能够转移至广泛的细菌中，并在广宿主范围中稳定地维持这样的载体(质粒)。因此，本发明提供了用于在广宿主范围的细菌中克隆DNA的克隆载体，所述载体为自主复制的人工染色体，其包含(i)RK2复制起点(ii)RK2接合转移起点on了；(iii)来自RK2的(iv)克隆区域；(v)另一个复制起点，其允许所述载体以不超过1或2的拷贝数复制；其中所述载体的大小不超过15kb、不含有RK2的^/4，并且能够克隆至少12kb的插入片段，其中所述载体中RK2DNA的含量为不超过10%的RK2。上文所指的RK2是下文进一步讨论的RK2质粒(参见Thomas和Helinski,1989，如上)。更特别地，所述载体能够克隆至少15、20、30或40kb的插入片段。因此，作为替代地，所述栽体能够克隆大插入片段。本文定义的"大插入片段"是大小至少为30kb、更特别地至少为40、50、60或70kb的插入片段。在本发明一个特别优选的实施方案中，可以克隆至少80kb，更特别地至少卯或100kb。优选地，还可以克隆120、150、170、180、l卯或200kb或者更大的插入片段。或者，可以克隆多达100、120、150、170、190、200或250kb的插入片段，例如从至少12、15、20或30、50、70或80kb直至以上提及的任何数目的插入片段。更特别地，本发明的载体允许稳定地维持这些大插入片段。包含大插入片段的所述载体可以在广宿主范围中稳定维持。另外，包含这样的大插入片段的所述载体能够转移至广宿主范围中。本发明的栽体适用于并可用于宏基因组克隆。因此，它可称作宏基因组克隆栽体。本发明的载体允许克隆DNA,优选地如上文所述克隆宏基因组DNA。因此，所述DNA可以是基因组DNA，但在本发明最广义的范围中，它可以是任何DNA。所述DNA可以来自任何来源。因此，包括基因组DNA、cDNA或任何类型的合成DNA，例如克隆或扩增的DNA片段。所述DNA可以来自单一来源或来源的混合物，例如来自单一样品或样品混合物。它可以代表单一DNA或DNA混合物，例如来自单一生物或来自生物的混合物(即至少两种生物)。然而，优选地，所述DNA是宏基因组DNA或来自环境样品的DNA。因此，所述DNA可以分离或获得自环境样品。本发明的一个特别优势在于该载体的广宿主范围。这意味着所述载体可用于范围广泛的不同细菌种或属，例如至少5、7、10或12种不同的细菌，例如至少5种不相关的细菌。RK2质粒以及基于RK2或f汴生自RK2的质粒或复制子通常的宿主范围在Thomas和Helinski，1989(同上)中有描述，所有这些细菌均可根据本发明使用。因此，所述载体的广宿主范围包括广泛的革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌。合适的革兰氏阴性菌包括所有的肠道菌种，包括如埃希氏菌属物种(J^c/^7'c/l/flsp.)、沙门氏菌属(5W/ii<me//fl)、克雷伯氏菌属(Z/e6wW/")、变形菌属(7Vo&ws)和耶尔森氏菌属(1fera/"/fl);以及非肠道细菌，包括固氮菌属物种(Afl(^6fl"ersp.)、假单胞菌属物种(尸sewd謂o/mssp.)、黄单胞菌属物种(X關,/i0附諸flssp.)、柄杆菌属物种(Cflw/Mfl"ersp.)、不动杆菌属物种""Vi^^ic^sp.)、气单胞菌属物种(Jm则/iflssp.)、土壤杆菌属物种(々f^6fl"m.固sp.)、产械菌属物种(爿/cfl/^膨ssp.)、包特氏菌属物种(5onffl&〃"sp.)、流感嗜血菌(/m/7we/1^^)、食甲基嗜甲基菌(AfC%%^//ms柳e勿/o加/7力ws)、根瘤菌属物种(及/^zoWm柳sp.)和石危杆菌属物种(T7i/o6a"7/wssp.)(也参见Thomas和Hdinski，同上)。可以使用的革兰氏阳性细菌宿主包括棍状杆菌属物种(C7flv幼""wsp.)。更特别地，所述载体可以用于广泛的或者几乎所有的革兰氏阴性菌中。代表性的革兰氏阴性菌属包括假单胞菌属、黄单胞菌属和肠道细菌，但该列表并非穷举，所选择的宿主可取决于研究、所选样品等。尽管优选革兰氏阴性宿主，但是本发明的载体也可用于已知可转移基于RK2的质粒的革兰氏阳性菌(例如棍状杆菌属)中。这些经转化的宿主细胞包括在本发明的范围内。因此，本发明另一个方面包括含有上文所述克隆载体的宿主细胞。所述载体能够自主复制。这意味着它是非整合型载体，它不整合进宿主染色体中。特别地，它不整合进任何引入该载体或者可以转移该载体的宿主中。所述载体能够在细菌宿主中自我复制，从而该细菌细胞生长和分裂时所述载体仍然存在(作为载体)。更特别地，所述载体能够在其细菌宿主中稳定维持。因此，所述载体可以引入细菌宿主中，并在将该宿主重复培养数代(例如超过2、3、4、5、6或10代)时或者更一般地在宿主细胞生长期间在该宿主中维持(即可以检测到该载体的存在)。当然，自主复制需要宿主能够支持该载体的复制，即宿主包含必要的遗传机器。可以选择或遗传改造获得合适的宿主，这是本领域技术人员的常规技术。因此，例如，尽管所述载体包含两个起点，但是在广宿主范围中的复制通常从oWK开始。这意味着宿主需要/4基因来发生复制，如下文的进一步解释和讨论，它可以容易地引入宿主中，特别是引入宿主染色体中。本文使用的术语"人工染色体"包含任何人工构建的自我复制遗传元件，其能够携带大的插入片段(例如，30kb或更大的插入片段，或者如文上所述更大的插入片段)。因此，所述人工染色体是能够在细菌宿主中自主复制并且能够携带大插入片段的遗传构建体。所述构建体在细菌宿主中能够实现染色体的行为或功能。因此，所i^A工染色体能在细菌宿主细胞中稳定维持。该人工染色体包含复制起点以及从一个细菌细胞繁殖成其后代所需的任何其他遗传元件或序列。因此，广义上讲，本发明的克隆载体可看作能够在宿主细胞中自主复制的质粒或质粒型载体，它能够稳定携带大插入片段。优选地，所述人工染色体是细菌人工染色体(BAC)。BAC或BAC载体是本领域公知的，并已在文献中广泛描述。在一个优选的实施方案中，BAC可宽泛地定义为基于致育质粒的DNA构建体，其用于在细菌中进行转化和克隆。BAC通常具有大的插入片段尺寸，例如100~300kb。实践中，BAC载体通常是包含来自大肠杆菌F-因子的复制起点(常称为on'2或on'5")的经修饰质粒(Shizuya等1992,PNAS89,8794-8797)。完整的F-因子序列可以NCBI登记号AP001918获得。F-因子起点将复制严格控制在每个细胞1或2个拷贝。作为BAC载体，本发明的克隆载体可相应地包含F复制起点(或称为on'2)。因此，当本发明的载体是BAC载体时，上述特征(v)中的另一复制起点可以是on'二更特别地，本发明的BAC载体可以包含F-因子复制子。这定义为w'2、f^E和/7"M5。这些遗传元件的来源和序列是本领域容易获得的。因此，例如，on7可得自F-因子，或者得自基于F-因子或含有w/2的任何其它质粒或载体。/mM5可以从任何合适的来源获得，例如F-因子或任何基于或衍生自F-因子的质粒或载体，或者事实上不一定衍生自F-因子的任何含有parAB基因的载体或质粒。例如，Pl也具有可以利用的/7flMfi基因。A自EpicentreTechnologies的pCClBAC和F粘粒载体包含可以利用的on'2和/7flfv!B。和r印五介导F因子的单向复制，而/mM和/mW将拷贝数维持在每个大肠杆菌基因组1或2个。F复制子还可包含具有其他稳定功能的/7flK7和/或f^/F基因。因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明的载体是包含on'2、和/;flM5的BAC栽体，更特别地是包含on'2、M/7i和并任选地包备f^/F的BAC载体。在另一实施方案中，本发明的载体可基于衍生自Pl的人工染色体——PAC(Ioannou等1994NatGenet6，84-89;Sternberg1990PNAS87，103-107)，它可以看作是BAC的一个亚类。PAC是基于杀菌肽P1复制起点，因此包含该复制起点。因此，当本发明的载体是PAC载体时，上述特征(v)的另一复制起点可以是P1复制起点。更特别地，所述PAC载体包含P1质粒复制子。需要时，PAC载体还可以包含P1包装位点(pac),以将载体和所克隆DNA包装进噬菌体颗粒中，并可以包含两个Pl/^P重组位点以使所包装DNA环化(当在合适的含有PlCre重组酶的大肠杆菌宿主中时)。另外，这些遗传元件的来源和序列容易获得，并且在文献中有所描述。另一(或者说第二)复制起点允许载体以不超过1或2个的低拷贝数进行复制。如上文所述，这可以是w/2或Pl复制起点。然而，它也可以是允许载体在所选初始宿主中以低拷贝数进行复制的任何起点。如下文的进一步解释，本发明的栽体通常首先可用于在选定的宿主中建立所克隆插入片段的文库。然后，可以将该文库从所述最初或第一宿主转移至一个或更多不同宿主，优选广范围宿主。RK2起点w/K是广宿主范围起点，并将广宿主范围特性传递给载体。然而，w/K需要/r/4,由于所述载体中不存在"/4，所以如果不天然存在的话就必须将其单独提供给宿主。因此，不存在^/4时，复制将只能从所述第二或另一起点开始。因此，这一起点可以选择成在用于最初构建所述文库的宿主中起作用。由于大肠杆菌通常是优选的这种初始宿主，因此优选所述另一起点在大肠杆菌中起作用。因为以低拷贝数表达的载体可能更稳定，所以这一起点的低拷贝数在本发明实践中可能是有利的，这时所述第一或最初宿主作为所克隆DNA的"储藏库"，即DNA可以首先在引入所述载体的第一宿主中以低拷贝数进行克隆，之后再以较高(例如中等)拷贝数转移至另外的宿主。本发明的载体包含RK2质粒的许多功能或特征，最重要的是on'K、w/r和/7flriXB。RK2是已充分表征的天然存在的60Kb可自我转移质ii粒，它是IncP不相容群的质粒，众所周知，IncP不相容群具有在广泛的革兰氏阴性细菌中复制的能力(Thomas和Helinski，1989,PromiscuousPlasmidsinGram-negativebacteria(Thomas,C.M.编辑)第1章，1-25页，AcademicPressInc(London)Ltd,London)。已确定,RK2的最小复制单元由两个遗传元件组成——营养复制(vegetativereplication)起点(w/F)和编码必需起始子蛋白(TrfA)的基因("/J)，所述起始子蛋白与oriV中的短重复序列结^(Schmidhauser和Helinski,1985，J.Bacteriol.164，446-455;Perri等，1991，J.Biol.Chem;266，12536-12543)。这一最小复制单元称为所谓的"RK2最小复制子"，已在文献中广泛表征和研究。文献中已制备并描述了基于RK2最小复制子或基于RK2质粒衍生物的多种复制子(称为"最小RK2复制子")和克隆栽体(参见，例如，Li等，1995，J.Bacteriol.177，6866-6873;Morris等,J.Bacteriol.,177,6825-6831;Franklin和Spooner,PromiscuousPlasmidsinGram-negativebacteria(Thomas,C.M.编辑)第10章，247-267页，AcademicPressInc.(London)Ltd.,London;Haugan等，1992,J.Bacteriol174:7026-7032;以及Valla等，1991，Plasmid，25，131-136;Blatny等，1997，J//7/63:370-379;Blatny等，1997,户/画/rf38:35-51;Santos等,2001FEMSMicrobiol..Lett.195:91-96)。另外，已经报道了完整的RK2核普酸序列(Pansegrau等，1994,J.Mol.Biol.，239，623-633)。/"rD五基因是RK2中操纵子的一部分，其参与质粒或异源复制子在多种细菌宿主中的维持(Roberts等，19卯，J.Bacteriol,172，6204-6216;Schmidhauser和Helinski,同上；Sia等，1995,J.Bacteriol,117,2789-2797;Roberts等，1992，J.Bacteriol,174，8119-8132)。因此，RK2最小复制子和另一些RK2元件的来源是非常清楚的并且容易获得的。由此，例如，RK2的oriV、oriT或parDE可以来源于亲本质粒RK2,或者来源于文献中描述并提供的任何多种衍生物或小RK2质粒(miniRK2plasmid)(参阅如Li等；Morris等，Franklin和Spooner;Haugen等；以及Valla等，Blatny等，同上)。含有RK2oWF的BAC和F粘粒栽体也是可以获得的(例如，来自Epicentre的pCClBAC和pCClFOS)，它们可用作起始质粒或来源质粒，如下文实施例1的进一步描述。各个RK2元件可以从同一来源一起分离，或者从不同的来源各自分离。用于从选定的来源中切下包含所需RK2元件或功能的目的核苷酸序列并将其引入载体或中间构建体的技术是本领域公知的标准技术，并例如描述于Sambrook等,1989,Molecularcloning;alaboratorymanual第二版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,N.Y.。下文的实施例中将更详细地描述，可以很便利地从选定的来源分离所需序列并利用本领域的标准技术将其引入一系列中间构建体中，所述中间构建体可以是质粒；以及引入或添加或缺失元件以得到本发明的载体。或者，可以选择已包含某些所需元件的起始质粒或载体(例如，以下实施例1中所述的pCClFOS)，并可对其进行修饰，以引入本发明载体的其他特征(例如，可以通过引入onT和/mr"f来修饰pCClFOS)。本文使用的术语"w/K，、"^/4"、"onT，、"/7wD"、"/7"W、"w/2"、"p"M"、"/mf丑"、"/;flfC"、"m/^"、"r^/P，等以及所提及的任何其它基因或遗传元件不仅包含其最初、亲本或原型的来源质粒表现出的天然或野生型功能，还包含对所述功能进行的^f务饰，例如通过核香酸的添加、缺失或替换或者化学修饰进行的修饰，所述修饰可以是天然存在的(例如通过等位基因变异或自发突变产生的)或是以合成方式引入的。用于修饰核苷酸序列的技术是文献中公知的标准技术，包括如诱变(例如使用诱变剂或定点诱变)。还可以使用PCR来引入突变。可以例如通过目的遗传元件的突变体筛选来选择合适的或预期的突变。本发明的载体还包含克隆区域(或者叫作克隆区段)。特别地，它包括用于引入待克隆DNA(即"插入片段")的位点。因此，该克隆区域中包含克隆位点。方便地，这样的克隆位点可以是或可以包含一个或多个限制性位点。可以包含多个(例如至少2个或3个，多达20个或更多)这样的插入位点。可以构建包含多个限制性位点的载体，其包含例如2-20、3-20、2-10、3-10、3-6或2-6个独特位点(例如在多聚接头中)。用于插入预期基因的合适克隆位点以及用于其构建和/或将其引入本发明载体的技术是本领域公知的并且在文献中广泛描述(例如见Sambrooketal"同上)。为了便于构建，可以使用本领域标准的核酸操作技术以多聚接头序13域已知一系列合适的多聚接头序列，它们可以简化载体的常规使用。因此，例如，可以使用公知的多聚接头〃"cZ区域，如Ditta等，1985,Plasmid，13,149-153所述载体中的区域，其通过使用基于/flcZ的蓝/白筛选技术(公知的选择方法)而简化了标准克隆步骤以及对带有插入片段之质粒的鉴定。因此，例如，所述克隆位点可以包括BamHI、HindIII和/或EcoRI。诸如这样的位点对于粘性末端克隆是有用的。可以使用任何合适的限制性位点，例如根据对构建的选择或方便程度等来使用。所述克隆区域还可以包含其他限制性位点，例如可用于切除插入片段的富含C+G的限制性位点如Notl、Eagl、Xmal、Smal、Bgll和Sfil。它们可以在克隆位点两侧。有时，这样的限制性位点在需要时也可以用作克隆位点。所述克隆区域还可包含用于F粘粒克隆的cos位点，例如X噬菌体的cosN。合适的来源和序列同样是本领域公知的。可以包含限制性位点(例如Eco721)以用于平末端F粘粒克隆。在另一实施方案中，所述cos位点不一定位于克隆区域中，可以位于载体中的其它位置。因此，更一般地，所述cos位点通常可以看作是本发明载体的任选特征。F粘粒与BAC结合的载体是本发明的一个优选特征。因此，本发明的载体优选是包含cos位点的BAC载体。这样的载体可用于BAC克隆(例如克隆较大或非常大的插入片段)以及用于粘粒克隆(例如克隆较小的插入片段(30-40kb))。所述克隆区域还可以包含一个或多个噬菌体PI位点，用于Cre-重组酶切割。如上文所述，本发明载体的大小不超过15kb。栽体尺寸小是有利的，因为其允许克隆大的插入片段。优选地，所述载体的大小不超过14、13或12kb。另一优选的特征是所述载体包含不超过10%、优选不超过9%、8。/。或7。/。的RK2质粒。事实上，包含如此少RK2的载体能够作为广宿14主范围质粒用于携带大插入片段，这是一个出人意料的特征。在具体实施方案中，所述载体可以仅包含W/F、CW了和/7flf/)五基因或者来自RK2的遗传元件，而不包含其它基于RK2或衍生自RK2的基因或遗传元件。在另一些实施方案中，还可以包含/^fvlB(:。其他实施方案可以包含一个或多个来自RK2的抗生素抗性标记，例如四环素抗性(无论该载体是否包含来自RK2的/m/v!BC)。本发明载体的一个有利特征是它们可用于克隆大的或非常大的插入片段，如上所述。如上文所指出，"插入片段"是待克隆的DNA。因此，它是用于克隆的DNA分子或片段。它可以釆用任何适于克隆的形式，例如作为带有平末端或粘末端的片段。引入该载体中的插入片段可以直接得自样品，例如可包含DNA来源(通常为细胞，如微生物)的环境样品或其它样品。因此，可以通过在样品中直接裂解细胞来提取或分离DNA。例如，可以将裂解緩冲液直接加至样品中。或者，可以在分离DNA之前将细胞(例如微生物)从样品中分离或分开。这一方法通常允许分离尺寸较大的DNA片段。可以对所分离的DNA或得自其它来源的克隆用DNA按大小分级分离，以制备用于克隆的插入片段。另外，可以将所分离DNA或DNA片段进行消化，例如使用限制性酶或其它方法进4亍部分消化。用于分离细胞和DNA、消化DNA以及对DNA片段进行大小分级分离或大小选择的技术是本领域技术人员公知的，并且在文献中广泛描述。制备合适的插入片段后，可以将其引入或插入载体中，例如通过连接进线性化且去磷酸化的载体中来实现。同样地，该步骤也是本领域的标准步骤。尽管如上文所述，本发明的载体可用于克隆至少12kb的插入片段，但优选该载体能够克隆至少30kb的大插入片段以及特别地至少80kb的极大插入片段，如上文所述。如上文所述，本发明的一个优势是w/K使得所述载体能够以中等或更高的拷贝在宿主细胞中表达。尽管在本文中将中等拷贝数宽泛地定义为包括大于2的拷贝数，即3个或更多，但优选的拷贝数(即在单个细胞中或每个宿主细胞基因组中所述载体的拷贝数)为5个或更多。因此，更特别地，"中等"拷贝数可以为5个或更多。可以将拷贝数提高至更高的数目，例如提高至10个或更多的高拷贝数。因此，所述载体的拷贝数可以为例如5-7或5-10、5-12、5-15、5-20、5-25乃至7-20或10-20或7國25或10-25个。如上文所解释地，从on'K起始的复制需要化/^基因。在本发明的载体中不存在^/4。因此，对于从^/F起始的复制来说，必须单独提供^/4基因。这将在下文进行讨论，但是也可以将宿主细胞改造成表达该基因，例如在可得自EpicentreTechnologies的EP1300大肠杆菌细胞中表达。优选地，宿主可以含有诱导型^/4基因。该^/4基因可以在单独的载体上(相对于本发明的载体单独存在)，或者更优选整合进宿主染色体中。可以将修饰引入基因以提高宿主细胞内的载体拷贝数(如上所述)或者实现温度敏感型复制。这样的修饰在文献中已有描述。RK2在大肠杆菌中的拷贝数估计通常为每个染色体5~7个质粒。然而，这可以通过在基因中的某些点突变而在大肠杆菌和另一些细菌中得以提高，这可导致拷贝数高达正常情况的23倍。这样的"高拷贝突变"或""p突变"描述于例如Durland等，1990,J.Bacteriol，172，3859-3867;Haugan等，1992，如上；以及Haugan等，1995，Plasmid,33,27-39。基因中的co/;突变可用于提高大肠杆菌以外的其他细菌物种中的表达。研究已显示，^/4中的co/;突变通常位于化W中I和S/H位点之间，co/;突变可容易地通过在^/4基因中内部交换I片段和简便的一步式克隆操作来制备(参见Haugan等，1995,同上)。本发明的载体还可以包含另一些特征或元件。因此，可以存在一个或多个选择标记以利于选择转化体。优选地，可以存在两个或多个选择标记。众多选择标记是本领域已知的并且在文献中有所描述。任何这些标记均可以根据本发明使用，包括如由RK2质粒及其衍生物或者任何其它质粒所携带的抗生素抗性标记。然而，诸如糖的利用、蛋白酶产生或细菌素产生或抗性的特性也可以用作标记。TOL质粒的结构基因也可以用作标记。该基因编码可容易地定量检测或测定的^物C230。用儿茶酚向细菌菌落平板喷雾，它们由于2-羟基黏康半醛(2-hydroxymuconicsemialdehyde)的积累而变为黄色，因此可以迅速地区分C230+菌落，使得可以通过载体中的存在而快速鉴定转化体/转接合体。用作构建本发明载体的起始载体或来源栽体的BAC、F粘粒或其它栽体可能已经包含了合适的选择标记(例如抗生素抗性基因)，它们可以保留，或者可以对其进行补充或替换。例如，BAC载体通常包含氯霉素抗性基因——CmR。这可以用另一选择标记(例如另一抗生素抗性基因，例如卡那霉素抗性基因一KmK)进行补充。所述载体还可以包含其它特征，例如允许或促进所克隆插入片段的研究或分析。因此，该载体可包含用于测序(例如用于BAC末端测序)的引物结合位点。所述载体还可任选地包含克隆区域两侧的位点，该位点可以被非常稀有的切割酶所切割。已知这样的酶在市面有售。由于载体部分总能得到已知的条带，因此这可以简化对标准酶生成的插入片段的分析确定。可能期望表达所克隆的插入片段。通常，较大的插入片段可包含用于表达其中基因的必要元件(例如启动子、核糖体结合位点等)。然而，可能期望本发明的载体包含一个或多个用于表达插入片段的表达控制元件。因此，本发明的载体还可以包含用于基因表达的调节功能和/或增强子功能，例如转录或翻译控制序列如起始密码子或终止密码子、转录起始子或终止子、启动子、核糖体结合位点等。本发明载体的一个优势它们在功能上和结构上充分表征。因此，所述栽体可以全部测序。如上文所述，对于从oWF起始的复制来说，宿主必须包含^/4基因，或者为其提供化/^基因。这可以通过另一载体来提供，优选地将^/4基因插入宿主染色体中。可将另一载体设计成实现这一目的。因此，本发明还提供了用于克隆DNA的载体系统，所述系统包含作为本发明克隆载体的如上文所述第一载体和包含RK2的&/4基因的第二载体。所述第二载体允许在宿主中表达。尽管该第二载体可以是例如可作为自主复制元件引入宿主中的质粒或其它载体，但优选使^/4基因整合进宿主染色体中。优选地，所述第二载体携带转座子。例如，可以将^/4基因克隆进自杀转座子载体中。所述第二载体还可以包含用于表达"/4基因的表达控制元件，例如转录控制元件如启动子。优选地，可以将化W基因置于诱导型启动子(例如户附或其突变体)的控制下。这样可以控制基因的表达。所述第二栽体还可以包含用于筛选转化体的选择标记。用于制备这样的转座子载体的技术是本领域公知的，用于将载体引入宿主细胞的技术(例如电穿孔)也是本领域公知的。可利用标准的转化技术将克隆载体引入宿主细胞，例如热激转化。用于将克隆载体引入宿主细胞的方法(特别是细菌转化的方法)是本领域公知的并且在文献中广泛描述，包括例如Sambrook等，(同上)。电穿孔技术同样也是公知的并且广泛描述。本发明的克隆载体可看作是基于RK2质粒的。本发明的载体主要用于宏基因组克隆。因此，广义上来看，本发明的构思因此可看作是RK2复制子(特别是w/K)用于构建在宏基因组克隆中使用的广宿主范围载体的用途。本发明的克隆载体允许在广宿主范围中构建宏基因组文库，其中大的插入片段可以以高拷贝数进行克隆。宽泛而言，本发明也可以因此看作是提供用于宏基因组克隆的基于RK2的克隆载体，其中所述载体能够在广宿主范围中以高拷贝数克隆大的插入片段。在本发明的实践中，可以从预期的来源(例如环境样品)获得以及分离DNA，如上文所述，用于插入克隆载体中的DNA片段可以使用标准技术制备和插入。然后，可以将这样制备的克隆栽体(即含有插入片段的克隆载体)引入预期的细菌宿主中(例如通过转化来实现)。用于这一步骤的宿主细胞可以是任何所需的宿主细胞，并且可以将载体引入一种或多种宿主细胞(例如一系列所需细胞)中。然后，可以培养该宿主以得到所克隆插入片段的文库。例如，可以将转化宿主细胞的菌落铺板。优选地，最初的文库构建步骤在单——种宿主细胞中进行，之后通过接合转移(即使用所述载体的onT)将该文库转移至一系列其它宿主细胞中。这些用于转移的宿主经选择或经修饰而包含^/4。用于最初的文库构建的宿主细胞可以是任何所需的宿主细胞，但方便地为大肠杆菌。将所述载体的第二起点选择成在最初的文库构建的宿主细胞中起作用。因此，所述第二起点可以是大肠杆菌中起作用的起点。例如，所述第二起点可以方便地为w/2。优选地，"/4基因在引入克隆载体的(即文库初始构建的)第一宿主中不表达。因此，所述第一宿主可以不包含&/4，或者如果存在时其不表达(例如其在未经诱导的诱导型启动子的控制下，或者它是温度敏感型突变体等)。因此，在第一(或称"初始")宿主中，所述栽体从第二起点复制，因此只以一或二的拷贝数存在。然后，可以将所述文库转移至另一(或称为"第二，，)宿主中。可以使用一种或多种第二宿主，优选地使用多种宿主例如2种或更多种，优选3、4、5、6、8、9或10种或者更多种。这可以通过使用标准技术进行接合交配(conjugativemating)来实现。然后可以培养交配的第二宿主。如上所述，该第二宿主包含^/4。因此，在这些宿主中，所述克隆载体可以从w/K复制，并因此以中等拷贝数或高拷贝数进行复制。因此，本发明允许在广宿主范围中提高所克隆插入片段的基因量。因此，可以首先得到低拷贝数的文库(例如在第一宿主中)，然后将其转移至一系列宿主中并增加拷贝数。因此，在另一个方面中，本发明提供了克隆DNA的方法，所述方法包括(i)将所述DNA引入如上文定义的克隆载体中；(ii)将所述克隆载体引入第一细菌宿主细胞中，优选引入大肠杆菌中；(iii)培养所述第一宿主细胞，从而克隆所述DNA;(iv)将所述克隆DNA转移进一种或多种第二宿主中。19更特别地，在所述第一宿主中，所述栽体从所述另一(即"第二")复制起点开始复制，在转移至所述第二宿主后，所述栽体从on'K开始复制，因此，^/4在所述第二宿主中表达，而不在所述第一宿主中表达。或者，本发明提供了制备DNA克隆文库的方法，所述方法包括(0将所述DNA引入如上文定义的克隆载体中；(ii)将所述克隆载体引入第一细菌宿主细胞中，优选引入大肠杆菌中；(m)培养所述第一宿主细胞，从而制备所述DNA克隆的第一文库；(iv)将所述第一文库转移进一种或多种第二宿主中以制备一种或多种第二文库。w/r介导的与新宿主的转移接合(mobilisedconjugation)需要fm基因。如果第一宿主细胞不包含这些基因，则有必要引入它们(例如在第一个克隆步骤前引入第一宿主细胞)，或者首先将克隆载体从第一宿主转移进中间宿主，以用于随后通过接合进行转移。因此，可以将来自第一克隆步骤的载体转化进这样的中间宿主中。因此，转移克隆DNA/所述克隆DNA/文库从所述中间宿主转移至所述第二宿主的步骤。参照以下附图，通过以下实施例对本发明进行更详细的描述图l显示了实施例1中使用的基因组文库构建用质粒载体(pRS44)以及在非大肠杆菌宿主中支持载体复制的质粒载体(pRS48)。pRS44可作为单拷贝复制子通过m/2和m/7五进行复制，而w/F在其复制起始蛋白TrfA在同一细胞中表达时促成中等拷贝数复制。通过从阿拉伯糖诱导型启动子表达突变的基因，可以在大肠杆菌菌林EPI300中容易地大量制备pRS44DNA，如Wild等(Wild等，2002GenomeRes.12:1434-1444)所述。c^7V是用于将环境DNA文库包装进X噬菌体颗粒的位点，5rt/wHI和五co72I位点分别用于BAC和F粘粒克隆，2VWl适于对插入片段进行分选(sizing)。利用窄宿主范围质粒pRS48中存在的20转座子，将化/^基因插入目标宿主的染色体中。将该转座子(命名为Tn及似S)的内侧末端和外侧末端分别标记为I和O。卬《:编码转座酶的基因，它不是转座子的一部分。xj;/5":编码苯甲酸型诱导剂(如间甲基苯甲酸盐/酯)存在下PwG5转录的激活剂的基因。接合转移的起点。更详细的介绍参见表1和实施例1。图2显示了不存在抗生素选择时pRS44和pRS49的质粒稳定性。将摇瓶中指数生长的细胞(存在选择时)用缺乏抗生素的培养基稀释105倍。然后将该培养物培养过夜，重复所述稀释步骤直至经过约230代。在每个生长步骤后，将细胞铺板于缺乏抗生素的L-琼脂上。从每个步骤挑取184个菌落，并一式二份转移到包含带有氯霉素或不带氯霉素的培养基的96孑L板中。國pRS44，口pRS49，ARK2以及opCClFOS。图3显示了从荧光假单胞菌(i/7ww^ce"s)::TnJ5V《传递至野油菜黄单胞菌(XCfl/M/7M加、):TnRS48后F粘粒克隆的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道l:转移前的质粒62;泳道2和泳道3:分别从荧光假单胞菌和野油菜黄单胞菌转化至大肠杆菌后的质粒62。泳道4:转移前的质粒83;泳道5-7:从荧光假单胞菌转化至大肠杆菌后的质粒83;泳道8和9:从野油菜黄单胞菌转化至大肠杆菌后的质粒83。泳道10:转移前的质粒37;泳道11和12:从荧光假单胞菌转化至大肠杆菌后的质粒37;泳道13:从野油菜黄单胞菌转化至大肠杆菌后的质粒37。S:分子量标准(Fermentas)。图4显示了所制备BAC栽体的插入片段大小以及特定插入片段大小获得的菌落数。图5显示了用Not-l消化得到的11个质粒的琼脂糖凝胶电泳分析。所示泳道数字代表实施例2中"大小测试结果"所述的插入片段。M:分子量标准(NewEnglandBiolabs)。图6显示了在荧光假单胞菌::TnRS48传递前后经HindIII消化的BAC克隆的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1和泳道2:分别为转移前后的质粒B9。泳道3和4:分别为转移前后的质粒B19。S:分子量标准(Fermentas)。图7显示了经HindIII消化的质粒BIO(泳道1)以及来自BIO荧光假单胞菌转接合子的总DNA(泳道2)的Southern印迹分析。对分离自大肠杆菌的全部质粒进行标记，并将其用作针对分离自荧光假单胞菌的总DNA的探针。S:分子量标准(Fermentas)。实施例1材料和方法细菌菌株、质粒和生长培养基本研究中使用的细菌菌林和质粒描述于表l中。将大肠杆菌菌株于37。C培养在Luria-Bertani(LB)培养基中或者L-琼脂上。将荧光假单胞菌和野油菜黄单胞菌菌株于30"C培养在LB中或DifcoPIA琼脂上(荧光假单胞菌)以及YM培养液中和YM琼脂上(野油菜黄单胞菌)。按照以下浓度使用抗生素(相关时)氯霉素，12.5吗/ml(大肠杆菌)，30ng/ml(野油菜黄单胞菌)；卡那霉素，50pg/ml(大肠杆菌和野油菜黄单胞菌)；四环素，10吗/ml(大肠杆菌)，15吗/ml(野油菜黄单胞菌)或25吗/ml(荧光假单胞菌)。使用5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌中对带有插入片段的克隆进行蓝白筛选。使用来自拷贝控制F粘粒文库生产试剂盒(CopyControlFosmidLibraryProductionKit,Epicentre)的溶液，通过L-阿拉伯糖的诱导将EPI300中的克隆从单拷贝数转变为高拷贝数。通过加入0.5mM间甲基苯甲酸盐/酯来诱导从户/MG5表达化/^。标准DNA操作根据Sambrook和Russel,2001,Mo/ecw/"rc/ow/g，a附flw冊/,第三版,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NY中的方法或者通过使用市售试剂盒来进行琼脂糖凝胶电泳和常规DNA操作。使用Big-DyeTerminatorvl.lCycle试剂盒(AppliedBiosystems)或者通过MWG-BiotechAG来进行DNA测序。栽体构建、转化和接合交配通过将/7flrDJ^nT区域和卡那霉素抗性基因引入pCClFOS来构建22用于F粘粒和BAC克隆的广宿主范围栽体(pRS44)。该载体的全部核苷酸序列是已知的。使用大肠杆菌S17.1(V^")(DeLorenzo等，1993JBaceriol175:6卯2-6907)作为宿主，通过将化/^和四环素抗性基因克隆进pKD20(Bakkevig等，/"fl"^7》/187:8375-8384)来构建自杀转座子载体pRS48。更多详情参见表l。如Sambrook和Russd(Sambrook&Russel,2001)针对大肠杆菌进行的描述，利用标准电穿孔(13V/cm，100ohm,25^F)将pRS48中的转座子插入电感受态(electrocompetent)焚光假单胞菌NCIMB10525和野油菜黄单胞菌B100-152(H6tte等，1990/5fl"m/0/172:2804-2807)的染色体中，在含有四环素的PIA或YM琼脂上筛选NCIMB10525::Tn及5^和B100-152::TilR5￥S转化体。利用标准热激转化(Chung等，1989尸度胸/Jaw/5WUSA86:2172-2175)，将源自pRS44的克隆转化进大肠杆菌S17.1中(Simon等，1983Bio/Technology1:784-79)。在无抗生素选择的L-琼脂上于30'C过夜进行接合交配。然后将该混合物铺板于含有卡那霉素的PIA上(荧光假单胞菌)或者含有四环素和氯霉素的YM-琼脂上(野油菜黄单胞菌)，然后分别于30。C孵育48和72小时。利用WizardPlusSVMinipreps(Promega)从荧光假单胞菌和野油菜黄单胞菌的培养物中分离质粒，并电穿孔进EPI300中(13V/cm，100ohm,25)。样品收集和DNA提取在2004年7月至10月间，沿Trondheimsfjord(挪威)收集六个不同位置的表面微层(surfacemicrolayer)水，主要描述于Garrett(Garret,1965丄/附wo/fl"rf10:602-605)。首先将所述样品(每种20-25升)通过250nm网格进行预过滤，以除去最大的颗粒，然后通过粒径60的尼龙滤网(Millipore)进行过滤。利用两步将该过滤物浓缩，首先使用PelliconXL50超滤系统进行切向流过滤，之后在Amiconstirredcell(Millipore)中进一步浓缩。然后，用2xSTE緩冲液(1MNaCl、0.1MNa2EDTA、10mMTris画HCl,pH8.0)稀释上述样品，使DNA终浓度为150-250ng/ml。将细胞悬液与等体积的PBS緩沖液(0.8。/。NaCl、0.02%KC1、0.144%Na2HP04、0.024%KH2P04，pH7.4)中的2%InCert琼脂糖(Cambrex)混合，在一次性胶块模(BioRad)中使琼脂糖胶块成型。根据Stein等(Stein等，Archaeon.JBacteriol178:591-599)的方法提取高分子量DNA，但进行了一些改动。用25ml裂解緩冲液(10mMTris國HCl、50mMNaCl、0.1mMNa2EDTA、1。/。N-十二烷基肌氨酸钠盐、0.2%脱氧胆酸钠、1mg/ml溶菌酶，pH8.0)裂解该琼脂糖胶块3小时。将该胶块移至25mlEPS緩冲液(1。/。N-十二烷基肌氨酸钠盐和1mg/ml蛋白酶K，在0.5MNa2EDTA中，pH8)中，并于55。C孵育16小时。fi口Osoegawa等(1999Constructionofbacterialartificialchromosome(BAC/PAC)libraries.CWmif/V^co/s1/"H"附flwG^/iC'cs1,(DracopoliNC,HainesJL，KorfBR，MortonCC,SeidmanCE,SeidmanJG&SmithDR编辑)，5.15单元，Wiley,NewYork)所述，将蛋白酶K失活并对胶块进行透析和保存。构建基因文库通过将用S認3AI部分消化的环境DNA随机克隆进多拷贝质粒载体pLitmus28的fi"附HI位点来制备小插入片段文库。对所述插入片段进行部分测序并使用BLAST算法进行比对。主要根据拷贝控制F粘粒文库生产试剂盒(Epicentre)的实验步骤来构建F粘粒文库。结果和讨论构建广宿主范围宏基因组载体系统使用市售的pCClFOS载体作为起点来构建广宿主范围的F粘粒和BAC载体(pRS44，图1)。pCClFOS具有两个复制起点——F因子起点(on'2)和来自RK2的oW2在大肠杆菌中起作用并在该宿主中构建文库时有活性，但它在大多数其它宿主中无活性。oWK可以通过在目标宿主中表达复制起始蛋白TrfA来活化。我们所采用的策略是将接合转移起点(onT)引入pCClFOS中，从而允许与非大肠杆菌宿主结合。我们还插入了来自RK2的稳定元件/7flriXB，以降低带有大插入片段的重组质粒在新宿主中丟失的可能性。最后，插入卡那霉素抗性基因以提供可能在某些宿主中有用的替代性选择标记。5"wHI位点可用于粘末端BAC克隆，而￡"721位点可用于平末端F粘粒克隆。保留了来自pCClFOS的用于蓝白筛选的/flc系统。为了容易地将^/4整合进非大肠杆菌宿主中，我们构建了自杀载体(pRS48，图l),其有利于插入表达TrfA蛋白的转座子Tn5衍生物。该蛋白由诱导型iVwG5启动子表达，所述iVwG5启动子是已知在许多宿主中有活性的P附的突变体衍生物(Mermod等，1986/Jfl"enW167:447-454;Ramos等，1988i^551226:241-246;Keil&Keil，1992iVfls柳/rf27:191-199)。此外，诱导性使得可以改变所产生TrfA的量。pRS48在表达Pir蛋白的大肠杆菌菌抹S17.1X(pir)中复制，Pir蛋白是质粒R6K起点(w/J67T)的复制起始所必需的(DeLorenzo等，1993如上)。无选择时的质粒稳定性质粒稳定性对于本文所述的宏基因组克隆载体功能而言可能是关键性的，为了对其进行定量，我们测量了它在无抗生素选择时在大肠杆菌EPI300中丟失的速率(图2)。我们使用了天然RK2质粒和pCClFOS作为该实验的对照。通过使用重复的转移，监测了超过约230代的生长情况，这个数字远远超过了实验室规模批壹培养中的代数。该实验显示，可以容易地检测到pCClFOS质粒的丟失，而pRS44及其含有36kb对照DNA插入片段的衍生物(pRS49)均十分稳定，像完整的RK2—样。因此，该实验清楚地证实了将/mfDE引入载体的相关性。在pRS44中构建宏基因组文库最初的实验显示，pRS44与pCClFOS以相似的频率将用作市售载体对照的标准品36kb插入片段包装和建立进大肠杆菌中。然而，我们希望测试含有来自环境的DNA的载体，因为众所周知，克隆来自这些样品的DNA可能是困难的或低效的，还因为我们希望测试环境DNA插入片段在新宿主中的行为。在我们的实验室中，我们正在进行一个涉及海洋表层微生物研究的项目，已证实海洋表层比下层水包含更高浓度的有机质和细菌。因此，我们决定使用这样的DNA样品来测试所述载体系统。为了确保所得到的DNA样品确实来自于环境细菌，我们首先使用标准的高拷贝数克隆载体pLitmus28在大肠杆菌中构建了小插入片段文库。从插入片段的一端开始对来自该文库的91个克隆进行了测序，随后利用BLAST同源性检索进行分析。该分析显示，18.7°/。的序列与该数据库中已有的其它序列无显著匹配(E值>1)，32.9%具有e—1()~l的E值，48.40/。的匹配E值〈e-"。10个最佳BLAST匹配显示于表2中，从这些数据可以看出所有匹配均针对细菌，其中一些通常发现于海洋环境中(DeLong,2005NatureRev3:459-469)。因此，这些结果与所述DNA样品主要来源于海洋细菌的推测是一致的，这个结论不一定像它看起来那样不重要(DeLong，2005,如上)。然后，使用来自海洋表面微层的DNA在pRS44中构建小F粘粒文库(约400个克隆)。对这些克隆中的16个克隆进行的限制性消化分析表明，插入片段的大小为20~35kb不等。限制性才莫式均不相同，这表明所述克隆不是同宗的(数据未显示)。因此，这个小文库足以测试向非大肠杆菌宿主进行转移的构思。将含有环境DNA的质粒从大肠杆菌向荧光假单胞菌和野油菜黄单胞菌中转移大肠杆菌菌林EPI300不包含oriT介导的与新宿主转移接合所需的f^基因，由于这个原因，首先将选自文库的质粒转化进S17.1菌林中，其具有整合进染色体的RK2fm基因。我们发现，使用文库作为来源DNA可以容易地获得大量转化体，因此这个额外的步骤不会成为之后将质粒从大文库转移至新宿主的限制因素。在将质粒从文库转移至两种所选宿主(荧光假单胞菌和野油菜黄单胞菌)之前，利用电穿孔将pRS48中的转座子(携带化/^基因)插入其染色体中。然后，可将文库质粒接合转移至新宿主中并在其中复制。卡那霉素(荧光假单胞菌)和氯霉素(野油菜黄单胞菌)抗性克隆以高26频率获得，这表明非常大的文库可容易地进行转移。从独立的转接合体分离质丰立，再将其转化入大肠杆菌EPI300中，用HindIII消化并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析(图3)。泳道l、2和3显示，对于随机选择的名为62的质粒而言，在通过两种非大肠杆菌宿主传递前后消化产物是相同的。然而，更多这样的研究清楚地表明，这种个例对通常所发生情况进行了过度简化。泳道5、6和7显示，通过荧光假单胞菌传递后获得的条带模式与另一质粒是不同的(命名为83),即使它们均来源于文库中同样的大肠杆菌克隆。泳道8和9显示了将质粒83从野油菜黄单胞菌转化回大肠杆菌的消化产物。泳道8的质粒看来与转移前的质粒83相同，但是泳道9中的质粒明显地在转移期间或之后发生了改变。令人感兴趣的是，对这些消化模式的观察显示，在所有个例中结构改变均包括质粒大小的增加。克隆83在同一宿主中以原始形式和改变形式均可保存(泳道8和9)的这一事实令人不解，第三个实例展示了另一更出人意料的发现。泳道10显示了名为37的质粒在转移至荧光假单胞菌和野油菜黄单胞菌之前的限制性片段模式。在转移及再转化回大肠杆菌之后，观察到了一些不同的模式，选出的3个例子示于泳道11-13中。泳道ll(来自荧光假单胞菌)中质粒的条带模式与转移前的条带模式(泳道10)无法区分，而泳道12(来自荧光假单胞菌)与泳道13(来自野油菜黄单胞菌)中的条带模式明显不同。质粒大小再次增加，但更令人感兴趣的是，尽管质粒在两个不同物种传递，但是变化似乎是相同的。在宏基因组研究中使用最小RK2复制子的结果的提示本文报道的实验显示，即使含有大的插入片段，广宿主范围载体也可以极稳定地维持，并且推测它可以转移至几乎任何革兰氏阴性宿主中。我们还进行初步尝试来测试pRS44包含大于人包装所限大小之插入片段的能力。目前这些实验已显示，我们可以在大肠杆菌中稳定地维持至少80kb的pRS44衍生物(数据未显示)，这表明RK2复制子系统可用于构建具有成熟窄宿主范围BAC栽体的典型插入片段大小的宏基因组文库。本文显示的结果表明，该质粒似乎在通过新宿主传递时频繁发生改变。令人感兴趣的是，质粒结构的改变之前也在S17.1菌林接合实验中观察到(Priefer等，1985/"""eWo/163:324-330)。既然所述改变并不在针对任何特定克隆的所有转移中发生，所以相比之下可以简单地通过筛选大量转接合子来克服这个问题。在迄今所有测试的个例中，所述质粒均包含插入(总大小增加)，令人感兴趣的是，我们最近通过DNA测序发现所加入的DNA总是源自供体大肠杆菌菌株(数据未显示)。这意味着该问题可能与受体细菌无关，而是在接合过程中供体中所发生事件的结果。基于这一推测，似乎也容易理解质粒怎样在通过两种不同物种转移后以同样的方式发生改变(图3，泳道12和13)。因此，通过研究这些改变如何在大肠杆菌中发生，应该有可能消除这一问题。为此，这些实验正在我们实验室进行之中。表l:本研究中使用的细菌菌林和质粒细菌菌林或质粒特性8来源或参考文献大肠杆菌EPI300噬菌体Tl抗性，/"cZ菌林，具有由EpicentreL-阿拉伯糖诱导的TrfA染色体表达，^謹f^4MZ5血別e福2r/w《w/>(7rt^4勿/l4S17.1包含整合进染色体的用于接合转移的H6tte等，1990RK2,r"基因的菌林附tfZ，TprSmr)S17.1U/w>)S17.1菌林的入/wV溶原菌DcLorenzo等1993荧光假单胞菌NCIMB10525NCIMB10525::TilR，野油菜黄单胞菌B跡152荧光假单胞菌野生型NCIMB10525的衍生物，包含整合进染色体的来自pRS48的转座子NCIMB自发产生的XflW^胞外多糖(exopolysaccharide)阴性突变B100-152::Tni5V《B100-152的衍生物，包含整合进染色本研究体的来自pRS48的转座子TaR5VSSimon等，1983质粒pCClFOS用于拷贝对照F粘粒文库的克隆载体，Epicentre其包含和on'K，/7flfABC，c<w和pHH100G5pJB321pJB658tec户，Cmr,8.1kb包含突变体Pw启动子(命名为尸wG5)的基于RK2的质才立，Kmf，8.8kb包含pflW)五的RK2最小复制子，Apr,5.6kbGimmestad等2004Blatny等，1997a包含尸附启动子和编码调节蛋白XylSBlatny等，1997b和TrfA的RK2表达载体，Apr,6.8kb29pKD20编码小Tn5转座子的自杀载体，其含Bakkevig等，2005有7V^/^VW/克隆位点用于引入PwG5/a:j"控制下的基因，Ap、Km、8.0kbpLitmus28CW^复制子，Apr,2.8kbNewBiolabsEnglandpLitmusTcBam2含有和&说的Litmus28衍生物，Bakkevig等，2005pRS43pRS44pRS49pRS47pRS48Apr,Tcr,5.1kb插入了1.2kbPCR片段(编码来自本研究pJB321的/7flfi)五oWr)的pCClFOS衍生物，Cm、9.3kb插入了1.0kbPCR片段(编码来自本研究pHH100G5的Kmr)的pRS43衍生物，Cmr,Kmr,10.3kb包含克隆进五"271位点的F粘粒对本研究照DNA(Epeicentre)的pRS44,Cmr,Kmr,46.3kb将来自pJB658克隆的作为1.2本研究kbTV^I/iVWlPCR片段克隆进pKD20中，Kmr,9.1kb包含2.2kb5a附HI片段(含有克隆本研究进Z)mIIIASVicI位点的来自pLitmusTcBam2的和^战)的pRS47衍生物，Tc、10.5kbRK2Apr,Kmr,Tcr，60.1kbPansegrau等1994aApr:氨苄青霉素抗性；Cm1":氯霉素抗性；Km1":卡那霉素抗性；Tcr四环素抗性BakkevigK，SlettaH，GimmestadM，AuneR，Ertesv&gH,DegnesK>ChristensenBE，EUingsenTE&VallaS(2005)RoleofthePjm/cwcwa^"omsce/^alginatelyase(AlgL)inclearingtheperiplasmofalginatesnotexportedtotheextracellularenvironment187:8375-8384.BlatoyJM,BmutasetT,Winther画LarsetiHC,HauganK&VallaS(1997a)Constructionanduseofaversatilesetofbroad-host-rangecloningandexpressionvectorsbasedontheRK2replicon.4f5p/￡hv/ro/iJl^cro&io/tf丄370-379.BiatnyJM,BrautasetT,Winfher-LarsenHC，KarunakaranP&VallaS(1997b)Improvedfcroad-host-range.RK2vectorsusefUforhi^handlowregulatedgeneexpressionlevelsinGram-negativebacteria.PtomW38:35-51.31DeLorenzoV,CasesI,HerreroM'&TimmisKN(1993)EarlyandlateresponsesTOLpromoterstopathwayinducers:identificationofpostexponentialpromotersin■RyeKcfomo.wospw《idawith〖acZ-fefbicistronicreporters.J"5acteWo/175:6902-6907.GimmestadM，SlettaH,KarunakaranP,BakkevigKErtesv蟲gH,EllingsenTE，Skj能-BrsekG&VallaS(2004)PatentWO2004/011628Al,NewmutanistrainsoiP,(fo柳"aa1y"w^yc鄉andvariantthereof,methodsfortheirproduction,andusesthereofinalginateproduction.tt3tteB，Rath-ArnoldI，POhlerA&SimonR(19卯)Cloningandanalysisofa35,3-kilobaseregiofiinvolvedinexopolysaccharideproductioninjKz"^o附o"。jcflw戸&iypv,m加pe她./万acfen'o/172:2804'2807.PansegmuW，DankaBarthPT,FigurskiPH，Gui加yDG,HaasD,HelinskiDR，ShwabH，StanisichVA&ThomasGM(1994)CompletenucleotidesequenceofBirrfiin扭amIncPaj)lasmids-compilationandcomparativeanalysis.JM"oZ5!'o/239:623-663.SimonR,PrieferU&PiihlerA(1983)Abroadhostrange.mobUizationsystemforftvi'vogerietioengineering:transposonmutagenesisinGramnegativebacteria.5!WTec/ww/o^l':784-791.表2:小插入片段文库中10个末端测序插入片段的最佳BLAST匹配最佳BLAST匹配E值酵登记号假想的酰胺水解酶NP715659副溶血孤菌(W6n'o推定的阳离子外流系统NP_799990跨膜蛋白焦磷酸維牛儿基栊牛儿AAO08844酯合酶32创伤弧菌2e-81预测的氨基酸消旋酶AAO076159e-73保守的假想蛋白推定NP一870899的真核巯基蛋白酶创伤弧菌3e-67自转移蛋白AAO08378(autotransporter)粘附素发光光杆状菌5e-.64乙酰CoA羧化酶a亚基CAE12983深海发光杆菌le■61推定的天冬氨酸转氨甲CAG18卯4酰酵大肠杆菌55T^iVA^^^^t^iNP一757180铜绿假单胞菌3e國52推定的醛缩酶NP—252120实施例2材料和方法细菌菌林、质粒和生长培养基本研究中使用的细菌菌株和质粒描述于表3中。表3:本研究中使用的细菌菌抹和质粒细菌菌林或质粒特性3来源或参考文献大肠杆菌EPI300S17.1荧光假单胞菌NCIMB10525::Tn/柳质粒pCClFOSpHH100G5噬菌体Tl抗性，/flc2"菌抹，具有由EpicentreL-阿拉伯糖诱导的TrfA染色体表达，血c別度WflmiW39雄ra，一7697gflWga/ZXr/w丄""/;Gto"v4Wi^)包含整合进染色体的用于接合转移的Simon等，1983RK2^fl基因的菌林(i尸"腸7b:是-iT附:::Tw7,戸，w-附o^"，TprSmr)NCIMB10525的衍生物，包含整合进本研究染色体的来自pRS48的转座子用于拷贝对照F粘粒文库的克隆载Epicentre体,其包含on'2和of/K，/7flf/4JC，c仍和tori0,Cmr,8.1kb包含突变体启动子(命名为尸附G"5)的基于RK2的质粒，Km1",Gimmestad2004等8.8kbpJB321包含;ww2)五的RK2最小复制子，Apf，Blatny等，1997a5.6kbpJB658pKD20pLitmus28pUtmusTcBam2pRS43pRS44pRS47pRS48包含启动子和编码调节蛋白XylSBlatny等，1997b和TrfA的RK2表达载体,Ap、6.8kb编码小Tn5转座子的自杀载体，其含Bakkevig等，2005有7V甴i)Wo/1/克隆位点用于引入户附G5/A5^控制下的基因，Apf,Km1",8.0kbCW^复制子，Apr,2.8kbNewBiolabsEngland含有和&说的Litmus28f汙生Bakkevig等，2005物，Apr,Tcr,5.1kb插入了1.2kbPCR片段(编码来自本研究pJB321的/7flriXEVinr)的pCClFOS衍生物，Cm、9.3kb插入了1.0kbPCR片段(编码来自本研究pHH100G5的Kmr)的pRS43衍生物，Cmr,Kmr，10.3kb将来自pJB658克隆的作为1.2本研究kb7V^I/7VWIPCR片段克隆进pKD20中，Kmr，9.1kb包含2.2kb5fl附HI片段(含有克隆本研究进"raIIIASflcI位点的来自pLitmusTcBam2的和)的pRS47衍生物，Tc、10.5kbpTA44pRS44的衍生物，其中通过位点特异本研究性诱变(727位的t—c)除去了HindIII位点RK2Apr,Kmr，Tcr,60.1kbPansegrau等，1994aApr:氨节青霉素抗性；Cm1":氯霉素抗性；Km1":卡那霉素抗性；Tc"":四环素抗性参考文献如表l所示。将大肠杆菌菌林于37。C培养在Luria-Bertani(LB)培养基中或者L-琼脂上。将荧光假单胞菌于30"C培养在LB中或DifcoPIA球脂上。按照以下浓度使用抗生素(相关时)氯霉素，12.5吗/ml(大肠杆菌)；卡那霉素，50吗/ml(大肠杆菌和荧光假单胞菌)；四环素，10吗/ml(大肠杆菌)或25ng/ml(荧光假单胞菌)。通过加入0.5mM间甲基苯甲酸盐/酯来诱导从户附G5表达化M。标准DNA操作根振Sambrook和Russel(2001,Mo/ecw/"rc/<m>ig，《/a^m"fj附aw冊/,第三版,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NY)中的方法或者通过使用市售试剂盒来进行琼脂糖凝胶电泳和常规DNA操作。利用位点特异性诱变从pRS44中除去HindIII位点使用Stratagene的QuickChange定点豫变试剂盒对pHH100G5质粒进行位点特异性诱变。pHH100G5质粒携带首先整合进pRS43载体以形成pRS44的卡那霉素抗性基因。然后，将经诱变的卡那霉素抗性基因从该质。BAC的构建含有高达约200kb插入片段的BAC克隆由BioS&TInc.(加拿大)构建。将来自大花牵牛(//wm^flm7)植物细胞核的高分子量DNA作为克隆材料，将pTA44载体用作BAC克隆载体，如下文所述。制备以及部分消化高分子量DNA从大花牵牛植物细胞核制备高分子量(HMW)DNA的方法由Zhang,H.B.,X.P.Zhao,A.H.Patterson以及R.A.Wing.1995.ThePlantJournal7:175-184描述。从100克叶中制备细胞核，并包埋在5ml2%(重量/体积)低熔点琼脂糖胶块中。以每个胶块10单位的Hindlll于37。C部分消化所述胶块10分钟。通itia入1/10体积水冷的0.5MEDTA(pH8.0)来终止反应。通过电洗脱进行大小分离、分离选定大小的DNA在CHEFDRIII(Bio-Rad,Canada)上0.5xTBE中的1%(重量/体积)脉沖场琼脂糖皿上对部分消化的HMWDNA进行大小分选。以卯s的恒定脉冲时间和6V/cm利用PFGE将大小分选在irC下进行12小时。利用PFGE以30s的恒定脉冲时间和6V/cm将含有50-350kb的胶条电洗脱5小时。在连接之前，将洗脱的DNA片段用lxTE(lOmMTris-HCl、ImMEDTA，pH8.0)緩冲液透析至少两个小时。制备BAC构建载体使用pTA44。在转化进DH10B后，使用Maxiprep试剂盒(Qiagen,Canada)进行载体DNA纯化。对纯化的载体DNA进行Hindlll消化以及去磷酸化处理，之后进行酚/氯仿纯化(标准步骤)。将纯化的经消化DNA以25ng/pl溶解。连接在含有1x连接緩冲液和3单位的连接酶(USB，Canada)的50^137体积中，于14。C将80-100ng部分消化的选定大小DNA片段与20ng载体DNA(pTa44-Hind111和pIndigoBAC國HindIII)连接过夜。转化以及克隆表征使用来自Invirtogen的ElectroMaxDH10B作为转化的宿主菌林。用2nl连接混合物转化20^1大肠杆菌细胞。通过于37。C在600^1SOC培养基(Invitrogen,USA)中以100rpm移动1小时来复苏细胞。然后通过以37。C培养过夜，在补充有氯霉素(12.5mg/L)、X-GAL和IPTG的LB培养基中对60W转化细胞进行选择。记录白色克隆数，并且杏沐并培养约20个克隆以用于小量制备。使用以下步骤进行小量制备离心5ml过夜培养物(500g，5分钟)。弃去上清液。加入200^1来自Qiagen的Pl溶液。加入200^1来自Qiagen的P2溶液。室温孵育5分钟。.加入200^1水冷的来自Qiagen的P3溶液。在冰上孵育10分钟。离心15分钟(13,000g)。将上清液转移到新管中并加入1倍体积的异丙醇(约420^x1;转移体积(600^1)的约70%)。在-20。C放置l小时。离心20分钟(13，000g)。.弃去上清液。加入70%乙醇(420jnl)。离心5分钟(13，000g)。.在空气中干燥。重悬于TE或水中(加入约5(Hi1)。将小量制备的DNA用Notl消化，然后利用PFGE胶进行表征。大小测试结果所述克隆的估计大小(kb)示于图4:1.1959.13017.802,4810,190.18.1503.135n.11019.1004,120127020.1955.5813.7321.836.75R13522,1317,7015.1208.4816.95作为比较，20个plndigoBAC克隆的平均大小经计算约为100kb，这与pTA44相似。连接和转化效率通过在每1/10转化后体积(即60nl)的选择培养基中获得的白色克隆数来测定效率(表4)。表4:选择培养基上的转化细胞白色克隆勤60nl(测试以一式三份进行)纖鄉錄磁T渴纖,，讓H^^^^:寧蘇-1赵—#洛禹々108364016520测试之间的差异可能是由于来自Invitrogen的DH10B细胞批次不稳定和质量较低。将BAC克隆转移至荧光假单胞菌将选定的BAC克隆从大肠杆菌菌林S17.1接合至荧光假单胞菌.vTnl^M。*交配在30。C下在无抗生素选择的L-琼脂上进行过夜。然后，将混合物铺板于含有卡那霉素和间曱基苯甲酸盐/酯的PIA上，之后以30。C孵育48小时。利用上述小量制备法从荧光假单胞菌培养物中分离质粒，并将其电穿孔进EPBOO(或S17.1)中。结果构建pTA44在克隆载体pRS44中存在的两个限制性酶HindIII识别位点(一个在克隆位点中，一个在卡那霉素抗性基因中)使得不可能用HindIII消化的DNA进行BAC克隆。因此，进行位点特异性i秀变将卡那霉素抗性基因中的Hindin位点去除，从而得到pTA44栽体。构建BAC克隆通过使用来自植物细胞核的高分子量DNA以及pTA44克隆载体，获得了具有高达约200kb插入片段的BAC克隆。利用脉沖场皿电泳来确定插入片段的大小，图5显示了22个所得BAC克隆的结果。连接和转化效率与利用市售BAC克隆载体(plndigoBAC5(Epicentre))进行的平行试验相似。将BAC克隆转移至荧光假单胞菌中通过接合将含有100kb~195kb大小插入片段的6个选定的BAC克隆(表5)转移至一个测试的替代物种(荧光假单胞菌)中。所有选择的BAC克隆均在荧光假单胞菌::r"JW^中得到转M体。表5:转移至荧光假单胞菌中的6个BAC克隆的名称以及插入片段大小。此处，Bl代表与图5中标记为"1"的质粒相同的质粒，在"大小测试结40果"标题下，B9-9,等等。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>所转移BAC克隆的稳定性通过对来自荧光假单胞菌转M体(B10)的限制性消化总DNA的Southern分析或者通过将质粒从荧光假单胞菌再转移至大肠杆菌之后进行限制性酶切分析(B9和B19)来研究3个转移质粒的稳定性。从限制性酶切图语看，似乎质粒B9和B19可以以完整形式再转移(图6)，这表明具有至少130kb插入片段的质粒在两个物种中均是稳定的。Southern印迹分析显示，具有l卯kb大小插入片段的质粒可以在荧光假单胞菌中维持(图7)。在这种情况下，我们无法得回大肠杆菌转化体(技术问题)，但是Southern印迹分析表明该质粒是存在的。在大肠杆菌质粒以及相应的焚光假单胞菌图i普之间存在某些条带差别，这很有可能是接合过程中的问题造成的(参见实施例1)，这与质粒在荧光假单胞菌中的稳定性无关。a明，所构建的栽体(pRS44/pTA44)可以在多于一个(可能很多)物种中维持非常大的插入片段。权利要求1.用于在广宿主范围的细菌中克隆DNA的克隆载体，所述载体为自主复制人工染色体，其包含(i)RK2复制起点oriV；(ii)RK2接合转移起点oriT；(iii)来自RK2的parDE；(iv)克隆区域；(v)另一个复制起点，该复制起点使得所述载体以不超过1或2的拷贝数进行复制；其中所述载体的大小不超过15kb，不含有RK2的trfA，并且能够克隆至少12kb的插入片段，其中所述载体中的RK2DNA含量为不超过10％的RK2。2.权利要求1所述的克隆载体，其中所述栽体能够克隆至少30kb的插入片段。3.权利要求1或2所述克隆载体，其中所述栽体能够克隆至少80kb的插入片段。4.权利要求1至3中任一项所述的克隆载体，其中所述DNA是宏基因组DNA或来自环境样品的DNA。5.权利要求1至4中任一项所述的克隆载体，其中所述栽体是人工染色体。6.权利要求5所述的克隆载体，其中所述人工染色体是细菌人工染色体(BAC)或源自Pl的人工染色体(PAC)。7.权利要求1至6中任一项所述的克隆载体，其中所述另一复制起点是w/2或Pl复制起点。8.权利要求1至7中任一项所述的克隆载体，其中所述载体包含on'2、r印五和/7flr/45。9.权利要求8所述的克隆载体，其中所述载体包含;flH:和/或m^p。10.权利要求1至9中任一项所述的克隆栽体，其中所述载体包含Pl质粒复制子，任选地包含P1包装位点(pac),并任选地包含两个Pl/ox户重組位点。11.权利要求1至10中任一项所述的克隆载体，其还包含cos位点。12.权利要求ll所述的克隆载体，所述克隆载体是组合的F粘粒和BAC载体。13.权利要求1至12中任一项所述的克隆载体，其中所述载体包含一个或多个选择标记。14.用于克隆DNA的载体系统，所述载体系统包含权利要求l至13中任一项所述的克隆载体以及包含RK2"/v4基因的第二载体。15.权利要求14所述的载体系统，其中所述第二载体包含转座子。16.权利要求14或15所述的载体系统，其中所述^/4基因受诱导型启动子的控制。17.权利要求16所述的载体系统，其中所述诱导型启动子是/Vfi或其突变体。18.包含权利要求1至13中任一项所述克隆载体的宿主细胞。19.权利要求1至13中任一项所述载体用于宏基因组克隆的用途。20.用于克隆DNA的方法，所述方法包括(i)。将所述DNA引入权利要求1至113中任一项所述的克隆载体中；(ii)将所述克隆载体引入第一细菌宿主细胞中；(iii)培养所述第一宿主细胞，从而克隆所述DNA;(iv)将所述克隆的DNA转移进一种或多种第二宿主中。21.权利要求20所述的方法，其中在所述第一宿主细胞中的复制从所述另一复制起点(v)起始，并且其中在所述一种或多种第二宿主中的复制从onT起始。22.权利要求20或21所述的方法，其中所述笫一宿主细胞是大肠杆菌。23.用于制备DNA克隆文库的方法，所述方法包括(i)将所述DNA引入权利要求1至13中任一项所述的克隆载体中；(ii)将所述克隆载体引入第一细菌宿主细胞中；(iii)培养所述第一宿主细胞，从而制备所述DNA克隆的第一文库;(iv)将所述第一文库转移进一种或多种第二宿主中，以制备一种或多种第二文库。24.RK2复制子用于构建在宏基因组克隆中使用的广宿主范围栽体的用途。25.用于宏基因组克隆的基于RK2的克隆栽体，其中所述载体能够在广范围宿主中以高拷贝数克隆大的插入片段。全文摘要本发明涉及用于在广泛的细菌宿主范围中克隆DNA的克隆载体，该载体为自主复制人工染色体，其包含(i)RK2复制起点oriV；(ii)RK2接合转移起点oriT；(iii)来自RK2的parDE；(iv)克隆区；(v)另一个复制起点，其允许该载体以不超过1或2的拷贝数进行复制；其中该载体的大小不超过15kb，不含RK2的trfA，并且能够克隆至少12kb的插入片段，其中该载体中的RK2DNA含量为不超过10％的RK2。本发明还涉及含有所述克隆载体的宿主细胞和载体系统。提供了克隆DNA和制备文库的方法以及所述载体和RK2复制子在宏基因组克隆中的用途。文档编号C12N15/63GK101506366SQ200780026855公开日2009年8月12日申请日期2007年6月8日优先权日2006年6月9日发明者克里斯廷·弗勒格斯塔·达格内斯,兰韦赫·斯克雷德,斯韦恩·瓦拉,特里内·奥奎克,特龙·埃尔林·埃林森申请人:森温特股份有限公司