具有更高水平Botrytis抗性的番茄植物的利记博彩app

专利名称：：具有更高水平Botrytis抗性的番茄植物的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及植物育种和分子生物学。更特别地，本发明涉及检测与番茄^^yfec/mm"抗性相关的数量性状基因座(QTL)的方法，涉及产生So^yto抗性番茄植物的方法，涉及由此获得的B^o^s抗性番茄植物及其部分。
背景技术：
：Bo^yfe"'"erea是具有非常广泛宿主范围的死体营养型(necro加phic)病原真菌，包括至少235种可能的宿主。由于其广泛的宿主范围及由于其影响经济学重要的植物，因此及c/"w"是许多商业作物面临的主要问题。在农作物中，真菌通常是指Botrytis。番茄CSo/a做m(yco;em'cwm，先前称作Z^co/era/cow^cw/e"^w)也易感5o^yto，该真菌通常影响番茄植物的茎、叶和果实。在加温温室中，茎上Bo7to感染发生特别常见。^^yfe主动地杀死感染的细胞，导致软腐病、疫病、叶斑病、猝倒病和茎癌(stemcancers)。感染的叶变得由分生孢子梗和分生孢子覆盖，随后倒伏和枯萎。该真菌从患病的叶生长进茎，并产生长度从几毫米至几厘米的干枯的淡褐色病斑。病斑也可以在茎上的剪枝疤痕处形成。茎病斑也可以由灰霉菌覆盖。在一些情况中，所述感染包绕茎并杀死植物。番茄植物的衰老组织与较幼小的组织相比通常对于6Wo;to的侵袭更易感。为了预防温室中生长的番茄发生Sofo;to，必须严密调节温度和相对湿度。进一步重要的是提供水分而不要使叶片变湿。对于田野中生长的植物，应该应用良好的排水和杂草防除技术。此外，植物的营养水平必须保持高水平。然而，这些预防措施不能充分防止在感染情况中发生相当大的产量损失。在温室和田野生长的番茄中控制So^y似的杀真菌剂是可获得的。一些杀真菌剂的例子包括DowicideA⑧和百菌清杀菌齐lJ(chlorothalonil)，其也可以在收获后应用于番茄果实。然而，已知Botrytis对于一些常用的杀真菌剂已经产生抗性。另外，杀真菌剂的应用从经济学和环境的观点上均是不希望的。目前需要呈现^^7他抗性的商业番茄品种。在一些野生型番茄物种中己经发现对于Bo^to的部分抗性(Egashiraetal.2000;Nicotetal.2002;Urbasch1986)。然而这些植物不产生商业番茄。WO02/085105描述了51./z^rac/zm'to基因组染色体10上的遗传区域，据信其参与^^少^部分抗性。将这个遗传物质通过渐渗作用栽培番茄品种中显示出提供对Bo^y^有部分抗性的栽培番茄植物。然而，迄今为止针对提供番茄^^^^抗性的育种技术仅取得有限的成功。目前对于这些不良结果的原因还不清楚。一方面，也许是由于对于^^yfe抗性的遗传基础和遗传性的了解不足所致。另一方面，也许是由于对于育种获得的番茄植物中Bo^yto抗性水平的评价缺少合适的生物学测定方法所致。所述了解和方法的缺乏也使得在野生品种和后代植物中选择包含参与SWo;to抗性的基因的植物变得复杂。在先前的研究中，本发明人发现番茄中^^7似抗性是多基因遗传的，这也许部分解释了培育抗性植物结果不良的原因。本发明的目的是改良育种的成功性，提供S^^yto抗性的商业番茄品种。本发明的另一目的是在商业番茄品种中提供另外的和/或改良的^^_yto抗性。本发明的再一目的是提供野生型番茄的基因组中另外的遗传物质，其与这种植物中的So/0;to抗性相关。这种另外的遗传物质可用于扩大产生栽培番茄的5Wo;to抗性品种的基础。发明概述本发明人发现在S./z"6rac^^M基因组中，遗传物质存在于先前未经鉴别为参与So^yto抗性的许多染色体上。事实上，本发明人已经成功地鉴别了番茄近缘野生型品系即So/朋ww/7^rac/^'^LYC4/78基因组中的数量性状基因座(QTL)。这些另外的QTL通过使用渐渗作用品系发现。本发明人随后通过将这些抗性野生型(供体)番茄品系的植物与非抗性受体番茄植物杂交而能产生^o;船抗性番茄植物。这些植物与迄今为止产生的任何栽培番茄相比呈现更高水平的抗性。现有技术的改良在于另外筛选标准的可用性，通过这些标准可以监测和指导育种。可以选择这样的抗性野生型So/""wm/^6rac/za//^与易感的栽培番茄的杂交后代植物，其具有与野生型品种中S^o;fe抗性有关的一或多个、或者甚至所有基因组区域。作为结果，提供了产生番茄植物的方法，通过这种方法可以更好地控制所需的遗传成分。本发明方法的优势是在遗传学意义上，可以产生类似于更接近期望性状的野生型品种的后代。因此，栽培番茄植物中抗性性状可以更稳定地导入其中，即可以提供评价哪些基因组区域可以更易于渐渗而哪些难以转移进入后代植物、哪些基因组区域是必需的、哪些基因组区域是协作性的、及哪些基因组区域可用于进一步改良栽培番茄部分抗性品系中的抗性水平。通过评价各种渐渗作用品系中So/^y他抗性水平，其中每个品系都具有与供体植物的分子标记的存在相关的来自S./2^rac/zm'toLYC4/78的特异性基因组渐渗，本发明人能鉴别与抗性野生型番茄品系中Bo^7fe抗性相关的另外的QTL，并从而确定基因组中赋予多重抗性的DNA序列的位置。在下文的描述中，与番茄中SW7fe抗性相关的数量性状基因座(QTL)将简称为Bo^y^抗性QTL或者Bo^yto抗性相关QTL。在野生型番茄品系S./2a^oc/wtes中发现了关于5个新的5c^yfe抗性QTL。一个QTL位于染色体4上，先前将其鉴别为具有SWo^s抗性相关的QTL。然而现在发现这个染色体上先前鉴别的与所述抗性相关的区域事实上含有两个单独的QTL。另外的QTL在染色体6、9、11和12上鉴别。所述新的QTL均与反映植物降低最初感染建立的能力的数量参数相关联，该数量参数在后文称作发病率(DI)参数，以及与反映植物减缓感染进展的能力的数量参数相关联，该数量参数在后文称作病斑生长OLesionGrowth,LG)速度参数。同样，如现有
技术领域：
所报道，染色体10上QTL的存在不能通过所用方法证实。所有目前检测的QTL可通过评价BCsSi或BCsS2(回交5，自交一次或两次)后代中疾病抗性而证实，所述的后代中所研究的QTL是分离的。本发明第一方面涉及产生^^0^'s抗性番茄植物的方法，所述方法包括10如下步骤a)提供So^y^抗性供体番茄植物，优选S./za6rac/^Yes种的So/o^fe抗性植物，更优选&/wZ)rac/^'feyLYC4/78品系的Bo^yto抗性植物；b)将所述供体植物的核酸转移至一或多个BW7他易感受体番茄植物中，优选X/ycc^whm种植物中，其中所述转移导致来自供体植物的遗传物质被导入所述一或多个易感受体植物的相应基因组区域中；c)从所述受体番茄植物(或者用所述受体番茄植物获得的回交植物的另外的自交植物，即在所述转移后获得的重组植物)中选择植物，所选择的植物在基因组内包含衍生自Bo^yfe抗性供体番茄植物的至少一个So^y^抗性QTL，其中所述选择包括检测所述受体番茄植物的染色体4、6、9、11和/或12上与所述至少一个Bo/o;他抗性QTL连锁的遗传标记；-其中所述植物的染色体4上所述QTL的位置由包含S./za6rac/za^s的染色体4上的或者6*./少co/^^/wm的染色体4上的、更优选由&Zw6rac/z(2/tesLYC4/78的染色体4上的或者&/ycopeAs/cwmcv.Moneymaker的染色体4上的遗传标记CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因组区域指示。在优选的实施方案中，所述植物的染色体6上所述QTL的位置由包含51./^6rac/^'tes的染色体6上的或6*./ycopera/cwm的染色体6上的、更优选51./za6rac/zm'wLYC4/78的染色体6上的或S./yco/em'cwmcv.Moneymaker的染色体6上的遗传标记P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51陽103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e和P22M50-513h的基因组区域指示。在其它优选的实施方案中，所述植物的染色体9上所述QTL的位置由包含S./za6rac/w/tey的染色体9上的或51./ycopea/cMm的染色体9上的、更优选&/zWrac/w"^LYC4/78的染色体9上的或5".fyco;era/cwmcv.Moneymaker的染色体9上的遗传标记P18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48陽138h、P14M48画113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h禾QP14M50-276h的基因组区域指示。在其它优选的实施方案中，所述植物的染色体11上所述QTL的位置由包含S.kz6rac/7a/tes的染色体11上的或5".(yco/em'cww的染色体11上的、更优选<S./za6rac/za^sLYC4/78的染色体11上的或S.(ycoperaicMwcv.Moneymaker的染色体11上的遗传标记P14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50隱29xCD、P18M51画358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51陽235h和P22M51-174e的基因组区域指示。在另外其它优选的实施方案中，所述植物的染色体12上所述QTL的位置由包含S.的染色体12上的或S./，印era/cMm的染色体12上的、更优选S./7fl6rac/za/feyLYC4/78的染色体12上的或S.cv.Moneymaker的染色体12上的遗传标记CT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h和P22M51-135h的基因组区域、优选由包含遗传标记P14M61-420h、P14M61-楊h、P14M61陽223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-2X9e、P14M48陽153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因组区域指示。包含至少一个S0^7to抗性QTL或者其赋予抗性的部分的核酸的转移可以通过将所述S0Z7to抗性供体番茄植物与^^7^易感受体番茄植物杂交产生后代植物而非常合适地进行。因此优选的选择方法包括所述渐渗DNA的标记辅助选择(MAS)(见例如Tanksleyetal.1998)，其中在后代植物中检测到与所述QTL连锁的一或多个标记。MAS可例如通过从所述后代植物中分离遗传物质并且通过分子技术确定其中一或多个供体植物标记的存在而进行。或者，可以使用分子标记检测方法而不预先分离遗传物质。任选地，除了标记检测之外，可以对^)/^他抗性进行表型检测，以选择合适的植物。因此，非常合适的检测是如本文所述的数量生物测定法，从而确定如发病率和/或病斑生长速度这12些参数。来自i5o^y^抗性QTL的至少一个标记的存在组合抗性表型的存在的确定证实提供了包含至少一个QTL或者其赋予So^yto抗性的部分的核酸从供体植物成功转移至受体植物的证据。在产生Bo^yfe抗性番茄植物的方法的另一个实施方案中，核酸转移的证实可以通过转基因方法(例如通过转化)、原生质体融合、双单倍体技术或者通过胚胎拯救技术而可以非常合适地进行。在产生^^y^抗性番茄植物的方法的优选实施方案中，所述供体植物是6V/awwm/z^rac/za/toLYC4/78，并且转移至受体植物中的核酸优选包含至少一个Jo/^^抗性QTL，所述QTL选自与So&_yfe抗性相关的Solanumhab腦haitesLYC4/78染色体4、6、9、11禾口/或12上的QTL或者其赋予^^j&抗性的部分。在产生^3/0;&抗性番茄植物的方法的另一个优选实施方案中，所述方法包括将所述So/zj^抗性供体番茄植物与Soo^s易感受体番茄植物杂交以产生第一代后代植物；从所述第一代后代植物中选择在基因组内包含从所述供体番茄植物渐渗作用的核酸的植物，其中所述渐渗作用的核酸包含至少一个本发明的6o^;to抗性QTL，优选两个、更优选两个以上的QTL，或者其赋予Bo^T他抗性的部分；将所述选择的后代植物与合适的商业番茄品系杂交以产生第二代后代植物；从所述第二代后代植物中选择在基因组内包含从所述第一代后代番茄植物中渐渗作用的核酸，其中所述渐渗作用的核酸包含至少一个本发明的fio&y他抗性QTL，优选两个或两个以上的QTL，或者其赋予^^7to抗性的部分，任选地产生进一步的后代植物。所提及的渐渗作用后代植物中的优选两个、更优选两个以上的^^7他抗性QTL可以是针对发病率的QTL、针对病斑生长速度的QTL，或者这些类型的组合。在最优选的实施方案中，步骤c)包括选择在基因组内包含至少4个So—fe抗性QTL的植物，所述QTL选自与Soo^抗性相关的5b/a冊m/zaZ)rac/^fey、优选LYC4/78品系的染色体1、2、4、6、9、11和12上的QTL。另一方面，本发明涉及通过本发明方法可获得的SWo;to抗性番茄植物13或者其部分。本发明进一步涉及番茄So^;to抗性QTL，其中所述QTL选自与丑o^yfe抗性相关的5Wa"wm/7^rac/^fey、优选LYC4/78品系的染色体1、2、4、6、9、11和12上的QTL。这些QTL位于先前不与Bo^y他抗性相关的基因组上的位置。关于这些QTL的详情在下文详细描述。由这些QTL指示的基因组位置上存在的等位基因是本发明的一方面。本发明的QTL可以是包含所述QTL或者其赋予抗性的部分的分离的、优选双链核酸序列形式。非常合适地，例如可分离自合适供体植物染色体的核酸序列的大小可以表示所述染色体上的遗传距离1-100cM，优选10-50cM。所述核酸可包含至少50个、更优选至少500个、甚至更优选至少1000个、更优选至少5000个碱基对。包含本发明的QTL或其赋予抗性部分的一或多个核酸序列继而可以包含于核酸构建体中，所述构建体可进一步包含位于所述一或多个核酸序列侧翼的区域，这些区域能整合进合适的载体中以将所述一或多个核酸序列转移进合适的S0/7fe易感受体番茄植物中。所述载体可进一步包含合适的启动子区域或其它调节序列。所述QTL也可以是存在于番茄植物基因组中的形式。本发明的QTL优选包含与^)^vfe抗性相关的至少一个标记，优选两个、更优选三个、更优选四个、更优选四个以上的标记，所述标记选自表1-5列出的与所述QTL连锁的标记。本发明另一方面涉及检测So^yto抗性QTL的方法，所述方法包括检测疑似Boo^抗性番茄植物的染色体4、6、9、11禾B/或12上的Bof^他抗性QTL连锁的至少一个标记，-其中所述QTL在所述植物的染色体4上的位置由包含S./w^rac/w/fes的染色体4上的或S./少copem'cwm的染色体4、更优选的6*./z(36rac/7a/tesLYC4/78的染色体4上的或S./少co;era/cwmcv.Moneymaker的染色体4上的遗传标记CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因组区域指示。在检测本发明QTL的方法的一个优选实施方案中，所述QTL在所述植物的染色体6上的位置由包含S./7^rac/zates的染色体6上的或X/yco;eM/cMm的染色体6上的、更优选的5"./w^rac/wzfesLYC4/78的染色体146上的或&/jcope^/c"wcv.Moneymaker的染色体6上的遗传标记P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50隱103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e和P22M50-513h的基因组区域指示。在检测本发明QTL的方法的另一个优选实施方案中，所述QTL在所述植物的染色体9上的位置由包含&/z^rac/za/fey的染色体9上的或&/jcopem'a^的染色体9上的、更优选的5*./z^rac/za/tesLYC4/78的染色体9上的或&(ycopers7'cwmcv.Moneymaker的染色体9上的遗传标记P18M50-141、P14M49陽240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60隱222h、P22M51陽417h、P14M50-174h、P14M60隱157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h和P14M50-276h的基因组区域指示。在检测本发明QTL的方法的再一个优选实施方案中，所述QTL在所述植物的染色体11上的位置由包含S./2^rac/^'tey的染色体11上的或5*.(yco;em'c"m的染色体11上的、更优选的S./w6rac/za/tesLYC4/78的染色体11上的或6*.fyco/7erw'cwmcv.Moneymaker的染色体11上的遗传标记P14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51陽358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h和P22M51-174e的基因组区域指示。在检测本发明QTL的方法的又一个优选实施方案中，所述QTL在所述植物的染色体12上的位置由包含5"./w&oc/z"/^的染色体12上的或S./_yco;eM/cMm的染色体12上的、更优选的5"./w6rac/^'fesLYC4/78的染色体12上的或S./_yco/em'cMWcv.Moneymaker的染色体12上的遗传标记CT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h禾口P22M51-135h的基因组区域、优选包含6"./zWrac/w"^的染色体12上的或S.(yco/era/ow2的染色体12上的、更优选的XZzaZ)rac/za/tesLYC4/78的染色体12上的或S.(ycopew/cwmcv.15Moneymaker的染色体12上的遗传标记P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因组区域指示。再一方面，本发明涉及S./FopeM/cwm种的So^yto抗性植物或其部分，在基因组内包含至少一个QTL或其赋予So/o;泡抗性的部分，其中所述QTL选自与5c^o;fe抗性相关的6b/朋wm/w6rac/2a/fey、优选LYC4/78品系的染色体4、6、9、11和12上的QTL，其中所述QTL在所述植物的染色体4上的位置由包含包含《S./w6rac/w/to的染色体4上的或5".(ycc^m'cww的染色体4上的、更优选的5"./7a6rac/za/feyLYC4/78的染色体4上的或S.(ycopera/cwmcv.Moneymaker的染色体4上的遗传标记CT50、C2Atlg74970、P14M49陽283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因组区域指示，其中所述QTL或者其赋予So/^y船抗性的部分不是在其天然遗传背景中，且其中所述植物任选进一步包含与So^yto抗性相关的一或多个另外的QTL或其赋予Bo^to抗性的部分，所述QTL选自5b/amw7/^6rac/z(2"es、优选&/a"Mm/^6rac/^/fes品系LYC4/78的染色体1、2禾口/或4上的QTL，其中所述植物染色体4上所述另外的QTL的位置由包含5*./za6rac/2a"M的染色体4上的或《S./yeoperw'cwm的染色体4上的、更优选S./za6rac/7fl/tesLYC4/78的染色体4上的或S./yeopera/cwwcv.Moneymaker的染色体4上的遗传标记P18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e、P14M61-292.7h、TG609、P14M48隱345e、P14M48画177e和P18M50-147e的基因组区域指示。另一方面，本发明涉及产生So^yfe抗性近交系番茄植物的方法。所述方法包括如下步骤根据上述本发明方法产生^^7to抗性番茄植物，自交所述植物，使得自所述自交的植物的种子生长为新的植物；从所述新植物中鉴别呈现BWO;似抗性并具有商业上期望特性的植物，重复自交和选择步骤，直至产生呈现抗性并具有商业上期望特性的近交系番茄植物。产生抗性近交系番茄植物的方法可进一步包括选择呈现BW7&抗性并具有商业上期望特性的纯合近交系番茄植物的另外步骤。16另一方面，本发明涉及通过本发明的方法可获得的So^^to抗性近交系番茄植物或其部分。另一方面，本发明涉及呈现^^7to抗性的杂交番茄植物或其部分，其中所述杂交番茄植物可通过将通过本发明方法可获得的So^y^抗性近交系番茄植物与呈现商业上期望特性的近交系番茄植物杂交而获得。本发明进一步涉及本发明番茄植物的可再生细胞的组织培养物。在这种组织培养的一个优选实施方案中，已经自组织中分离的细胞或所述细胞的原生质体选自叶、花粉、胚(embryo)、根、根尖、花药、花、果实、茎和种子。本发明进一步涉及选自表1-5列出的标记在检测本发明^^7to抗性QTL和/或在检测^W"他抗性番茄植物中的应用。本发明方法中使用的So^yfe抗性供体番茄植物优选选自Aycopera'co"c6(ZS7yb^mg、Z/_ycc|p6^s/cowc/zeesmawz'/、i^ycopg^s/cowc/h'/6mx￡、Z^ycopg^s/cowc/zm/e/e酉f、Z/_ycopera/cow(ycopera/cwm，Z/_ycopers7'co"/2a6rac/20/tes、Z^coperw'co"//mp/"e〃zyb//MW,5V/a"w附(ycoperw'co/cfes，更"[尤选野生型番燕用作供体植物。特别优选的供体植物是6b/am/m/z^rac/za/^，尤其是5b/aw扁/7a6rac/za/feyLYC4/78。本发明方法中使用的^"to易感受体番茄植物优选是5b/am/m(yco/e^/cwm种植物，更优选是具有商业上希望的特性的S./_yco/erw'CMm栽培种，或者另一种商业番茄品系。附图简述图1示出了源自S./7^rac/z^toLYC4/78的及czV^rea抗性数量性状基因座(QTL)的位置及代表染色体4的连锁图(推定的QTL位置以黑色部分示出)。图位置以cM表示。该数据可以推定鉴别两个单独的QTL，一个以标记TG62为中心分布(见实施例l)并在实施例4中的IL4-1中鉴别，另一个与其分开，不包括标记TG62而是以标记P14M49-283e为中心分布，在实施例4中的IL4-3中鉴别。在染色体4上检测到的QTL既降低病斑生长速度也降低发病率。AFLP标记的代码在表1中详述。本发明图中说明的与QTL相关的所有标记可单独以及组合用作标记。图2示出了源自S./z^rac/^'fesLYC4/78的5.c/"erea抗性数量性状基因座(QTL)的位置及代表染色体6的连锁图(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色体6的QTL既降低病斑生长速度也降低发病率。图3示出了源自S./za6rac/zmfesLYC4/78的及"'werea抗性数量性状基因座(QTL)的位置及代表染色体9的连锁图(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色体9上的QTL既降低病斑生长速度也降低发病率。该图进一步示出了IL品系11-2和12-3的染色体9上的渐渗作用。图4示出了源自S./w6rac/2a"MLYC4/78的及c/"e^a抗性数量性状基因座(QTL)的位置及代表染色体11的连锁图(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色体11上的QTL既降低病斑生长速度也降低发病率。所述连锁图代表实施例4的IL品系11-2。图5示出了源自S./w6rac/^//esLYC4/78的5.c/werea抗性数量性状基因座(QTL)的位置及代表染色体12的连锁图(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色体12上的QTL既降低病斑生长速度也降低发病率。图6示出了用于获得如实施例4所述渐渗作用在S.(ycopwsz'CMmcv.Moneymaker遗传背景中的S./2Wrac/7a/fesLYC4/78IL群的回交和选择策略。图7示出实施例4中使用的S.(yco/era/cwwcv.MoneymakerxX/^6rac/za//^LYC4/78渐渗作用品系群的基因型图示。根据F2遗传连锁图，所有染色体均以20cM节段刻度绘图。一些区域被加入到染色体3、4、5和9的末端(CAPS标记)。来自5*./za6rac/w/tes的纯合渐渗作用以黑色表示，杂合渐渗作用以斜纹模式表示(灰色)。图8示出了源自51./7Wrac/7a/teyLYC4/78的5.c/"e"a抗性数量性状基因座(QTL)的位置及代表染色体1、2和4的连锁图，并示出本申请中描述的QTL为QTL-lh、QTL-2h和QTL-4hA。发明详述定义如本文所用，术语"^o/o^s"是指灰葡萄孢菌(5o&少toc/wewa义也称作灰色霉菌或灰色斑，是在番茄的茎、叶和果实上常见的疾病。一般认为植物病原性真菌Sc/er加'm'o"/era^n^具有与及c/"ewa相似的感染机制(Prinsetal.,2000)。尽管番茄中<S.sc/era"on/m感染的经济学重要性远远低于S."'wwm感染，但是这两种真菌均分泌一系列蛋白酶、植物细胞壁降解酶、毒素以及草酸。已知这些因素中的一些在这两种真菌感染中起作用。结果，据信赋予Botrytis抗性的机制和基因在提供抗S."/m^'or謂感染中同样有效。因此，当文中提及"5^^yto抗性"时，这种抗性应理解为包括对于5Wera"m'aceae科任何真菌的抗性，优选对于&w/era/Zon/w禾卩及"'werea的抗性，更优选对于及"Veraa的抗性。如本文所用，术语"等位基因"是指基因的任一或多种可选形式，所有这些等位基因均涉及至少一种性状或特性。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体的相应基因座。由于本发明涉及QTL，即可包含一或多个基因而且也可包含调节序列的基因组区域，因此在一些情况中更精确地称作"单元型"(即染色体节段的等位基因)代替"等位基因"然而，在这些情况中，术语"等位基因"应理解为包含术语"单元型"。如本文所用，"基因"是指由占据染色体上特定位置的DNA序列组成的遗传单位，其含有生物体中特定特性或性状的遗传信息。如本文所用，"基因座"是指给定基因占据的给定物种染色体上的位置。如本文所用，术语"杂合"是指当不同的等位基因位于同源染色体的相应基因座上时的遗传情形。如本文所用，术语"纯合"是指当相同等位基因位于同源染色体上相应基因座时的遗传情形。如本文所用，术语"杂种"是指两个遗传不相似的个体之间杂交的任何后代，包括但不限于两个近交系之间的杂交。如本文所用，术语"近交系"是指基本纯合的个体或品系。在本申请中，"重组事件"是指减数分裂交换。19如本文所用，术语"渐渗作用"是指通过杂交使得一个物种、品种或栽培种的基因移动至另一物种、品种或栽培种的基因组中的天然和人工过程。该过程可任选通过与回归亲本回交而完成。如本文所用，"遗传工程化"、"转化"和"遗传修饰"是指将分离及克隆的基因转移至另一生物体的DNA、通常为染色体DNA或基因组中。如本文所用，术语"分子标记"是指观测核酸序列特征中的差异的方法中使用的标识物。这种标识物的例子是限制片段长度多态性(RFLP)标记、扩增片段长度多态性(AFLP)标记、单核苷酸多态性标记(SNP)、微卫星标记(例如SSR)、序列特征性扩增区(SCAR)标记、酶切扩增多态性序列(CAPS)标记或者同工酶标记或者本文所述定义特定遗传和染色体位置的这些标记的组合。术语"抗性"涵盖了对于感染的部分和完全抗性。Boo;他易感的番茄植物可以是对于Bo^y似感染的无抗性或者低水平抗性。如本文所用，术语"植物的部分"是指番茄植物的部分，包括单细胞和细胞组织培养物，如从中可以再生番茄植物的植物中完整的植物细胞、细胞丛和组织培养物。植物的部分的例子包括但不限于来自花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花粉囊、花、果实、茎和种子的单细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花粉囊、花、果实、茎、幼芽和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花粉囊、花、果实、茎、幼芽、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。如本文所用，术语"群"是指共有共同的遗传变异的植物的遗传异质隹A朱no如本文所用，术语"番茄"是指已知在Z;yc印eM/""属名称下的任何植物、品系或群，包括但不限于i^ycopera/cowcerawybme、Z^ycopera/co"escw/ewZM附卩I见在禾尔{乍5b/aww附/少co/e^s/cwm)、丄ycoperw'co"/w>sm^w、Z^coperw'co"卩/，/"6〃一//應或者5b/""謂/少copera'co/cfes。最近提议Z^ycopera/cowescw/ew似w的学名为5b/am/w/_ycopera/cwm。相似地，野生物禾中白勺名称可以改变。丄，/ew"e〃W已经变为5b/awww;e"we〃W，丄./n>ra/ww可为S./za6rac/za/fes，丄.perwv/a"ww可以分为5".W_perwWa/wm'禾口》S.'Ca〃e乂owcfe//i^y/^s^X/erwv/aww附禾口S,corwe/z'cwMW/en',//./xarv^/7orw附可为S."eon'ch7，丄.c/zm/e/en^h7可为》S.c/zm/e/evraAi/，丄.c/n7ewse可为》S.c/w7e"se，丄.c/2ee纖朋/ae可为》S.c/zee纖am'ae或5".g"—及丄.可为5*.//，/"函/。//調(SolanaceaGenomeNetwork(2005)SpoonerandKnapp;http:〃www.sgn.comell.edu/help/about/solanumnomenclature.html)。尤为指出的是S./w&oc/^'tes可以被认为是具有多毛果实的番茄物种，而S./yc印ea/c"m是具有无毛果实的番茄物种。如本文所用，术语"品种"或"栽培种"是指一组相似的植物，通过结构或遗传特征和/或性能而可以与相同物种内其它品种相区分。如本文所用，术语"QTL"具有本领域公认的含义。术语"与番茄中及"'"w"抗性相关的QTL"以及较短的术语"^"to抗性QTL"是指位于番茄特定染色体上与编码So^y他抗性的至少一个基因相关的区域或者至少调节区域，即控制参与So^yto抗性的一或多个基因表达的染色体区域。所述基因的表型表达可以例如是观测到病斑生长速度降低和/或发病率降低。QTL可例如包含其产物赋予遗传抗性的一或多个基因。或者，QTL可例如包含其产物影响植物基因组中其它基因座上的基因表达、从而赋予So^y船抗性的基因或序列。本发明的QTL可以通过使用一或多个分子基因组标记标示其在各自的野生番茄基因座中的遗传位置而限定。随之，一或多个标记标明特异基因座。基因座之间的距离通常通过相同基因座上基因座之间的互换频率而测量。两个基因座的距离越远，则它们之间更可能发生互换。反之，如果两个基因座较近，则它们之间不太可能发生互换。通常，一厘摩(cM)等于基因座(标记)之间1%重组。当QTL可以由多个标记标示时，端点标记之间的遗传距离以QTL的大小标示。如本文所用，术语易感受体番茄植物"是指接受得自包含50^y他抗性QTL的供体番茄植物的DNA的番茄植物。所述"So"fe易感受体番茄植物"可以包含或者不包含一或多个Bo^yfe抗性QTL，在这种情况中该术语表示接受另外的QTL。如本文所用，术语"天然遗传背景"是指QTL的原始遗传背景。这种背景可例如是抗性番茄的基因组。例如，发现本发明的QTL在&/am/m/za6rac/^^LYC4/78的染色体4、6、9、11和12的特定位置上。例如，ZaZ)rac/za/fesLYC4/78代表5b/awwm/za6rac/7a/tesLYC4/78的染色体4、6、9、11禾n12上QTL的天然遗传背景。同样，So/朋wm/w6rac/z"/tesLYC4/78代表所述QTL的天然遗传背景。相反，包括将包含所述QTL或其赋予抗性的部分的DNA从5b/"/^w/^Zwc/w/fesLYC4/78的染色体4转移至另一番茄物种、特别是S.(ycoj^M/wm的染色体上相同位置的方法将导致QTL或者其赋予所述抗性的部分不在其天然遗传背景中。如本文所用，术语"发病率"是作为参数，反映植物降低感染的建立的能力，可例如通过确定当与感染因子接触时实现成功感染而确定。术语"病斑生长速度"或者"病斑生长"在本文用作参数，反应植物减缓或降低感染进展的能力，可例如通过确定扩大的病斑生长速度而确定。术语"定量确定"在本文是指以包括测量、特别是关于量和数的测量进行确定或评定。关于严重性程度和表示更大、更多、更少或者等于或增加或降低量级的确定不包含在术语"定量确定"中，该术语最后是指确定绝对值的客观计数机制的存在。因此"定量确定发病率和/或病斑生长速度"优选包括确定植物与感染因子之间所有潜在感染性接触导致可测量的病斑的百分比(以评定发病率)，和/或确定在适合真菌生长条件下所述病斑的直径、周长、表面积或体积随着时间的增加(以评定病斑生长速度)。术语"标准实施条件"、"标准温室条件"和"标准条件"是指为了疾病抗性表型鉴定而作为标准的植物生长或保温的光、湿度、温度等条件。例如对于温室而言，这个条件是指16小时光照/天，15-25°C。更通常地，该术语是指标准和参考生长条件8-24小时光周期(光合作用光合光量子通量(PPF)为50-lOOOpmolm—2s")，优选光周期为16小时光照和8小时黑暗，气温为大约19"C/白天及15。C/夜间，水汽压为大约4.4gm—3，相应于相对湿度(RH)为大约60%-85%，600-700ppmC02和大气02浓度以及大气压(通常为1008hPa)。水和营养物质可以在茎附近点滴给予，或者以喷雾或薄雾形式给予。标准的生物测定实验条件如茎病斑长度测定、发病率和病斑生长22速度测量等在下文实施例中进一步阐述。更详细地，平均茎病斑长度测定如实施例3.10和3.11所述进行。番茄中So^rfe抗性相关的OTL的鉴别已知野生型番茄物种提供了疾病和有害物抗性性状的合适来源，且已经证实了野生型番茄物种的叶中及"'"erea部分抗性的存在(Urbasch,1986)。过去有两个因素妨碍番茄中及"'"ewa抗性的培育。首先是商业培育的品系中的交叉部分抗性限制了成功。其次，缺乏鉴别和定位与赋予抗性相关的遗传物质的可靠及可再现的疾病测定方法。例如，Urbasch(Urbasch,1986)使用菌丝体感染叶，使用为真菌提供过量营养物质的琼脂塞(plugs)，其明显影响感染过程。其它研究人员使用主观的植物疾病指数，不适于鉴别数量性状基因座(QTL)所需的数量分析。相对充分地进行了实验室条件下5b/a"wmfyco/eAy/cMm中Sofr;;fec/"e"a感染的研究(例如Benitoetal.,1998)。悬滴接种叶并随后在中等温度(15-2(TC)保温导致接种体部位坏死病斑的快速(感染后16-24小时(hpi))发生与发展。在此点感染暂时受限大约48小时。从此，一定比例的病斑(通常为5-10%)开始扩大。称作"扩大的病斑"的这些生长物伴随真菌生物量的增加并导致在随后的48小时内全部小叶的定植。本发明人先前发现当使用测量抗性的生物测定方法时，可以鉴别番茄中与5W7似抗性相关的特异QTL，其中感染进展速度和/或当与感染因子接触时实现感染成功的比率是对番茄植物的部分、优选对于分离部分、更优选对于茎节段进行定量测量的。另外，可以使用实施例4所述检测方法，其中研究完整植物的抗性，且其中茎是经机械损伤的，将5c^y他接种体应用于损伤处在使用渐渗作用品系时，每个品系含有S./_ycope"/cMmcv.Moneymaker背景中S./z^rac/za/tesLYC4/78基因组的特异渐渗作用节段，令人惊奇地，本发明人能揭示S./z^rac/^'tesLYC4/78中与So^yfe抗性相关的另外的QTL。因此，本发明提供了一种产生^^yfe抗性的栽培番茄植物的方法，所述方法包括-产生一系列栽培番茄的渐渗作用品系，其中每个渐渗作用品系含有来自5o"to抗性野生型番茄、优选/zWrac/^toLYC4/78的特异基因组渐渗作用(染色体区域)，该系列一起覆盖了所述抗性野生型番茄的基因组；-通过进行测量每个所述个体渐渗作用品系植物中抗性的定量生物测定法鉴别每个个体渐渗作用品系植物中的Bo^yfe抗性相关的QTL，优选通过测量发病率和/或病斑生长速度，并确定使观测到的So^y^抗性与所述渐渗作用品系中染色体标记的存在连锁的遗传连锁图，并将所述连锁图上与增强的抗性(例如降低的发病率和/或降低的病斑生长速度)连锁的连续标记指定给数量性状基因座；-使用含有与Bo/o^抗性相关的QTL的渐渗作用品系生产他抗性栽培番茄植物，或者使用在疑似SWo;fe抗性番茄植物的标记辅助选择中鉴别的QTL标记信息。令人惊奇地发现在So^yfe抗性番茄植物的基因组中存在多个So^y他抗性QTL，而现有
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中的方法导致在染色体l、2、4和IO上试验性地鉴别QTL。此外，通过使用本发明的方法发现的QTL位于先前未与番茄植物Bo^y^抗性相关联的染色体上，即使在使用相似的遗传背景时也如此(WO02/085105)。因此，本发明的方法提供了关于IL可以导致对番茄中抗性的遗传起源的更详细的研究，且可以鉴别参与先前未鉴别的这种抗性的染色体物质。本发明的检测与番茄So"to抗性相关的数量性状基因座(QTL)的方法，除了鉴别或定位数量性状基因座(QTL)之外，还需要(部分)番茄植物的可用性。这种植物可以通过本领域已知的任何方式及通过使用确定所述植物中所述(部分)抗性的存在的任何方法提供。提供(部分)Sor;;to抗性番茄植物(其在本发明的方法中进一步作为供体植物)使得可以为所述植物的至少一个染色体、但优选所有染色体确定或提供染色体标记，优选AFLP、CAPS禾口/或SCAR标记，最优选CAPS禾口/或SCAR标记。通过确定全长的所述染色体的染色体标记集合，可以有效标记所述染色体的各个位置。这种方法为本领域所熟知，例如在下文详细描述的方法。本发明的检测与番茄5^o;^抗性相关的数量性状基因座(QTL)的方法可包括测量植物^^yfe抗性的步骤。为此，将植物与感染量的So^fe接触。这个量在检测的植物之间及真菌之间可以变化。通常所述真菌的大约1-10至大约500-5000分生孢子的量是足够的。测量抗性可包括定量确定植物中发病率和/或病斑生长速度。将植物与感染量的^^Jto接触及定量确定所述抗性的步骤优选作为抗性生物测定的一部分进行，如本文所述对茎节段或叶进行的抗性生物测定，优选如实施例4所述对茎、更优选对整个植物进行的抗性生物测定。本领域技术人员将理解可以对下文所述的这些测定进行变化。对茎节段进行的抗性生物测定可以如下所述进行首先，种植后代植物的种子并生长为合适的高度为大约50cm的秧苗/植物。去除植物上部5-10cm及下部5-10cm的茎，剩余的30cm可以切割为5-6cm的相等节段。所述茎节段优选垂直置于网格中，茎基底部置于湿的滤纸上。在接种之前，为茎节段适当喷水以保证接种体等同分布于创伤表面。然后每个茎节段接种S.c^er^分生孢子悬浮液。将适量接种体施加于每个茎节段的顶部，例如一滴大约5)al，包含大约106个分生孢子/1111。然后将所述茎节段在合适的大约16'C温度、优选在黑暗中、及优选高湿度(例如100。/。RH)条件下保温。感染进展情况可以通过测量在接种Verniercaliper之后不同时间间隔的腐烂症状的最大进展而定量确定。在感染后一些合适的时间间隔(hpi)，例如96、120和144小时，以定量的方式检查茎的病斑形成情况(发病率)和病斑生长情况。非常合适的参数包括测量病斑的大小，例如通过使用卡尺测量。为了校正由于季节或植物栽培导致的变化，生物测定的定量测量可以与易感对照品系或参考品系中的相应测量相关联。发病率可以适当地通过用扩大的病斑总数除以悬滴接种总数而确定。然后用特定基因型上扩大病斑的比例除以在对照或参考基因型中观测到的扩大病斑的比例，以百分比表示。或者或者另外，病斑生长速度可以通过计算在适当时间例如24小时期间病斑大小(例如mm)的增加而确定。定量分析中可删除未扩大的病斑的数据。然后用获得的病斑生长速度除以在对照或参考基因型中观测到的病斑生长速度，以百分比表示或者以绝对数值例如毫米(mm)表示。或者，可以通过如下所述叶感染生物测定法筛选植物首先，种植番茄种子并使其生长成秧苗/植物。对于每个植物，可以从主茎切下一或两片叶，将其移至预湿的种花泡沬(floristfoam)中。然后将该种花泡沫置于含有自来水的皮氏培养皿中，随后置于含有湿滤纸的喷雾湿润的容器中。包含及c/^r^分生孢子的合适接种体可以通过本领域已知的方法制备，例如Benitoetal.，1998所述方法。然后将5."力w^分生孢子悬浮液悬滴于复叶的上表面上进行接种，适当例如6-10滴，每滴2^1。然后将容器密闭，在合适的15-2(TC温度之间、优选于黑暗中及优选在高湿度条件下保温所述叶。在一些合适的时间间隔，例如96、120和144hpi，以如上针对茎生物测定所述的定量方式检査所述叶的发病率和病斑生长情况。本发明的检测番茄中与^^t似抗性相关的数量性状基因座(QTL)的方法包括确定遗传连锁图并将所述连锁图上与增强的抗性相关联的连续标记指定给数量性状基因座的步骤，所述连锁图将观测到的抗性与供体番茄植物的染色体标记在IL受体植物中的存在联系在一起。将观测到的抗性与供体番茄植物的染色体标记在IL受体植物中的存在联系在一起的遗传连锁图可以通过本领域已知的任何方法确定。技术人员已知鉴别与抗性数量性状基因座(QTL)相关的分子标记并将这些标记作图为遗传连锁图的方法(见例如Baietal.,2003;Fooladetal.,2002;vanHeusdenetal.，1999)。Bo^fe抗性表型与标记基因型之间的关联可以通过使用软件包如JoinMap⑧和MapQTL(见实施例)或者可以进行方差分析的任何标准统计学软件包进行。分子标记可用于构建遗传连锁图及鉴别J5o/^似抗性数量性状基因座(QTL)。合适类型的分子标记和获得其的方法在下文详细描述。分子标记和OTL分子标记用于观测核酸序列中的差异。这种观测由于DNA-DNA杂交技术(RFLP)和减由于使用聚合酶链反应技术(例如STS、微卫星、AFLP)而可行。两个亲本基因型之间的所有差异基于这些亲本基因型的杂交而在作图群(例如Bd，F2;见图2)中分离。可以比较不同标记的分离并可以计算重组频率。不同染色体上分子标记的重组频率通常为50%。在位于相同染色体上的分子标记之间，重组频率依赖于标记之间的距离。低重组频率相应于染色体上标记之间的距离较短。对比所有的重组频率将导致染色体上分子标记的最合理的顺序。这种最合理的顺序可以在连锁图中描述(Paterson1996)。所述连锁图上与降低的发病率和/或降低的病斑生长速度相关的一组相邻或连续的标记定位QTL的位置。当鉴别了QTL时，所述QTL作用(抗性)可例如通过评定针对QTL分离的BC2S,后代中的So^yto抗性而证实。Bo^yfe抗性的评定可以适当地通过使用本文所述的茎或叶生物测定法进行。通过使用本发明方法可获得的番茄^^y^抗性QTL是本发明的一方面。这种QTL的特性是，当存在于植物中时所述植物与感染量的^^r^材料接触时它们指示降低的发病率和/或降低的病斑生长速度，所述材料可以任何形式如分生孢子或菌丝体形式提供。本发明还涉及番茄中的Bo"^抗性QTL，其中所述QTL选自与Bo^yto抗性相关的So/am/wAa^oc/^fesLYC4/78染色体4、6、9、11和12上的QTL。这些QTL可以通过表1-5中列出的标记更清晰地阐述或说明。在这些表中，QTL所在的基因组区域由列出的AFLP标记表示。本发明的QTL包含与赋予番茄植物中(部分)So^y他发病率和/或降低的So/o;fe病斑生长速度相关的DNA形式的遗传信息。所述遗传信息可例如包含基因或调节元件。表1:在<S.(yc(pens/c讓cv.Moneymaker与》S,/za6rac/2a/fesLYC4/78杂交后代的染色体4上发现的QTL及相关的定量抗性信息。易感的S.Z^copens/cm柳cv.Moneymaker植物示出平均病斑生长速度为4.6mm/天，平均发病率为73±6.4%(见表8和9)。27<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表3:在/少cope^c謂cv.Moneymaker与6"./2a6rac/7a^LYC4/78杂交后代的染色体9上发现的QTL及相关的定量抗性信息。易感的XI^cc^erafcwwcv.Moneymaker植物示出平均病斑生长速度为4.6mm/天，平均发病率为73±6.4%。见表1备注。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>'TG254:见表22;2TG223:见表23;3TG10:见表17;4Tm2a:见表18或者Sorbir,O.T.etal.(2000)。表4:在&/ycopem'c誦cv,Moneymaker与5"./7a6rac/^/toLYC4/78杂交后代的染色体11上发现的QTL及相关的定量抗性信息。易感的&Z^co/era/c"wcv.Moneymaker植物示出平均病斑生长速度为4.6mm/天，平均发病率为73±6.4%。见表1备注。标记物"染色体病斑生长速度2发病率2(mm/夭)(%)QTL-llhPMM60-215eP14M61.173hP14M50-307hTG47PUM50-29xCDP18M51-338hP18M50-27xCDP18M51-136hP22M50-488hTG393Pl德l-396hP22M31-23&hP22M51-174e113'234±6,4TG47:见表24;2TG393:见表25。表5:在6*.(yco/em'c訓cv.Moneymaker与6*./^rac/za/toLYC4/78杂交后代的染色体12上发现的QTL及相关的定量抗性信息。易感的X丄少co;e"/cwmcv.Moneymaker植物示出平均病斑生长速度为4.6mm/天，平均发病率为73±6.4%。见表1备注。QTL标记物〖*染色体病斑生长速度2发病率2(mmy夭)QTL-12hCT19122,324±8.6TG68P14M格411eP18M50-244hP18M50-273hP14M61-420hPl德l-406hPUM61扁223hP14M60-193hP22M51-314hTG565P14M48-172hP22M50-321eP固60-219eP14M48-153hP22M50-97hTG2郎P22M5(M31hP22M51-133hCT19:见表26;2TG68:见表27;TG565:见表28;TG296:见表29。最可靠地，QTL-4hA所在基因组区域位于标记P18M51-156h与C2_Atlg74970之间(表14)，如图1所示。因此，位于该区域内的任何标记以及基于可公开获得的信息而已知位于该区域内的任何标记均可用于评定植物基因组中QTL的存在，所述可公开获得的信息例如共有图谱Tomato-EXPEN1992(Tanksleyetal，1992)、Tomato画EXHIR1997(BemacchiandTanksley,1997)、Tomato-EXPEN2000(Fultonetal,2002)或者30Tomato-EXPIMP2001(GrandilloandTanksley，1996;Tanksleyetal.1996,Doganlaretal.2002)。最可靠地，QTL-4hB所在的基因组区域位于标记CT50(表13)与P14M50-85h之间，如图1所示。因此，位于该区域内的任何标记以及基于可公开获得的信息而已知位于该区域内的任何标记均可用于评定植物基因组中QTL的存在。最可靠地，QTL-6h所在的基因组区域位于标记P22M50-188h与P22M50-513h之间，如图2所示。因此，位于该区域内的任何标记以及基于可公开获得的信息而已知位于该区域内的任何标记均可用于评定植物基因组中QTL的存在.最可靠地，QTL-9h所在的基因组区域位于标记P18M50-141与P14M50-276h之间，如图3所示。因此，位于该区域内的任何标记以及基于可公开获得的信息而已知位于该区域内的任何标记均可用于评定植物基因组中QTL的存在。最可靠地，QTL-llh所在的基因组区域位于标记P14M60-215e与P22M51-174e之间，如图4所示。因此，位于该区域内的任何标记以及基于可公开获得的信息而已知位于该区域内的任何标记均可用于评定植物基因组中QTL的存在。最可靠地，QTL-12h所在的基因组区域位于标记P14M61-420h与P22M50-131h之间，如图5所示。因此，位于该区域内的任何标记以及基于可公开获得的信息而已知位于该区域内的任何标记均可用于评定植物基因组中QTL的存在。优选地，本发明的QTL包含与所述QTL相关的表1-5列出的至少一个标记。因为与赋予^^y^抗性相关的QTL的核酸序列可以仅是本发明鉴别的全部QTL的部分，因此标记仅表示遗传区域的连锁遗传或者在这个遗传区域中不存在观测到的重组。因此，需要指出的是表l-5列出的标记表示特定&/fl"Mm品系的基因组中本发明的QTL所位于的染色体区域，且这些标记不必限定QTL的边界或结构。因此，包含必需的赋予抗性的核酸序列的QTL部分可以小于针对特定QTL列出的连续标记。这个部分在本文称作QTL的"赋予抗性的部分"。结果是QTL的赋予抗性的部分不必包含任何所述列出的标记。其它标记也可以用于表示各个QTL，只要这种标记与QTL遗传连锁即可，本领域技术人员可发现或使用与本发明的那些QTL类似的QTL，但是其中不存在表1-5列出的且表明与所述QTL连锁的一或多个标记。番茄中的^^_y&抗性QTL的赋予万o^y他抗性部分可以通过使用分子标记技术鉴别，例如使用表1-5列出的与所述QTL连锁的一或多个标记进行，优选组合抗性生物测定法进行。不包含本发明QTL的^^;;^赋予抗性的部分的番茄植物对于So/^fe感染相对易感。本发明提供的标记可以非常适用于检测疑似5W^y他抗性番茄植物中本发明的一或多个QTL的存在，且因此可用于包括So^j^抗性番茄植物的标记辅助育种和选择方法中。优选地，检测本发明的QTL的存在是使用表1-5列出的与所述QTL连锁的至少一个标记进行。本发明另一方面因此涉及检测So^y^抗性QTL存在的方法，包括检测疑似i5o^他抗性番茄植物中所述QTL的核酸序列的存在情况，其存在可以通过使用所述标记检测。本发明QTL的核酸序列可以通过本领域技术人员己知的方法确定。例如，包含所述QTL或其赋予抗性的部分的核酸序列可以分离自5w^yto抗性供体植物，通过使所述植物基因组片段化及选择具有表示所述QTL的一或多个标记的那些片段而进行。随后或者可供选择地，表示所述QTL的标记序列(或其部分)可以用作(PCR)扩增产物，以从得自所述植物的基因组核酸样品或者基因组片段中扩增包含所述QTL的核酸序列。然后可以纯化扩增的序列以获得分离的QTL。所述QTL的核苷酸序列和/或包含于其中的任何其它标记可以通过标准测序方法获得。本发明因此还涉及包含本发明QTL或其赋予J5c^t^抗性的部分的分离的核酸序列(优选DNA)。因此，指出本文所述各个QTL位置的标记可用于从番茄中鉴别、分离和纯化编码5o^yto抗性的一或多个基因。本发明QTL的核苷酸序列也可以例如通过如下方式而分辨确定与所述QTL相关的一或多个标记的核苷酸序列，设计所述标记序列的内在引物，随后用于进一步确定所述标记序列外面的QTL序列。例如，表l-5列出的标记AFLP的核苷酸序列可以通过如下方式获得从用于确定植物棊因组中所述标记存在情况的电泳凝胶中分离所述标记，并通过例如本领域熟知的双脱氧链终止方法确定所述标记的核苷酸序列。在检测疑似^^7^抗性番茄植物中QTL存在情况的这种方法的实施方案中，所述方法也可以包括如下步骤提供能在严格杂交条件下与所述QTL连锁的标记、优选选自与所述QTL连锁的表1-5列出的标记的核酸序列杂交的寡核苷酸或者多核苷酸，将所述寡核苷酸或多核苷酸与疑似5W/7他抗性番茄植物的基因组核酸杂交，并确定所述寡核苷酸或多核苷酸与所述基因组核酸的特异性杂交的存在情况。优选所述方法是针对得自所述疑似S^O;fe抗性番茄植物的核酸样品进行，但是也可以应用原位杂交方法。或者，在更优选的实施方案中，技术人员一旦确定了QTL的核苷酸序列，则可以设计能在严格杂交条件下与所述QTL的核酸序列杂交的特异性杂交探针或寡核苷酸，并且可以使用这种杂交探针检测疑似^^7fe抗性番茄植物中本发明QTL的存在情况。短语"严格杂交条件"是指在这个条件下探针或多核苷酸将典型地与核酸的复杂混合物中的靶序列杂交，而基本上不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，且在不同环境中是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。关于核酸杂交的指导见Tijssen(Thijssen，1993)所述。通常地，严格条件是在指定离子浓度pH条件下选择低于特异序列热解链点(Tm)大约5-l(TC的温度。所述Tm是在此温度下(指定离子浓度、pH及核酸浓度)，与耙位互补的50%的探针平衡杂交靶序列(当耙序列过量存在时，在Tm，50%的探针处于平衡状态占用)。严格条件是如下那些条件盐浓度低于大约1.0M钠离子，典型为大约0.01-1.0M钠离子浓度(或者其它盐)，pH7.0-8.3，对于短探针(例如10-50个核苷酸)的温度为至少大约30。C，对于长探针(例如50个核苷酸以上)的温度为至少大约60°C。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现。对于选择性或特异性杂交而言，阳性信号至少为2倍背景、优选10倍背景杂交。严格杂交条件的例子通常是:50%甲酰胺、5XSSC及1。/。SDS，在42。C保温；或者5XSSC、1%SDS，在65。C保温；在65t:于0.2XSSC和0.1。/()SDS中洗涤。对于PCR而言，大约36。C的温度典型是低严格扩增条件，但是退火温度根据引物长度可以在大约32'C至48'C之间变化。关于确定杂交参数的其它指导在众多的参考文献中提供，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubel,etal.1995)。本文所用"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"或其合乎文法的同意义用语是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。寡核苷酸的长度典型为大约7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、50或者直至大约100个核苷酸。核酸和多核苷酸是任何长度、包括更长长度的核苷酸聚合物，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000个等核苷酸。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，但是在一些情况中包括可具有替代主链(altematebackbone)的核酸类似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或者O-甲基氨基磷酸酯键(见Eckstein,1991)，及肽核酸主链和键。可以使用天然发生的核酸的混合物和类似物。特别优选的寡核苷酸类似物是肽核酸(PNA)。通过转基因方法产生So^vfe抗性番茄植物根据本发明的另一方面，包含至少一个本发明QTL或其赋予Bo^yto抗性的部分的核酸(优选DNA)序列可用于产生So^y^抗性番茄植物。在这方面，本发明提供了本发明的QTL或其赋予抗性的部分在产生抗性番茄植物中的应用，这种应用包括在Sc^y^易感受体番茄植物中导入包含所述QTL的核酸序列。按照规定，所述核酸序列可衍生自合适的抗性供体番茄植物。能提供包含至少一个前文所述QTL或其赋予抗性的部分的核酸序列的两种合适的5c^y^抗性供体番茄植物是5*./z"6rac/zm'feyLYC4/78。呈现Bo化yfe抗性且包含编码S0^7他抗性的一或多个基因的其它相关番茄植物也可以用作So^;to抗性供体植物，因为本发明描述了怎样鉴别这些材料。也可以检测其它番茄种的S^O^'s抗性'瞎况，包手舌iB不限于丄ycopera/co"cerawybr柳e、Z^coperw'co"c/zees附a""、丄，o/em'co"胁虚謂、Z^coperw'co"/arW6wwm、Z^eoj9员/co"/e朋e〃z7、一旦在合适的供体番茄植物中鉴别，则可以通过任何可用方法将包含本发明So/o;^抗性QTL或其赋予5o化少fe抗性的部分的核酸序列移至合适的受体植物中。例如，所述核酸序列可以通过使So^yto抗性供体番茄植物与易感受体番茄植物杂交(即通过渐渗作用)、通过转化、通过原生质体融合、通过双单倍体技术或者通过胚胎拯救技术或者通过任何其它核酸转移系统进行转移，任选随后选择包含所述QTL及呈现So/o;to抗性的后代植物。对于转基因方法，包含本发明BWo^'s抗性QTL或其赋予So^yto抗性的部分的核酸序列可以通过本领域熟知的方法分离自所述供体植物，由此分离的核酸序列可以通过转基因方法移至受体植物中，例如利用载体、于配子中、或者于任何其它合适的转移元件如用所述核酸序列包被的弹性粒子中转移。植物转化通常包括构建在植物细胞中起作用的表达载体。在本发明中，这种载体具有包含本发明^^7to抗性QTL或其赋予Bo/o;他抗性部分的核酸序列，该载体可包含在调节元件如启动子控制下或者与其可操纵地连接的5o^y&抗性赋予基因。所述表达载体可含有一或多个这样可操纵地连接的基因/调节元件组合，只要这种组合中含有的至少一个基因编码So^y^抗性即可。所述载体可以是质粒形式，可以单独应用或者与其它质粒组合应用，通过使用本领域已知的转化方法如农杆菌转化系统以提供^^7^抗性转基因植物。表达载体可包括与调节元件(如启动子)可操纵地连接的至少一个标记基因，使得含有所述标记的转化的细胞通过阴性选择(通过抑制不含有选择标记的细胞生长)回收，或者通过阳性选择(通过筛选由所述标记基因编码的产物)回收。本领域已知进行植物转化的许多常用的选择标记基因，包括例如编码代谢解毒酶(一种选择性化学试剂，可以是抗生素或除草剂)的基因，或者编码对于抑制剂不敏感的改变靶位(alteredtarget)的基因。本领域已知一些阳性选择方法，如甘露糖选择法。或者，可以使用无标记的转化方法获得无所述标记基因的植物，该技术为本领域所已知。一种将表达载体导入植物中的方法基于农杆菌的天然转化系统(见例如35Horschetal,，1985)。A/wwe/a"'era和AW2&0ge"M是遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。A^me/ac/em的Ti质粒和Ar/n'zogew^的Ri质粒具有与植物的遗传转化相关的基因(见例如Kado，1991)。将表达载体导入植物组织中的方法包括用^gra^"en'wm^we/ac/era直接感染植物细胞或者与植物细胞共栽培(Horschetal.,1985)。关于农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移方法的描述见GmberandCrosby,1993及Moloneyetal.,1989所述。也见于美国专利No.5，591，616所述。关于植物表达载体和报道基因及转化方案的一般描述及关于农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移方法的描述可见于GruberandCrosby,1993所述。培养植物组织的一般方法见例如Mikietal.,1993及Phillips,etal.,1988所述。关于分子克隆技术及合适的表达载体的正确参考手册是SambrookandRussell(2001)。另一种将表达载体导入植物中的方法是基于基因枪介导的转化方法，其中DNA在基因枪的表面上被运载。使用微粒导入(biolistic)装置以300-600m/s速度促进粒子轰击而将所述表达载体导入植物组织中，这个速度足以穿透植物细胞壁和细胞膜(见Sanfordetal.，1987，1993;Sanford，1988,1990;Kleinetal.，1988,1992)。将DNA导入植物中的另一种方法是通过耙细胞超声法(见Zhangetal.，1991)。或者，可以使用脂质体或原生质球融合体将表达载体导入植物中(见例如Deshayesetal,1985禾卩Christouetal,1987)。也已经报道了使用CaCl2沉淀法、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收进原生质体中(见例如Hainetal.1985和Draperetal.，1982)。原生质体和全细胞及组织的电穿孔法也已经描述(D，Halluinetal.,1992和Laursenetal，1994)。在番茄靶组织转化后，上述选择标记基因的表达使得可以优先选择转化的细胞、组织和/或植物，使用本领域熟知的再生和选择方法进行。表1-5列出的标记也可以用于该目的。坑性香茄植iL在产生Bo/^yto抗性番茄植物的另一个实施方案中，可以使用原生质体融合法将核酸从供体植物转移至受体植物。原生质体融合是诱导的或自发的联合，如两或多个原生质体(其细胞壁通过酶处理除去的细胞)之间的体细胞杂交，产生双核或多核细胞。融合的细胞甚至可以利用天然不能种间杂交(interbreed)的植物物种获得，将融合细胞经组织培养为呈现希望性状组合的杂交植物。更特异地，第一个原生质体可以得自呈现^o/o;to感染抗性的番茄植物或者其它植物品系。例如，可以使用来自S./7^rac/zdtesLYC4/78的原生质体。第二个原生质体可以得自另一番茄或其它植物品种，优选包含商业上希望的性状的番茄品系，所述性状例如但不限于是疾病抗性、昆虫抗性、贵重果实特性等。然后使用本领域已知的传统原生质体融合程序融合所述原生质体。或者，可以应用胚胎拯救技术将包含本发明一或多个QTL的核酸从供体植物转移至受体植物。胚胎拯救技术可以用作从植物不能产生存活种子的杂种中分离胚的技术。在这种情况中，将受精的植物子房或不成熟种子经组织培养产生新植物(Pierik,1999)。本发明还涉及产生^^T&抗性番茄植物的方法，包括如下步骤根据上文所述检测供体番茄植物中与及"'"wea抗性相关的数量性状基因座(QTL)的存在情况，并将包含至少一个由此检测的QTL或其赋予So/o^s抗性的部分的核酸序列从所述供体植物中转移至^^yfe易感的受体番茄植物中。所述核酸序列的转移可以通过本文所述的任何方法进行。这种方法的一个优选实施方案包括通过植物杂交而将所述核酸序列经渐渗作用方式从So^;to抗性供体番茄植物转移至易感受体番茄植物中。这种转移因此可以通过使用传统育种技术而适当实现。优选通过使用标记辅助育种法(MAS)将QTL经渐渗作用方式转移至商业番茄品种中。标记辅助的育种法或者标记辅助的选择法包括使用一或多个分子标记以鉴别和选择含有编码希望性状的一或多个基因的那些后代植物。在这种情况中，这种鉴别和选择基于本发明QTL或与其相关的标记的选择。MAS也可以用于产生具有感兴趣的QTL的近等基因系(NIL)，可以更详细地研究每个QTL作用，且也是产生回交自交系(BIL群的有效方法(见例如Nesbittetal.,2001;vanBerlooetal.,2001)。根据这个优选的实施方案产生的番茄植物可以有利地从受体植物中获得其大多数性状，并从供体植物中获得Sc^7to抗37性。由于&"力WM抗性是多基因遗传的，因此优选通过合适的转移方法将至少两个、优选三个QTL或其赋予So^jfe抗性的部分插入一个受体植物中，即多个QTL堆积(stacking)在受体植物的基因组中。据信本发明的两或多个QTL的堆积可导致j5W7to抗性增强。正如本领域技术人员所易于理解的，所述堆积可以通过任何方法实现，例如通过用包含多个本发明QTL的核酸构建体转化植物而实现。或者，杂交的每个亲本植物中可存在至少一个QTL，由此在所得杂种中包含至少两个QTL。通过这些抗性性状的堆积，可以获得高度抗性的植物。这种植物是本发明特别优选的实施方案。如上文所简要论述，传统育种技术可用于将编码^^少to抗性的核酸序列经渐渗作用方式转移至^o/^to易感受体番茄植物中。在称作谱系育种的一种方法中，将呈现So^7似抗性且包含编码SW7to抗性的核酸序列的供体番茄植物与优选呈现商业希望特性的So^yfe易感的受体番茄植物杂交，所述商业特性例如但不限于是疾病抗性、昆虫抗性、贵重果实特性等。然后将所得植物群(代表Fi杂种)自交和结实(F2种子)。然后筛选从&种子生长成的F2植物的5oo;to抗性。所述群可以通过许多不同方式筛选。首先，可以使用传统疾病筛选方式筛选群。这种疾病筛选法为本领域所已知。优选使用定量茎或叶感染生物测定法，优选使用如上文及实施例中详细描述的本发明方法中使用的茎生物测定法。其次，可以使用一或多个前述分子标记进行标记辅助选择法，以鉴别包含编码So^yfe抗性的核苷酸序列的那些后代。也可以使用上文所述检测QTL存在的其它方法。同样，标记辅助选择法也可以用于证实得自定量生物测定法的结果，并因此可以组合使用一些方法。So^rfe抗性番茄植物和种子本发明的So^yto抗性番茄植物特征在于具有高水平抗性。这是指高于在易感对照植物中观测到的抗性水平。事实上，本发明的植物的抗性水平高于目前己知的任何商业番茄品种(即具有商业希望特性的品种)的抗性水平。当通过生物测定法测量时，本发明的植物对于^^7&""w"的易感性比易感对照植物低至少3倍。例如实施例3.10和3.11所述在标准实施条件下，在3周内测量通过生物测定法测量得自成熟植物中So/o;to"'"ew"感染的茎病斑的平均长度。典型地，使用标准实施条件在基于这种特性设计的确定抗性的抗性生物测定中，本发明的植物的抗性水平导致接种3周后成熟植物中Bo^ytoc/"e/ra病斑的平均茎病斑长度小于3.2cm。更典型地，本发明的植物示出平均茎病斑长度低于2.9cm。本发明的一些植物甚至示出平均茎病斑长度为2.0cm。考虑到表示病斑长度的数字包括2cm的接种创伤部位，因此可以推断在本发明植物中观测到高水平抗性，甚至在一些QTL情况中观测到完全抗性。对比之下，在相同条件下易感对照植物示出平均茎病斑长度为大约3.6cm至大约6.0cm，平均4.85cm(见表7)。也作为对照，WO02/085105所述含有部分So^yto抗性的QTL-10的5*./^6rac/w/toLA1777，在相同条件下示出平均茎病斑长度为大约4.3cm。总之，在上述抗性生物测定中，本发明的植物与易感对照植物相比示出净茎病斑长度通常低大约30%(0.9/2.85X100%)，与部分抗性/w6rac/7a/^LA1777的净长度相比低大约40%(0.9/2.3X100%)。因此，当通过生物测定测量时，本发明的植物与易感对照植物相比其So&ytod"e^fl易感性低3倍，或者是对照易感植物的1/3水平。相反，如本文所述及通过生物测定确定本发明的植物的抗性比易感对照植物的抗性高3倍。对于QTL-1，观测到完全抗性。易感对照植物是指对于^^ytoc/"ea感染示出正常易感性或者无抗性的植物。易感对照植物的例子是杂交植物5b/朋層/少co/era/c扁cv."Moneyberg"(DeRuiterSeedsR&DBV，Bergschenhoek，TheNetherlands)。通过本发明的方法可获得的抗性番茄植物或其部分也是本发明的一部分。本发明的另一部分涉及^o^;to抗性番茄植物或其部分，在基因组内包含至少一个QTL或其赋予万W^to抗性的部分，所述QTL选自So/a"ww/z"6rac/za/tesLYC4〃8的染色体4、6、9、11和12上与抗性相关的QTL，其中所述QTL或其赋予So^yto抗性的部分不在其天然遗传背景中。本发明的So^y^抗性番茄植物可以是任何遗传类型，如近交体、杂种、单倍体、二倍体、单性结实或转基因的。另外，本发明的植物对于39抗性性状可以是杂合或纯合的，优选纯合的。尽管本发明的Q1X以及通过bfm的方法可获得的那些QTL以及其赋予S^7to抗性的部分可以转移至任何植物中以提供Bo^7泡抗性植物，但是本发明的方法和植物优选针对5b/aw<3C￡a￡禾斗、更优选番燕o除了如本发明鉴别的与^^y^抗性相关的6b/a"wm/z^rac/w/tesLYC4/78染色体4(QTL-4hB)、6、9、11和12上的QTL之外，本发明的植物可任选进一步包含一或多个&/z"6rac/w/tey衍生的QTL，所述QTL经鉴别是QTL-lh、QTL-2h和QTL-4hA，在共同未决申请PCT/NL2005/000762和EP1652930A(欧洲专利申请04077931.6)中详细描述，所述文献在此并入作参考。本发明所述QTL或者PCT/NL2005/000762所述QTL的QTL组合将增强具有这种组合物的植物的疾病抗性。然而，每个QTL还携带来自原种S./7^rac/zmYw的遗传背景信息，这意味着在后代中具有太多的这种背景信息，将不能获得具有希望的最佳农业特性的植物。可以使用循环选择和回交、自交和/或二倍体或者用于产生亲本系的任何其它技术产生近交系5Wo;他抗性番茄植物。在选择和回交方法中，可以通过将回归亲本与第一个供体植物(其与回归亲本不同，在本文称作"非回归亲本")杂交而将SWo;fe抗性以渐渗作用方式转移至耙受体植物(称作回归亲本)中。所述回归亲本是对于^^Jto无抗性或者低水平抗性的植物，且具有商业希望的特性，例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、贵重果实特性等。所述非回归亲本呈现^^7他抗性，且包含编码So^yto抗性的核酸序列。所述非回归亲本可以是与所述回归亲本杂交可育的任何植物品种或者近交系。将得自回归亲本与非回归亲本杂交的后代与回归亲本回交。然后筛选所得植物群。可以通过众多不同方式筛选所述群。例如，可以使用前文所述的茎定量生物测定法筛选群。选择呈现SW7to抗性表型、包含编码So^yto抗性的必需核酸序列、且具有商业希望的特性的F,杂种，自交及选择多个世代以使得番茄植物越来越成为近交系。这种持续自交和选择的程序可以进行两至五或更多个世代。这种育种和选择的结果是产生与5Wo;fe抗性相关基因以及与商业感兴趣的性状相关的其它基因遗传同源的品系。代替使用表型病理学筛选的生物测定法，可以使用一或多个前述分子标记、杂交探针或多核苷酸进行MAS，以鉴别包含编码^^7^抗性的核酸序列的那些后代。或者，MAS可用于证实得自定量生物测定的结果。一旦产生合适的选择结果，则重复进行所述程序。将与回归亲本回交及针对6W7to抗性进行选择的程序重复大约5或更多个世代。得自这个程序的后代对于编码^^T^抗性的一或多个基因是杂合的。然后将最后的回交世代自交以提供S^o;他抗性纯合的纯育种后代。所述抗性番茄近交系可以用于另外的杂交中，产生5t^yto抗性杂交植物。例如，本发明的第一个^^rto抗性近交系番茄植物可以与具有商业希望性状的第二个近交系番茄植物杂交，所述性状例如但不限于是疾病抗性、昆虫抗性、希望的果实特性等。所述第二个番茄近交系可以是抗性的或不是So^yfe抗性的。本发明的另一方面涉及产生可以生长为万o^yto抗性番茄植物的种子的方法。在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤提供本发明的Sc^7fe抗性番茄植物，将所述Bo^to抗性植物与5b/朋ww/_yco/erw'CMm植物杂交，收集得自所述杂交的种子，当种植该种子时产生BW7他抗性番茄植物。在另一个实施方案中，所述方法包括如下步骤提供本发明的5Wo;fe抗性番茄植物，将所述5。^y他抗性植物与》Sb/mwm(ycopem'cwm植物杂交，收集得自所述杂交的种子，使所述种子再生为植物，通过本文所述任何方法选择SW/^to抗性植物，将选择的植物自交足够数目的世代以获得赋予植物So^yto抗性的等位基因被固定的植物，将由此产生的植物与具有希望的表型性状的61.(vco;ww'cMm植物回交足够数目的世代，获得^W^fe抗性的且具有希望的表型性状的S./F，e^/cwm植物，从得自最后一次回交的植物中产生的种子，当种植该种子时产生So^yto抗性番茄植物。下文提供了例证本发明而无限制本发明之意的实施例。实施例^"盧树i:鉴^/^o^y他c/we"a-拔丝/《关g7X游_^法41本实施例介绍了评价野生型番茄基因型集合中So^y"抗性的定量生物测定法。在野生型番茄物种中己经报道了对5W7他c/wewa的部分抗性，但是这些报道在很大程度上是描述性和定性的。部分抗性基因型的鉴别提供了通过渐渗作用方式将抗性转移至商业育种品系中以获得具有易于处理的抗性水平的品系的前景。可再生的、客观的定量测定的可利用性以及具有遗传决定的(部分)灰霉菌抗性的基因型的鉴别开启了在栽培的番茄品种中培育抗性的方式。本实施例描述了定量疾病测定法。该测定法应用于叶(叶接种测定)和茎节段(茎接种测定)。检测了疾病易感性的两个参数。测量的第一个参数是发病率(DI)，即导致病斑扩大的接种比例。如果在特定宿主基因型上最初的及"'"e^"病斑(部分)不扩大是该植物的遗传性状，则这种性状是重要的，因为其直接限制作物中病灶的数目。测量的第二个参数是24小时内病斑生长速度(病斑生长，LG)。从最初的接种处传播的病斑看起来匀速(mm/天)传播，直至病斑达到叶的边缘或茎节段的底部。本发明测定方法能量化凡感染的发生(发病率)和发展(病斑生长)，获得两组定量的性状数据。该测定方法用于筛选番茄种的集合(以下也称为"集(accession)")中抗性的存在。澄激检测的植物基因型列于表6。表6:检测的茄属植物(&/朋画)基因型列表42編号来源"3种具体说明/品种叶薑頃参考文獻w78/1604t)RSKeckse咖tiTorpeY82/2577PRSFuturiaYY33/2896严SBiruincaY89/3695DESXS.i(ycopersiaimvar.cerasiformeYDRSY39/3862t)RSOlomouckeY,063DRSL4034Y隨311DRSSeed8thip2YYDRSGbnr90124YY薩WUPPWSSG1.1290冊LoPBYVVULoPBYYG1.1558WULoPbYG1.1560WTJLoPBYYG1,160LYYG1.1615而LoPBY〖Z.2向隨2KYfUi'basch'1986)LA.716S.,penneffiYLA.2157TGRC乙.perwi;她誰YTGRCYLyc.4/78③IPKYY(Urbasch,1986)ri60/79(3)[PK乙.gZcmdi4oswmY(Urbasch,1986)T5挑/81〈纷汇PKY(Urtmsch,l娜)'DRS:DeRuiterSeeds,Bergschenhoek,荷兰；WUPPW:PlantkundigProefcentrumWageningen,WageningenUniversity,Wageningen,荷兰；LoPB:LaboratoryofPlantBreeding,WageningenUniversity,Wageningen,荷兰；MPIZK:MaxPlanckInstitutfurZuchtungsforschunganKultuipflanze,Koln,德国；TGRC:TomatoGeneticsResourceCenter,UniversityofCaliforniaatDavis,DavisCA，USA;IPK:InstitutfurPflanzengenetikundKulturpflanzenforschung,Gatersleben,德国。2Y表示在特定测定中检测的基因型，S表示作为易感参考对照的基因型。(3)在c/"ewa抗性之前公开的。将植物在最低温度为15t的温室中的12cm罐的盆栽土中生长。从10月至3月应用人工钠灯(16小时/天)。在发芽后5-7天，加入10mlFeNaEDTA溶液(3.5g/l)，随后3天加入10ml微量营养素溶液(0.286g/1H3B03;0.1558g/1MnS04-H20;0.008g/1Cu04-H20;0.022g/1ZnS04;0,00196(NH4)6Mo7024.4H20)。在发芽后开始两周内，每周加入5ml的Hoagland溶液(5mMCa(N03)2;5mMKN03;2mMMgS04;lmMKH2P04)。".麵定根据Benito(1998)所述，从5.c/"we"菌株B05.10中制备接种体。对于每个植物，用锋利的刀片从主干分离完全伸展的一或两片复叶并转移至预湿的种花泡沫中。将所述种花泡沫置于含有自来水的皮氏培养皿中，随后置于经喷雾增湿的含有湿滤纸的容器中。然后将所述复叶接种A的分生孢子悬浮液，小心地将共6-10滴的接种体(2)ul)滴于叶的上表面上。基本如Benitoetal,1998所述，用经喷雾湿润的盖子密闭该容器，在15°〇于黑暗处在100%RH下保温。适当地，一个复叶分裂为四个小叶，每个小叶接种10滴2^1含有2000个分生孢子的接种体。在几天内监测强烈扩大的病斑(发病率)和病斑生长速度。为了校正由于季节或植物栽培导致的变化，使每个实验中的特定基因型的发病率与在相同实验中检测的Moneymaker的发病率相关。使用卡尺在96、120和144hpi测量病斑大小。发病率通过将扩大病斑总数除以悬滴接种总数而确定。病斑生长速度通过计算24小时内病斑大小(mm)的增加而确定。未扩大的病斑数据从定量分析中删除。".吝,标靴糊如下所述进行茎测定去除高度为大约50cm的植物的上方5-10cm和下方5-10cm的茎，将剩余的30cm茎切成5-6cm等长节段。将每个节段垂直置于网格中，茎底部置于湿滤纸上。在接种之前，用自来水喷雾茎节段以保证接种体相同分布于创伤表面。如叶测定所述制备接种体。将含有大约106个分生孢子/1111的一滴5pl接种体应用于每个茎节段的顶部。在15±2"C温度于黑暗处在100%相对湿度下保温。感染进展通过在接种后各个时间点用游标卡尺测量最大腐烂症状而确定。对于每个基因型，计算感染的茎的百分比。发病率通过将具有扩大的病斑的茎节段总数除以接种的茎节段总数而确定。病斑生长速度通过计算24小时内病斑大小的增加而确定，非扩大病斑的数据从分析中删除。7.5.錄菜针对每个基因型，确定几天内在离体叶感染实验中的发病率和病斑生长，通常在感染后2-4天进行。在这些实验中，作为参考的51./ycoj^rw'cwmcv.Moneymaker中的发病率在15-78%之间波动。除了基因型82/2577和83/2896(均为S.^o尸m'c謂禾中)之外，检测的基因型在所有的实验中均示出低于Moneymaker的发病率。基因型G1.1556、Gl.1560和Gl.1601在三个独立实验中均示出较低发病率，范围是0-21%。统计学分析表明基因型78/1604、91/4311、96/4326、G1.1556、GI.1558、G1.1560、G1.1601、LA716和LYC4/78中发病率显著低于对照品系&/ycc^era/cw附cv.Moneymaker(p<0.05)。然而，在周与周之间存在很大差异，在离体叶测定中观测到的一些差异实际上不是非常明显的(robust)，因为实验/周之间的发病率有波动(15-78%)。在这些抗性基因型中(发病率明显低于参考的Moneymaker),成功扩大的病斑通常以与在Moneymaker中相似的速度扩大(例如96/4326、G1.1560、LA716)。未发现相反情况无一基因型展示发病率与Moneymaker类似，而病斑生长速度低于Moneymaker。在大多数基因型中，24小时以上(48-72hpi)病斑生长速度与Moneymaker处于相同范围。5个品系(91/4311、160/79、G1.1556、G1.1601和LYC4/78)示出较缓慢的病斑生长速度，在统计学上与5*.(ycopew/cMmcv.Moneymaker具有显著差异。在不同季节进行的实验之间茎节段感染测定法看起来比叶测定法在再现性方面更明显。即使茎节段数据点的数目(5-8个节段/植物)明显小于叶测定法(每个复叶40个接种滴，每个植物可以检测一或两个叶)，但是实验变化性通常低于茎节段测定法。茎测定中对照基因型/>^/^*訓cv.Moneymaker的发病率范围是52-95%。将相同实验/周条件下的17个基因型中的发病率与对照品系《S.fycope"/cwmcv.Moneymake的发病率进行对比。大多数基因型示出发病率与对照品系Moneymaker处于相似范围。基因型G1.1556(29%和41%)和G1.1560(28%和7%)示出发病率降低。仅G1.1560与对照具有统计学显著差异(p0.05)。茎测定中对照基因型51./少co/era/cwwcv.Moneymaker的病斑生长速度范围是5.4-9.2mm/天。许多基因型的病斑生长速度与对照处于相似范围内。然而，在品系89/3793、G1.1601、LYC4/78、T566-81中，病斑生长速度与对照cv.Moneymaker具有统计学显著差异(pO.Ol)。许多基因型在茎节段测定中被认为是部分抗性的，因此对生长于暖房内Rockwool⑧上的完整植物进行定性测定。目的是评价在实验室条件下在茎节段中看起来是抗性的基因型在半商业性栽培系统中是否确实比对照品系更具抗性。将植物以随机顺序生长于Rockwool⑧中，暖房室内装有在孢子形成点严重感染及c/"w^的柑橘类果实。该暖房室内通过每天用自来水喷雾两次地面而保持高湿度，关门关窗。以有序的间隔对所有植物进行修剪创口，随时监测灰霉菌的发生。经鉴别许多野生型番茄品系显示这两个参数均明显降低，因此提供了将两个潜在的独立的部分抗性机制经渐渗作用方式导入51.fya^w'cwm中的潜在来源。实施例3:在禾中间番茄群体(S.lycopersicumcvMoneymakerXS,habrochaites品系LYC4/78)中作图Bo^rfec/w^ga部分抗性在这个实施例中，呈现了源自S./^6rac/w/toLYC4/78的赋予及c/wewa部分抗性的两个QTL基因座。通过在分别针对两个QTL基因座之一分离的两个BC2S!群体中评定&c/^wa抗性水平而对结果进行证实。3丄潜激#辨5b/a""w/za6rac/w/tesLYC4/78(后文称作LYC4/78)的种子得自位于德国Gatersleben的遗传学与栽培植物研究所(InstituteforPlantGeneticsandCropPlantResearch)的基因库。5b/a/w附(yco/ers/cM附cv.Moneymaker(后文称作Moneymaker)的禾中子得自荷兰BergschenhoekDeRuiterSeedsR&DBV的种子库。在Moneymaker与LYC4/78之间进行种间杂交，产生F,种子。将所述F,种子生长成为Fi植物。播种得自一个F,植物自交的F2种子，获得174个个体的F2群。通过用Moneymaker作为回归和雌性亲本进行两次回交，产生59个个体的BC2(回交2)群。使用MAS选择含有两个鉴别的QTL之一的BC2、BC3和BC4基因型，一些BC2经自交产生BC2S!种子(见图2)。生长两个BC2St群，一个是针对发病率QTL分离的60个BC2S,个体，另一个是针对病斑生长QTL分离的47个BC2Si个体。根据Benito(1998)所述从及c/"ewa菌株B05.10中制备接种体。如实施例l所述进行茎测定。3.3.ZWJ分蓐及标记分析使用StewardandVia(1993)所述的基于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方案，从两个(向上巻曲的)幼叶中分离基因组DNA，针对使用lmlmicronic管(MicronicBV,Lelystad，TheNetherlands)高通量DNA分离进行调节，使用Retsch300mm摇瓶(RetschBV,Ochten,TheNetherlands)以最大速度研磨(grounded)。对F2、BC2、BC3、BQ和BC^Si群进行AFLP分析(Vosetal.,1995)，AFLP片段在LI-COR4200DNA测序仪上分辨，基本如Myburg(Myburgetal.2001)发表的方法进行。选择性尸W引物用IRD700或IRD800荧光标记进行标记。使用AFLP-QuantarPro软件包(KeygeneBV，Wageningen,TheNetherlands)评价AFLP凝胶图像。使用如下10个引物组合和接头序列进行基因型鉴定P14M48、P14M49、P14M50、P14M60、P14M61、P15M48、P18M50、P18M51、P22M50和P22M51，如Baietal.(2003)所述。在不同的^^7他测定之间观测到发病率变化(见实施例1，如前述)。因此，对得自MoneymakerXLYC4/78之间杂交的F2群的174个个体中的172个体进行7个单独的连续茎疾病测定。这样对于几乎每个F2基因型均产生了至少5个单独的疾病生物测定评价结果。在每个个体疾病生物测定中，6个茎节段有助于计算病斑生长情况。F2群的平均发病率和病斑生长数值示出正常分布(数据未示出)。Moneymaker的平均发病率是59%，病斑生长速度为9.2mm/天。F2群中平均发病率范围是10%-97%，平均为48%。病斑生长速度范围是3.3mm-11.5mm/天，平均为7.8mm/天。每个个体实验的平均发病率范围是31%-73%，而平均病斑生长速度范围是6.2-7.9mm/天(数据未示出)。如果至少感染6个茎之一，则可以仅计算病斑生长速度。因此，提示病斑生长的基因型的数目增加可以观测到较高的发病率。例如，在较低的平均发病率(31%)的情况中，仅52%的基因型是提示病斑生长的基因型。分报记腐/链徵厫针对得自Moneymaker与LYC4〃8杂交的F2群(r^l74)计算遗传连锁图。使用10个引物组合在F2群(n二174)中获得218个扩增片段长度多态性(AFLP)标记。共69个标记(31.7%)可易于共显性评价，因此可以计算整合的F2遗传连锁图。对BC2、BC3和BC2Si基因型进行的标记分析使得可以添加另外145个AFLP标记。在这145个另外AFLP标记中共102个标记由于F2凝胶的复杂性而先前未进行评价。全部的遗传连锁图由14个连锁群的315个AFLP标记组成，总长度为958cM。由于物种内的共迁移AFLP标记通常是等位基因特异性的，因此使用与其它AFLP连锁图共线性分配染色体的连锁群。一些Moneymaker特异性AFLP标记通常与公布的遗传连锁图(Haanstraetal.1999;Baietal.2003)—样，因此一些连锁群可以分配给染色体，包括具有鉴别的QTL的连锁群。为了改良QTL间隔中的连锁图，基于公布的S.lycopersicumXL.pennellii连锁图(Tanksleyetal.1992;Haanstraetal.1999)，在这些区域中可以加入诊断性CAPS标记。丄6.遂徵分析与g7X/，凰分析标记数据，并如3.5节所述计算遗传连锁图。F2连锁图总长度为958cM，这低于遗传长度范围是1200-1400cM的其它公布的种间丄ycopea/co"连锁图(Fooladetal.2002;Haanstraetal.1999;Tanksleyetal.1992)。另外的AFLP标记使用得自回交系和BC2S!群的AFLP标记数据进行评价。尽管46%以上的标记置于连锁图上，但是该遗传连锁图的长度未增加。原因是所用数据得自一些小亚家族，因此无计算遗传距离的信息，但是通过目测绘图的基因型可以估计位置(VanBerloo,1999)。丄7.R,^游^7Z/，房使用表型数据和标记数据通过区间作图(IM，见3.5节所述)鉴别QTL。IM应用于得自个体重复的数据及应用于重复的平均值。发病率在F2群中针对平均发病率低于50%的那些个体疾病测试和得自所有疾病检测的平均数据进行发病率区间作图。所有测试的平均数据在区间作图程序中提供了针对发病率的单显著QTL(对于基因组规模置信度水平PO.05的优势对数(LOD)得分必须高于3.4)。这个QTL的LOD分值为4.5，解释了13%的总表型变化。赋予抗性的等位基因源自抗性亲本LYC4/78。在所有4种情况中，每个个体实验的QTL作图给出相同QTL区。在每个单独的实验中，偶尔观测到其它"小QTL"。病斑生长病斑生长可以在高发病率的那些疾病测试中测量。对于QTL作图，使用全部7个疾病测试的平均值，针对5.病斑生长的一个QTL经鉴别高于阈值(对于P0.05的基因组规模置信度水平，LOD为3.4)。这个QTL的LOD分值为4.2，解释了12%的总表型变化。阳性作用源自抗性亲本LYC4/78。示出了进行多个疾病测试的必要性，因为在仅一个单重复中，发现LOD谱高于阈值。病斑生长QTL在染色体1上发现(QTL-lh)，发病率QTL在染色体2上发现(QTL-2h)。这些QTL以及以QTL4hA表示的QTL是共同未决申请PCT/NL2005/000762的主题。493，&在生激#/定中&实071将MoneymakerXLYC4〃8杂交的F,植物与Moneymaker回交两次，使用AFLP标记筛选59个后代植物的两个经鉴别的QTL区域(QTL-lh和QTL-2h)的存在情况。选择对于所述两个经鉴别的QTL之一是杂合的植物，自交获得两个BC2S,群。用每个BC2S,基因型进行共4个疾病生物测定。用SPSS分析这两个BC2S,亚群的数据，示出病斑生长正态分布，但是观测一些亚类发病率非正态分布。使用在3.3节中针对F2群描述的相同10个引物组合对所有BC2S,植物确定AFLP基因型。针对病斑生长基因座分离的群中平均病斑生长速度为5.3mm/天，在其它群中平均病斑生长速度为6.3mm/天。无一植物具有与抗性亲本LYC4/78—样低的病斑生长速度。然而，对于发病率而言，观测到比抗性亲本LYC4/78发病率低的植物。这两种BC2Si群的平均发病率相等(57-59%)。每个QTL的阳性作用在BC2S,群中证实。发病率QTL使感染机会降低了17%(46%亲本变化)，病斑生长QTL使真菌生长速度降低了1.3mm/天(33%亲本变化)。仅一部分变化可以用这两个QTL的作用解释。鉴别了一些另外的(小)QTL基因座。在分析得自F2和BC2S,棊因型的疾病测试数据期间，鉴别了一个主要的发病率QTL(QTL-2h)。除了这个QTL之外，还鉴别了其它"推定的"发病率QTL基因座。使用这个信息，选择系数对F2数据集进行限制性"多QTL作图"(MQM)程序。在这个分析中，鉴别了一个另外的"小"发病率QTL基因座(QTL-4hA)。当其分值低于LQD为3.4的显著阈值时，认为QTL是"小"QTL。然而，认为该作用是真实的QTL作用。QTL-4hA位于染色体4上，降低发病率。D疾嫁粼定与07X/貪愿游兹论已经证实测量及"'ww^抗性的生物测定是一种有价值的工具。然而，仍有大量未知的变异看起来影响感染过程的进展。这种大量非遗传性变异可以通过使用标准化程序及通过进行许多独立重复而可以最小化。所述变异可以是每周温室条件变化引起的(昼长，日照时间和温度)，导致茎的生理条件不同。同样，真菌接种体的制备中的微小变化也可以在感染进程的变化中起作用。另一观测结果是疾病的发展也可以受放置所述茎的培养盘的小气候影响。10个不同的实验盘用于BC2S,生物测定。使用统计学分析抵偿实验之间和实验内的变化。最高平均发病率实验为测量病斑生长提供最多的信息，而中等发病率实验提供较多的信息。发病率和病斑生长是独立的性状，因为在这两个性状之间可以观测到无线性相关。番茄中S.抗性数量性状基因座在F2中鉴别。这些鉴别的QTL在BC2S,群中证实，分别解释了46%和33%的亲本发病率和病斑生长变化。这些结果提示在原始的F2作图群中不是所有的赋予及抗性的QTL均被检测到。在这两个BC2Si群中，发现抗性水平高于抗性亲本LYC4/78的植物。这是存在在BC2S,群中分离的另外抗性基因座的指征。另外的抗性分离是令人惊奇的，因为可能预期两个BC2S,群的大部分基因组对于Moneymaker是纯合的。j.川在蕴皇姿伴7^F实各个Q7X游/，賴使用图2所述的方法将含有上述任一QTL的植物置于<S.^op巾/c謂背景中。将BC2S2品系置于温室土壤中，在荷兰标准实施条件下生长。3个月后，通过将含有的琼脂置于主茎的创口处接种植物。随后使用Parafilm⑧封闭创口。接种3周后，测量茎的病斑长度(cm)(见下文详述)。结果列于表7中。显然，含有病斑生长QTL的品系示出病斑大小显著减小。表7;接种3周后，51./7a6rac/zmY^品系LYC4/78和S./2a6rac/w/^LA1777成熟植物中5o"船病斑的平均茎病斑长度51品系重复平均茎病斑长度St*dev.背棄评论/QTL(cm)214,2UGT易感对照21b3,60,9GT易感对照223,00,0Durintha部分抗性对照22b5,02,9Durintha部分抗性对照235,63,0Tradiro相对易感对照23b6,03,3Tradiro相对易感对照263,20,8BChirs3QTL-2h26b2,60,9BChirs3QTL-2h26c2,61,3BChirs3QTL"2h26d3,22,2BChirs3QTL-2h28a2,60,5BChirs5QTL-lh28b2,00,0BChirs5QTL-lh-28-狄糾28■d2,0o,oBChirs5QTL-lh3734,30,6LA1777W002/085105的含有QTL-10的来源373f4,30,2LA1777W002/085105的含有QTL-10的来源3744,80,6BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系374f4，50,0BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系3754,20,3BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系375f4,20,2BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系3764,30,3BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系376f5,00,7BCcbrs10来自S.IvcopersicumXLA1777的渐港系3774,20,3BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系377f4,30,2BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系3784,80,2BCchrs10来自S.lyc叩ersicumXLA1777的渐渗系378f4,60,4BCchrs10来自S.lycopersicumXLA1777的渐渗系6862,0o'oparvlQTX-3p+QTL-4p68f2,00,0parvlQTL-3p+QTL-4p782,00,0parv2QTL-9p+QTL-4p78f2,00,0parv2Q化-9p+QTL-4p***)a、b、c和d是重复，每个重复代表5个植物；e和f是重复，每个重复代表3个植物；GT是具有TMV抗性的Moneyberg;Durintha是根据栽培而具有部分抗性的杂种；Tradiro是杂种，根据栽培而易感5ofryto;BChirs表示得自5".Zw6roc/^toLYC4/78渐渗作用的回交系；LA1777是野生型品系S./7fl6rac/a/^LA1777;BCchrs10表示得自S.Zw6rac/2a/toLA1777的在染色体10上具有渐渗作用的回交系；parv表示得自S.neorickii渐渗作用的品系。3.".在染经沐川/z"Z^c/;a/teyZ^C〃7S071腐f游So^rfe贫丝^T乎瀉一7^./^^oc/^fey丄j777707X腐f游拔丝欢乎将含有本文所述6*.Zw6rac/^/teyLYC4/78QTL的植物中的抗性水平与来源于WO02/085105的在染色体10上含有部分历o^;^抗性QTL的S.habrochaitesLA1777抗性水平进行了对比，以及与衍生自其中的在染色体10上具有渐渗作用的渐渗作用品系的抗性水平进行了对比。52将植物品系置于温室土壤中，在荷兰标准实施条件下生长。3个月后，通过将含有So^y他的0.5cmXO.5cm琼脂盘置于在主茎上2cm长度的垂直茎创口处接种植物。随后用Parafilm⑧封闭创口。接种3周后，从病斑的上方至病斑的下方测量茎病斑长度(由于真菌生长而成斑点状脱色的组织长度，cm)。结果示于表7。观测到含有来自S./w6rac/w/tesLYC4/78的QTL的品系示出与来源于LA1777和IL-品系相比较高水平的5o^yto抗性。前一品系示出茎上病斑生长较少，因此呈现比衍生自LA1777的品系更高水平的So^y他抗性(见表7)。在已经记录的2.0cm的病斑长度处，仅可以测量到原始的创口，观测到无真菌生长迹象，这表明高水平的抗性。因此，2cm的茎病斑长度表示无净生长。实方包例4:在禾中间番茹群CS1./vcopens7'c"mcvMoneymakerXX/za^oc/za/fey.品系LYC4/78)中Bo/rfec/"grga部分抗性作图目U百为了建立更有效的育种程序，包括选择具有适当遗传组成的候选亲本植物，必需具有表示在至少一个候选亲本植物中存在所述遗传组成的可支配的一或多个遗传标记。这个程序包括将选择的植物杂交及进行所谓的标记辅助选择(MAS)，有效地将有利的亲本等位基因从供体转移至受体群，并保证育种不再依赖于重合(coincidence)，且在开发成本方面更经济。S.">^^抗性在野生型品系&/朋"附/7^rac/za/toLYC4/78中鉴别(Urbasch，1986;实施例1)。为了研究这种抗性的遗传学，对S./ycopem'c画cv.Moneymaker与&/z^rac/zmfeyLYC4/78之间杂交获得的F2(r^l74)群作图(见实施例3)。最初，在F2作图研究中鉴别了两个5.c/"ea抗性QTL(如上述QTL-lh和QTL-2h)。随后在分离的BC^后代中检测到第三个QTL(QTL-4hA)，这是其作用仅在没有QTL-2h的情况下才可观测到的QTL。使用2-wayANOVA分析，在F2数据集中鉴别这两个QTL之间的显著上位效应。一些基因型类型表现为低频率，因此需要对&群检测QTL相互作用(Tanksley1993)。在我们的F2群中，3个植物是对于QTL-lh和QTL-2h纯合的5"./yco;^y/c"w，而12个植物是对这二者纯合的X/7^rae/za/tes。使用2-wayANOVA，在这两个基因座之间检测到显著的相互作用。对每个类型的平均观测结果进行分析示出当QTL2是纯合S./^rae/^'to时，没有QTL-4hA的另外作用。在种间分离的F2群中的QTL作图的一个缺点是表型的广泛变化，其易于模拟具有最小作用的QTL。另一缺点是不能重复检测，因为每个F2植物均是唯一基因型的。或者，由一系列渐渗作用品系(IL)组成的遗传文库可用于作图。在其它相同遗传背景中，每个IL品系理想地具有源自供体物种的一个确定的染色体节段(Zamir2001)。这些品系鉴别QTL的能力提高，因为I)这些品系与对照栽培物之间的表型变化与渐渗作用的节段相关；II)每个品系均含有95%以上的回归栽培亲本基因组，微小数量作用可易于通过与回归亲本对比而鉴别；m)由野生型基因组的其它区域引起的上位效应不存在。未连锁的阴性上位效应因此可导致新QTL的鉴别(Eshedetal.1995);IV)每个品系均是纯合且能无限生长的，因此可以进行多次检测(在多环境中)及V)由于每个品系的遗传组成与栽培品种在很大程度上相同，因此几乎不存在不育问题。最初开发的IL群可以追溯至1965年(Wehrhahnetal)，大多数IL群是在最近10年开发的。除了番茄之外，针对大麦(vonKorffeta1.2004)、甘蓝(Ramsayetal.1996)、莴苣(Jeukenetal.2004)、瓜(Eduardoetal.2005)、水稻(Linetal.1998)和小麦(Pestsovaetal.2001)也开发了IL群。所有这些IL群均是使用标记辅助选择法(MAS)开发的，但是使用不同策略，即不同数目的回交和近交世代以获得IL群。另一不同之处是用于开发IL群的标记系统(即标记的类型)的选择。上述4个群均使用SSR标记开发。在茄属植物中，已经针对5W朋wwpe朋e仏7LA716(Eshedetal.1994)、>S./za^rac/za/feLA1777(Monforteetal.2000a)禾口5Wa",/yc。/e^s7'co/cfeyLA2951(Canadyetal.2005)开发了IL。这些群已经示出非常有益于鉴别数量性状(Eshedetal.1995;Rousseauxetal.2005)、QTL精细作图(Fridmanetal.2004;Monforteetal.2001;Monforteetal.2000b)及QTL克隆(Fraryetal.2000;Fridmanetal.2000;Kuetal.2001)。目前，在确定(determinate)生长的(ycopem'cwmE6203中存在一个&/^rac/w"esLA1777IL群(Monforteetal.2000a)。在本实施例中，我们描述了X/^rac/za/to另一个IL群的开发，如今是基于在不确定生长的栽培番茄S./少co/era/cwwcv.Moneymaker背景中来自X/2"Z)rac/^tesLYC4/78的渐渗作用；在本实施例中还描述了所述品系在鉴别凡c^e"fl抗性QTL中的应用。材料和方法覆激柳與丄舰发在S.(ycopera/c扁cv.Moneymaker(后文禾尔作SL)与6*./zaZ^rac/za/ZesLYC4/78(后文称作SH;1978年批次的种子)之间进行种间杂交，产生F,种子。SH种子得自位于德国Gatersleben的遗传及栽培植物研究所(InstituteforPlantGeneticsandCropPlantResearch)的基因库。将一个植物自交获得F2种子，与SL回交获得Bd种子。F2种子最初用于构建遗传连锁图。Bd种子用于开发IL(图6)。使用Stewardetal.(1993)所述棊于CTAB的方案，从两片幼叶(向上巻曲)中分离基因组DNA，针对高通量DNA分离加以调节，使用lmlmicronic管(MicronicBV，Lelystad,TheNetherlands)以及使用Retsch300mm摇瓶以最大速度研磨(RetschBV，Ochten,TheNetherlands)。对每个回交系和IL进行AFLpTM分析(Vosetal.1995)，AFLP片段在LI-COR4200DNA测序仪上分辨，基本如Myburg(2001)公布的方法进行。选择性引物用IRD700或IRD800荧光标记进行标记。使用AFLP-QuantarPro软件包(http:〃www.keygene-products.com)评价AFLP凝胶图像。引物和接头序列由Baietal(2003)描述。CAPS引物系列得自"SolanaceaeGenomicsWebsite"(te^^ffiMLMu)或者利用可得自相同来源的基因组或cDNA序列设计。S./7a6rac/2a/tey与/ycopera/cwm之间的多态性使用Brugmansetal(2003)所述的CAPS消化方案确定。用于鉴定基因型的标记序列、PCR条件和特异性限制性核酸内切酶示于表30。PCR产物通常使用2.5M琼脂糖凝胶分离P在表31中，区分S./fc^to'c調与S./7aZwc/2"/船的不同消化产物针对在感兴趣的QTL中发现的表30列出的每个标记被标出。膨基鹏使用软件程序GGT(vanBerloo,1999)，获得每个回交系和IL的图示基因型。为了计算渐渗作用大小和基因组百分比，通过运行GGT软件，在标记基因座侧翼的半区间(half-intervals)被认为是相同的渐渗作用。缺少的标记数据从侧翼的标记中估算；如果两个侧翼的标记具有相同基因型，则假定其具有同一基因型。通过两个侧翼的标记具有相反的基因型，则将该数据记录为缺失。为了评定抗性，在针对每个IL的共11次复制中使用16个不完全随机的模块(block)。每个模块含有至少两个SE植物和一个S.(yco;ea/cwmcv.Durinta植物。Durinta是商业栽培品种，产生具有长货架期且展示一定水平(但不是高水平)抗性的串番茄。在播种6周后，将植物移至完全土壤室(fullsoilcompartments)中，在夜间15。C/白天19°。及光照16小时/天的方案下生长。ll周后，使用菜刀在每个植物的茎上切割两个大约15mm的创口。每个创口接种lcm2含有及c/"e"aB05.10的琼脂栓(Benitoetal(1998))，用带子封闭。2周后进行第二次接种。在测试期间，在傍晚时为植物给水以保持夜间湿润气候。在接种后第9、12和22天，使用卡尺测量疾病进展。根据如下参数描述疾病进展12天后的修正的病斑大小(LS)(即减去15mm创口的病斑总长度)、过度生长的病斑的百分比(DI),和病斑生长速度(LG)，病斑生长速度以在第9和12天测量的修正的病斑大小中的差异表示，以mm/天表示o,统^学分折使用SPSS12,0软件包(SPSSInc，Chicago,U，S，A.)进行统计学分析。使用一般线性模型(GLM)程序，估算每个IL/性状的平均值。使用Durmett检验(Dunnett,1955)对比测量的性状的平均值与对照基因型SL数据，概率小于0.05则认为有显著性。为了分析LG和LS，应用平方根变换标准化这两个性状的数据。使用Pearson-相关系数计算性状之间的相关性。结果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>开发iS,/yco/e/"w'c謂cv.Moneymaker(SL)遗传背景中S./7aZ)rac/2a"asLYC4/78(SH)渐渗作用品系(IL)群。将得自SL与SH杂交的一个Fi植物与SL回交(图6)。随后，将随机的一组14个Bd植物与SL回交，获得BC2后代(11=59)。对所有BC2植物鉴定基因型，并将选择的一组植物与SL回交。这组植物是以组合的渐渗作用尽可能多地覆盖SH基因组的方式选择的，重组体是以每个异源染色体由三个IL代表的方式选择。重复这个选择和回交程序直至BCs，将主要含有一或两个渐渗作用的31个选择的BQ植物自交。所述31个BCsSi家族的每个家族最多12个植物自交，使用AFLP标记筛选以获得渐渗作用纯合的BCsS2后代(r^44)。再次筛选这44个IL的标记，选择30个IL的核心组。这个核心组代表在尽可能少的IL中SH基因组的最大覆盖度(图7)。该核心组由15个具有单渐渗作用的IL、IO个含有两个渐渗作用的IL、4个含有三个渐渗作用的IL和1个仍含有4个纯合渐渗作用的IL组成。平均每个IL含有60cM^5.2。/。)的SH基因组，渐渗作用长度在20(1.7%)至122cM(10.6%)之间变化。本发明的IL群覆盖原始F2连锁图的95%的长度。然而，我们认识到这个F2连锁图未完全覆盖基因组。这可以通过对染色体3(短臂上部)、4(短臂上部)、5(长臂)和9(短臂上部)进行另外的CAPS分析而例证，其中CAPS标记揭示在基于AFLP的F2连锁图中无标记的渐渗作用。这些渐渗作用的大小基于高密度RFLP图(Tanksleyetal.1992;http:〃www.sgn.comell.edu)估算。因为先前未对染色体3的上部进行筛选，因此这个区域的IL是杂合的。所选择的对IL5-1和5-2是纯合的SH的植物不能结实，因此这些品系保持在其杂合状态。含有染色体8的短臂上部和染色体2的长臂下部的IL不存在。在染色体7和9的短臂上部的渐渗作用存在于多个IL中。针对染色体9的上部进行的选择只有在特异于这个区域的CAPS标记开发之后才可以进行。将30个IL群在不完全随机的模块设计中在11次复制中生长、接种及评价疾病症状。该测试中包括一组正常(fairly)抗性和易感对照。在接种后第9、12和22天，测量疾病进展情况，通过如下三个参数进行评价过度生长的感染机会或发病率(DI)、修正的过度生长病斑的大小(LS)和病斑生长速度(LG)。抗性亲本SH几乎不出现任何症状(表8，表9)，而73。/。的SL病斑过度生长。表8:针对最抗性的IL和对照品系的LS、LG和DI的平均表型观测结果。使用Dunnett检验对比每个IL/性状的平均值(表9)与S./j;co^"/cwmcvMoneymaker(SL)的平均值，显著性差异以*或**标示(分别代表p<0.05，pO.Ol)。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>ai2天后可测量的病斑的首次观测结果；b未确定。表9:针对LS、LG和DI估计的平均表型观测结果。该表是针对DI淘选的。使用Dunnett检验对比每个IL/性状的平均值与&〖yco/7^s/cwwcv,Moneymaker(SL)的平均值，显著性差异以*或**标示(分别表示p<0.05，p<0.01)。Durinta68_g§_!！_2i2_!！_42±5.5**在IL群中，鉴别了疾病症状减少的14个IL(表9)。共12个IL示出显著低的DI。7个IL具有显著降低的LS，5个IL具有显著降低的LG。IL4-1和IL1-3/3-3示出所有三个参数(DI、LG和LS)均显著降低。在DI显著降低的IL中，过度生长的病斑的百分比范围是24-49。/。。LS和LG对于显著偏离的IL而不同，分别在21-34mm和1.7-3.0mm/天之间波动。对照的&/F6^erWcwmcv.Durinta具有一定水平的抗性，其也具有显著降低的三个参数，且7个鉴别的IL中每一个IL抗性较这个水平更高或更低。在先前的实验中，选择非常抗性的BC2S2基因型(DRS5，见表8和9)。这个品系含有代表18%的SH基因组的三个纯合渐渗作用(图7)。这个品系在上述检测中是最具抗性的品系。其具有显著降低的DI(15%)，且LS也显著降低。与&(yco/^ra/^mcv.Durinta对比，这个品系的DI显著降低2.8倍，示出聚合的(pyramiding)多个等位基因赋予&"'"e;^抗性的潜力。ILN校疋的病斑大小。(tmn)病斑生长Mmm/天〉过度生长病斑W)24±8.634±6.437±6.437±6.541±6.441±6.445±9.145±6.746±6.547±6.647±6.748±6.54分±6.449±6.550±6.451±9.651±6,452±6.455±6.358±6.559士6.560±6.662±6.565±6.769±6.569±6.670±6.476土6,679±6.573±4.0-3±6.415±6.91346600351363459579437396443796o23C022333343CO343233344454536544424444-44052430444404344-4-C04411-4G044464<y244小44244444444244444-444444444543rt4o^-P4-2，T^"G-^4,2-3,4,n35-2,4,4,m4,4，4,of4,4,4,4，MLH爪J44J43221_-2113129-3_-11-21123431111-59蕃微渗柳游柳当分析各个IL品系中存在的各种渐渗作用(图7)并将其与各自的抗性作用进行对比时，如表9所示，可以推断堆积的作用。从品系9-1、9-2、11-2和12-3可以看出，渐渗作用的堆积可起作用。例如可以推断在品系9-2中染色体6的渐渗作用无作用，因为在品系IL6-3中相同的渐渗作用不提供抗性。同样，在品系11-2的染色体7的渐渗作用无作用(与品系7-1和8-2对比)。存在于11-2中的两个抗性模式(DI和LS)不是仅仅染色体11上渐渗作用的结果。这个品系中病斑大小(LS)的减小可以是由于染色体9的渐渗作用所致(与9-1中相似的渐渗作用比较)，而发病率的降低从未发现与单独的9-1渐渗作用相关。因此，发病率的降低必须是由于染色体11的渐渗作用所致。因此，在品系U-2中，总抗性是多个渐渗作用的结果。相似地，与品系9-1相对比，品系12-3中过度生长的病斑的降低百分比％可以是由于在染色体12的渐渗作用所致，而修正的病斑大小的减小可以是由于染色体9的渐渗作用所致。因此，多个渐渗作用的组合存在使得抗性得以改良。/丄絲微薪之鹏关薪使用温室生物测定，我们鉴别了含有与增加Ac/恥簡抗性相关的渐渗作用的一组IL。位于染色体2、4和6上的三个区域确切含有增加抗性的基因。其它IL含有多个渐渗作用，使得更难以查明抗性基因。IL9-2在染色体6和9上含有渐渗作用。IL9-2中染色体6上的渐渗作用与IL6-3中染色体6上的渐渗作用相似，IL6-3是与SL—样易感的IL。因此，我们预期IL9-2的作用是由于染色体9而不是染色体6上的渐渗作用导致的。IL11-2含有比IL9-1中存在的渐渗作用小的染色体9上渐渗作用。因此，预期降低的DI是由于染色体11上的基因座导致。两个IL1-4和12-3含有与IL9-2的染色体9渐渗作用重叠的渐渗作用。仅IL12-3比IL9-2更具抗性，提示染色体9和12上渐渗作用的组合作用。因为IL1-4和11-2与IL9-2相比非更具抗性，因此不能除外这两个品系中的抗性是染色体9的渐渗作用的结果。总之，我们鉴别了与增加及cz'w置"抗性相关的位于染色体l、2、4(2X)、6、9、11和12上的渐渗作用。先前在分析这种杂交的F2和BC2S,分离群期间，已经检测到染色体2上及染色体4上渐渗作用的作用(见实施例1-3)。鉴，基鹏飾分廖对于在渐渗作用与及"."画抗性增加之间发现关联的所有区域而言，核査原始的&数据集以发现为什么QTL最初缺失的可能原因。核査标记数据和QTL分析结果的偏斜度。染色体1(1:6:6)、染色体2(1:3:2)和染色体9(1:6)上的渐渗作用显著偏离预期的1:2:1或1:3比率。对于所有这三个区域而言，均观测到缺少纯合的51./_yc0pe^/CMm等位基因。核查针对区间作图和使用Kmskal-Wallis程序的单一标记分析的QTL分析数据，但是未发现关于在F2群数据集中染色体6、9、11和12上显著QTL存在的证据。本发明中使用的标记下表提供了关于在各个连锁图中示出的与本发明QTL相关的各个RFLP禾PCOS-II标记的详细信息。所述信息从位于Comell大学SOLGenomicNetwork(SGN)数据库2005年10月7日版本中直接拷贝。表10TG609RFLP标记物RFLP信息名称TG609插入物大小1900载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列GAAAATTAAAAGATCATTAACACAGATGATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATATCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATTTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGCTCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGATCAGCTGCTGTTGCCTGT反向序列AAGAAAATTAAAAGATCMTAACACAGATAATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATTGCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATGTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGACCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGGTCAGCTGCTGTTGCCTGTTACTGAG62表11TG62RFLP标记物RFLP信息名称TG62插入物大小1800载体pUC剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列TTCGAAGCTCAAGAAGTGTCGGTATTATCACGGCCCTCCAGATATATGGTGGACAAAACATACTAACAGATTGCAAGTT願CATMAATAGAGTTCAATTTTGGGAAAAGTTGCACGTGATTCCAGTACGAACTACTCAAAAAT■CAAGAT反向序列TCTCACAAGATATTCATGCCTAGTTGCAGTCTCTGAGATGGAAACAGAGAACAAAGACAGGAAATTGACAATTACACGGAAACAGTGTTCAGGAACTTCAGGACAAGGAGAAGCAGTAACCAATACAATGT.GTTCAAGTGACTAGATCCAAAAAGCAGTATGATCAGATGT表12TG555RFLP标记物RFLP信息名称:TG555插入物大小:1600载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列GAAATTTACGAAGGAATATTATAGACTGATTTTAAGCTTTACTTGTGTGAGGTAGACAATTGCGAGGGTCAATCTACCAATTTATGGTGAATAAGTTCTATTTGTTAGAAGTCGfiATACATTTTATTAAGGGTTCTAATTGTTGACTATGATAGCAAGCATGCCGTACTAATT反向序列TATAAAAGACCGCGGGGTGCACCAGAGAATGATAATATCTACTCACTTGAGTTGTTTGGTTTTGTCCTGCTGTGAGCATGTTCAGGACACATATATTACAACTTCACTAACAAATTGACCACTGGTCGTGTGATTTTTGGACTTAATTATTATCTCAATTCTTCCTCAAAATAGCAGTCCTTAGATTAGAAGCTGAGG表13CT50RFLP标记物RFLP信息名称CT50插入物大小:1600整体:pBLUESC剪切大小EcoR1药物抗性AMP正向序列ATGAGAAATGAATAATTGTCACATTCTTGTCCACATTCTACTCCAGAGAGAAAGTTGGAGATTTGAGAAAAAAGATCAAAACTTTACTCTTCTGGGGACGAAGAGTAAGTAGACAAGCTTGAAGTTTAATTTTAGTGGCACTGGTAATG反向序列CCTTCGTCGCCGGACAATAGAGGGCCGACTTTCACTCTACTCCTGTTATCAGTCCCATAGATTCTCCGGCTCCCTCAAGCCTGGATCAAGCCCTGGAAGGAATGTGATGTTATTTGCCTTGCTTTTTGTTGTTGGTTTCTTCGTCCTTTTCTCCTTCTTTGCTCTCATCCTTTGGGGTGCTAGTCGACCTC65表14C2_Atlg74970COS-II标记物作图实验图番茄-EXPEN2000正向引物(5&apos;-3&apos;):TCATCATCAACTATCGTGATGCTAAG反向引物(5&apos;-3&apos;):ACGCTTGCGAGCCTTCTTGAGAC温度55°CMf2浓度1.5mMPCR产物大小LA716:1000LA925:1000消化带大小(usingAlul)LA716:550LA925:850作图位置图染色体偏移置信J番茄-EXPEN20004109.7I表15CT128RFLP信息RFLP标记物名称:CT128插入物大小:700载体pBLUESC剪切大小EcoR1药物抗性:AMP正向序列TTACACTGTCATCAAACGACCAGAGACTTTTGTTTACGGGGTCTGCAAGGTGGTCAGCAACATAGCAAGTCTACCGTTCTTGATCTCCCACCAGGGTAGAGTGGGTCGACAACCTCGCCCAGATGGCCAAGATGCTTTGTGCATGGACCAAGCTTGGGTTGCCCAAGTAGTCAA反向序列CCGTGAACTTGAGGTGATCCACTGCAGATGTTCGGTGAGGCTGTGTGGTTCAAGGCCGACAAAGCATCTTGGCCATCTGGGCTTGCCTTGTCGACCCACTCTACCCTGGTGGCAGCTCAAGAACGGTAGACTTGCTATGTTCTCTATGTTTGGATTCTTTGTTCAAGCTATTGTCACCGGAAAGGGTCCA表16TG599RFLP标记物RFLP信息名称TG599插入物大小700载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列TCATTTTCAGCATATAATCTGTATCATGAGAGGGTGGAACTTACATTTTCTGTTGATCGGTTGGGACTAAGATTTTTTGAAATGAGACTCCTGATGGTGTGGGAAGGCTTZVTAAAGTCCCTACTTATGAATTCTTTCATGGTTTGGTCAATTGAGAAGGATCAAGAAATCTGATGCTACTTTATCATGGGAACTT反向序列AAAGAAACCAATAGCATTGGTCAATGATGCTTGATCCTTCTCAACTGACCAAACCATGAAAGGAAATACTACCTCCTCCTTTATAAGCTCAAGGTAGCGAATACCTTTCTCMTTCTTACAAAAACAGCAAGCAAGGATCAACAGCAATACTGTCGCAA68表17TG10RFLP信息RFLP标记物名称TG10插入物大小900载体pUG剪切大小EcoR1/Hindl药物抗性AMP正向序列TTTCATGAGAAAATGACTGGCTATTTTCAACTTTG反向序列CTGCTCTGCCAATAATAGTTAAGCAGATCAGAAAGATTAACCATATTATCAAATAACCTAATGAGTACACTTTCCCTTACTTTACTGTTCTCAAACTGTTGGCCAAGGTGATCAGCTGCAGGGGATGAATCCACACCTTTCAGTTTGGCCAGACGAGGAGTCCAATGGGATAGAAGGACTAACTCAATGACGTATG69表18TM2aTM标记物TM信息名称TM2A旧COSID:T0899序列C腿GCTCGANNNACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGCTCCTCCMTGAAAAGGGAATCAAGTTTGCCAAAGAAAACTAAAAAAACAAAATTATGGTCTAGTTTTCTATAGTGACAGTTTTGGATCTTTTTGGGTCAATTGTTTTTGTATCCTTTGCAAGTTTCTTGCAGCCGGAGGCTTAGATTTAGCTCTTTTGATATTATACCCAACATTTCTACAAAATAATGTATGGCAAACTGGGGGCCTATCCCATTTGCCTTAGTGTGGAGGTGTTATTCTCACATGAATCGTTTTCCAATTATGGTTAGTAGCAGACAATTGATGCAAAATGAAGAAATGTTCATGACCAAAAAAAMAAAAAAAAA作图的位置图番笳-EXPEN2000fTM2A)染色体偏移50.5置f曰度表19TG551RFLP标记物RFLP信息名称TG551插入物大小:950载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列CATTTCAAGGTCCATACCAAAACATTTGCTGCATTTGCAAGCTCTTGATCACCAAATTTTTTGATAAGTACAGGTTTATTTCTACATAGCTTTACCAACGACAAATATAACAAACTCAATGTTGGTTAAGGAAATTTGTCAAGTAAAGTTCAA反向序列TTATATTTGGATTTACTTATTTTATATAGGATTTCATAAACGCATGTGATC71表20T1405COS标记物COS信息名称T1405MIPS分类1.05.01EST信息T1405自EST记录TPTAR86TH开发Arabidopsis同源At匹配T1405相对于ArabidopsisBAGAC009243.3最佳匹配。At位置1.1490000At特性0.677Genbank蛋白击中最佳Genbank蛋白击中AAF17692.1评估1.5e-67畔寺性0.677描述"与beta-1,4-木糖苷酶dbjIBAA24107[拟南芥]相似"作图位置图染色体偏移番茄-EXPEN2000477.0072表21<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表22TG254RFLP标记物RFLP信息名称:TG254插入物大小2200载体:pGEM4Z剪切大小:PST1药物抗性AMP正向序列TGCTTTCTTCTATATCAAACTGGGTCTATTGAAGGATATTTTATTATGGAAATTCAAAATATATCTTACATCCCCTTATCAGTAGTGCACCAAGGGTGTGACCTTCCATGTGTCCTAGCCTCTTAGGCTTGGTGGACTTTATTGATAAATTATTCATTAGAACAGTTATTAGAAATGTGGAACTGGTTGAGGTAGGCG反向序列TGGCTATCAATAGTTGGCAATATGAAAACTAAGACTTGTAACAAGGCTTTCATTTGTGACTTGAGAATAGAACCAACCGTACTGCTTTTTCTCCACAGCATCGAGCACTGCATTCATGTTTGGCAATATTTGACTGTAAAACGCCAAAAGTACCCTGGTTTCCTATCCAGTTAAGGCAACAGTAGCAGAAAATGAGTGTTGTAATGAGTCAAT番茄-EXfflR1997(S,lycopersicumTA209xS.habrochaitesLA1777类型BC1,1997)表23TG223RFLP标记物RFLP信息名称TG223插入物大小790载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列TATOAAGAAM，TGTGTAGTGTTOCCAA'TATTC:flAC節:r:imG:fTCAM"GG幼TGGGATGGiTGAG;r'GAT;rCCATAGGAATAACA!T.CCT'GGAGAiTCTAGGTTTGGAC;TCCAGiTT'.,CATAAGTGT,CC.C:ATC:T.GC窗ATCT'TACMC3TTCAa'lTCAAACTTGT您GAGTGC-GCC:ATAGTAGATCCAT.GGAGAAGAAT'TAT;TGT'TCCTTAG鹏C:AG餘CAG!3SM"JT.C織.鹏CAAAT咖A,GTTCAG秘GAGJ5GACTAAATATC:TAACM"GCCCC'CTCA2LGCi"CC;AGAT,g'GTAAaGC反向序列tttccacacacaciiaammacmcttgaacacactgtaatcc.ccctc^tcatcaai^accacacaaci^ccclcttctgaacatocaaagtcgctpatccagaaagtct.l"ctoat.gc窗ttgacc譜gaot.tcci"gtcac，ccaacatg環ag窗tt'stagggaatam:tt.SaaatcagattAc;雄gatCTCAAACl"CaaGT加CTTTACC:ATC:TGGAGCTI^A卿G.GCA窗mGATATTT秘TCC-CTCTTCTG番莉-EXHIR1997(S.,lycopersicumTA209:xS.habrochaitesLA1777类型顧'l的7)表24TG47RFLP标记物RFLP信息名称TG47插入物大小1900载体PUC剪切大小EcoR1/BamH1药物抗性AMP正向序列T.i3CAGTTOA^TTCGi'CTTCTMCACT聰CTCTT幼GCGCATCAAGACAAC.C.GACCCAOTAGTACATT.TG.GT5"TTACCAAA.T.OTCTTC歸卿TAAATCTATTTGAC赠鄉.TCACTCTCTMATCATAAGCTGAmc^catacccgtaaat.c;taaaacmact'CTAl3AAmGCCttac.ctcat.cattcctaggac加mttatatctCTMG.GTG.SAACAlGTTAACCCCTCCTltTGAGTaTTT.AT.ACCATCATATTTT^AAACTTCTCGTA郷TC肆TGTTTCTTTTG.G.TACTTC:TT.AG'TATA(3:C!rTGGAG:r'GGGAC;.CCMGGG(3CTCCAGT.GWrTCTAGACAftGAfti\反向序列ctt窗ttgc'tg(3aa(5acagagatttatacacaatsc饥tcttttt,tcaat歸tctttctccttac膨tgtaccttt(5acact.&gtt,t.catagacact.acttgtacmtc;tt■rTATGACACTGACTTGATGTTCjTAAGAGTGMATGTATAGACTiAllCaACAaaTAA■cagagtagaaatm^ac5Tag'gatagct:daaattgatattcaagtttlgat番茄-EXPEN2加0(S.lycopersicumLA925xS.pennelliiLA716类型表25TG幼3RFLP标记物RFLP信息名称TG393插入物大小1200载体:pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列.ACTGACTAAGCTG.CT&,，,奴GCC-GGMTT!rACi^TTGGTTM:鄉CTTG.CT.ecATCACC'TTTOCTT奴T'eTASGTC:職C:TAGGC:TGiCaACAGCCTG改T幼TMC.AG!SAAC站AGATGGTA-C'iTTAGCTATTCACTAftCAATCGTTTACCTTAAAAATGTTATTCTGTA反向序列T.GC&爆'ACCAAAGAAAC船TTG5TTATAfiiAAAAftCAATCCACAAT-CATTCTC:TATAG縱TOCGCAAAGACACTACA亇AACCTC.GTGC膽GAAGAG!3AT(3，MTAAGi^AGCTCAGIAACTTC"Ciy^AAGAAAA鄉GAC"C.Taa-TT.CTCMCTAGC.TTIAGOTAT.ACACTZ^AGAAa^GGMAATAAalTCCAA,AAaC恥TAATCAT、GAtTACCCCCAPCTCACACACCAC.CACTACAGCACAAAAATTAGAAAT.GTTGTATGGACCATGATCAACC:縱CAAGCACAa-GAGGAGAATAT.CATCTACT番茄-EXPEN2000(S.lyeopersicumLA925cS.peimelliiLA716类型F2.200仍Ctl9RFLP标记物RFLP信息名称CT19插入物大小300载体pCR1000剪切大小HindM1/EcoR1药物抗性KN正向序列反向序列GCCCC^^ACTCCTGCTGGM^TTACTGGATCT.CCACTTGCTGCGGACATTGCTTG:TG.TCTT.GMAT.TAATC.CCTT(3TACC.CATTGG:T.i3CT化CTAAAtGACCTCC"3GCAT.CCGC番笳-EXPEN2000(S.lycopersicwmxS.pennelliiLA716类型78表27RFLP信息RFLP标记物名称TG68插入物大小1900载体:pUC剪切大小EcoR1药物抗性AMP正向序列GGATitT.GATGAaCTlGTATCTG:TGCTTC.TA(3C'TCCK:C6A':r,TTTCCmTTAAftnTG雄ACACCTGCCTT潔ATWriTT.卿.GCi3tAAG!3ATTTTCTATGAA'G.站TA赠AT咖TGTATGT.GfAAAGC3ATGCACTAA3CATCTCG.GM_aM..i3AMTGAACTTTGGGC'T'TAAC:TCTOT.CCAAAAGT反向序列CCA加AACAATAC:GGA(5ACATAAG'AAGGAAaGAAAAGT站GC.CATGACl"AATTGGTAAT由CGGCATA!TGATACGAC策CAGTTTTGACTGTT(STC:TACAAT脂.GAfTTC秘雖CATTAi^ATCACAAGAGIACACCTCT&CTAGMTGGeT番茄-EXPEN2000(S.:lycop战sicmaLA925xS.pennelliiXA716类型F2.2000)表28TG565RFLP标记物RFLP信息名称TG565插入物大小1700载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列C(3Tt:lGC.AMACAA(3破CK;AC!rTTAATCCTCTGT'l"ACCi"AAAA^CAATAGTTGTat印aaagaaaatcttacagttfgagirt&ctt'gcgaaagtag.c:cattt，.tacaccag't.tgagamccttct.gcaatclmcat'tttgmgactctttc.c't.ctgitittccc;t.a節.c;tATACAACTCAaaGAAAC.AM"CAAl"TATACTTCAAATTAATT:G郎GiTC:GC.TMftAA:rG赠CCT!r.T.AGACTMCAACATCCCACMGT.CCT反向序列TCAGCAAAA窗CACACAG職GTAC歸AGTAGAGCtoG;TAGAGTAGGGAG雄■CACACAT'TTGACAGCTCAAAACCACTTTACCAATCCAAACMftAAaTCATCACATT■ATCCCTCCCT'TCTCTCCTTTCTCTATtACTCT.CAattcaagm"ct:gtccttttgaggagactt加tc:cttactatggtcttctttict'ttgat.g&tttc'ttatgtgagat&ttgmaactggaaagaagtgaraaag.ataggaggtttggtttctggggtttg'tttattttgctttacaaggGttam.gat:tggatct.tttttagtttt.ggtag番茄-EXPEN2000(S.lycopersicumLA925xS,pennelliiLA716类型F2.:,0)表29TG296RFLP标记物RFLP信息名称TG296插入物大小1100载体pGEM4Z剪切大小PST1药物抗性AMP正向序列TT.AG.GTTraTGTG'TGgffTCMCGTTTlTG'GTTTTGATTTTTATGTGTTTTCTTAGTtt.tot.gttct'g^'cggcata^gtagt.gatttttcagacagttt.ggtattatggagtctgatttg窗at.gc'tt!3ttltagtttcg幼ggtttttgagt.itttgatc3attcaatgttttagt';ett:.gatggtt.tttgag窗ttgat反向序列ag敏at腦aaa2iaagc站atamtc織;raat情gc:ctc脂ctc:;aact.gaataac纖totat.ca,gata鹏tagacgataaacagtgmg.gtagmgcctaac:tc.tatgac腊atot(agaccc:aaaacactaagtactattaactaattatcmmc:tag.aattci:caaaataaayvm".aacamtc;ttatcagtcacatgoacftttcatt^aacatcatgaagmgacaa加gggaag.gtcaaaa:tg(sactccarggcac.ataaga池節gaaaaatttmtcaccagatatcAat纖attatotitcttccttcattcatgaggggC;atgcac站gagac織atac;.atotttct'ccttttactttttctttc'ctgaggaagt^aaaggagcagaaagcagataga^ga番茄-EXPEN2000(S.ycopersicumLA$25xS.pennelliiLA716类型F2.2000)81表30弓|物序列，PCR产物长度以及酶，显示对于CAPS/SCAR标记物的多态性标记物名称抑24TG^TQ柳TQM5qi—At4g3p力0C2—A"g64670TG5(iTG585T加C2—At5g60，60TGM9Ct229T卿TG272TG62TWCT50TG44ICD3Itg318Tp35BTG60crmtG.183TG10US,CT203.CT240染色体引物序列GTATACTCAACAGAGeTTCAGAC500AAtTPTAbGCTdCAGt06tG300CTGAAGCTC八CCfT^AGGTGCGAAAT加ACTATTCCACJAtj柳qTAATTtG^AC7tCTT(iCCrTTCATTTOCTJ3GACAGGCAe亇C850TGTCATCAAACO入CCAGAGACATCATAtCTTCTCtCK^AAACCC700TGATAAATGQTiJG'GAAGA'rTJ3ACTC.200ATCAACCTOGCTCCATCtfCTATTTGTCriACAGTTATTGCTTCTTGnTC柳TGCAGA6CTGTAAfATTTAGAC柳CQ^TC化XGTTGi:AACTCMGCQAGCTCGAATTCAATTCCAAC柳C卿ATTTTAQTnTTCCOATdCtTTffTACCATGAiTGTCCOATC380GGCATTCATCATTCAACATG!CTGGAAAGCCAGACACACAGA589C八dG。GTATCAGTAGGCAGKIGdGATTTGGCTiViciqdGirA卿AACa3MAi3GCTTTTCCAAOTGGTGCAACAAATCCCGAGC1500AGTTATCATAATGGCTAGCiTCACACAaTGCTAATCAACGTTATGC500fCATCCACCGCCCACATTTCGCATGCCTGCAGAGTGGTC350ATTCGCTACCTTGAGGGCTGAATiTGGCAGGCTOAGTOTKk;.850tCCCkCCATrGTtACCAGGACCACTTCCTCACTGCTTOOAC"GC5印TAGAACTTGGCATCCdTT.GAAGCTA(iACAATTGTCACAGAAGTG卿■CAGATCATTGtJTATACAGCrGA^ATTCTAGAATGCCTrTTGTC13-:itCCCTGGCmCTGCAliiCAtCATbi3AGAGAXGCTGGAACAC4C0TTi^ITAGAGCCCAbCAGCAfcargggctgggatcotaqtaaa柳Aagcttgcgattcccataacacaaagcaatgocicaatogtj(mACACAGCA(^TTtC入GTAeiGACGATtTTOCCCCCTCTACCA3S2ACATCmTCCTtCCCTCTGC.GGAAC人GOTCAOGACAGCAT520tggctaa6tgacGaagacg入.CJ\tGeCTAGTTGCAGTGTCC410ttcAgcagcaagcaaa。atgCXcbAACAACTAGCCCTTGA535AAGC"TTCCtCCAGCTtCA0ACGGCGTATTAC6TTCAGA3S0CTAG,CACCCCAAAGGATGAGTGTCAGCATAGGCrnTCCA一COGTC^OGAAAAATGACA入TCTC卿ATt:ATGGTTGAe501ATPFCCAFAOAAATTCCAAA.CAACCCATAGAAATTGCCtn"a450TCJCTCTCTCTGTGATGGAAOCCAACTnTCCAGGTTCATTTTCTC70*>ACACCTACATGCTACTAAGOGQirCTtGGCTGAAGTJ3AAGAAAAGTA卿AXGGGdAtTGTAATATXiTGTC.CACCAGCCCCGGAAGAtTTTA3S4.GCGGTCAACTTCAGCAACTATCTAClTGtCTOCCAAGGAmC]200CCJTGCCQTTCAAGAAGAGTCATTGAAGAATC3GCGGTGAAG1USATGCCAAdriCTTGGCAAACTTi3GGAATATAGTOTAGGAAG卿.CTbGAAAGGGGAAAGACCAAGAAAATATTGTG了八GTGTTCTCt:A:7G0TCCCCCTCtTC八TCAAATTCATX3AtAT亡CACA亡CCCtGGAiB7ATGCCTCi3AAATTCAAATGGAGCGTCACTCCATACTTGGAATAA咖AGCtJTCACTCAAAATGrACeCAAAAGCTdCCGTGTCCTGtATCAACTCAT^TTCACGCtACTTTCTtAT人GAA了ATGGGAAGCGAAAi".0他GAOAGGAAGCGTAATAOO.ATCCC/uWJTACCCTCGCArrAGT850AGCCrrCTTTG丁CCCATCAGTOTTCTCTCGGCATAAAGT力3TGCTAAAACGGACCTACAA_观寧的PRC产物长g(bp)酶55:55capsCAPS-5555SCARc"sCAPSC*SCAPSCAPSCAPSSCARfAPSCAPSCAPSCASCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSSCARCAPSscarcapsCAPSCAPScapsCAPS，n—I聊"i卿碗緣l"加&。ID刺<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>参考文献4vSubelFM，BrenjfcB，King祐oiR起，Moo^》D，$ei^m，aJG，Si^i雄J4>KU的5〗."Charr紐tP改toColsm琉o!ogy",4体，啦ti9n,^)iih讨加y^4.召on.白BaiYL，Hti，gCG，v站d纽fcMgi〗erDekens,，Bop&^xtaQ，？4;adiioptf(2i3购forto邮t.oj)idei^;.mil4e,wr'esisj^ee—0/.—鄉ifl;..Lyep-ersiconpgrviflorVi叫G1.16QicQ-l。b^ili加Withtwoj^ialitatlye.ii.oW(iefy'ijj.(iewtesist.a:nce.gene.s.it/oZ,i《cwi《w,^h&e〖n.ferac《i'07is'16:i6.9-176,BenitoEP，tenHaveA，V&ft'tKlppstet:,JW，yapK&nJAL(199$)Jfuii长alandjj'l'amt、ge站expressionduringsynchjroiii的dinfection.ofto迈ato.leave甲bySW77"sc&erec(,fc.J.H卵,尸fl^。1104:207，220.B.ern&cch.i:D，T.anksley$D.(1.的7).An.intefspeG迅c'baqkciro朋ofLiycopet.siconlycopersicumxhir.siat卿Xinkageianalysiand.aQ饥s加dy.ofsexual-cpmp.atiMUtyfactorsandfloraltraits,(e"g"es147:86.1-877.BrugmaiiSB，vander过ul对BGM，Vi卵erRGF,L組dhoutP，vaiiEcj5HJ(20Q3)Anewandversatileixiettod.fQrtjies恥cess&lco.nversicmofAFLP(TM)markersinto.simple.sin^te.l鄉smarfer3.JV"c続resecwrcA31;'鄉—9陽郷—17C&iiadyMA，MieglitsV，Chetelat(2005)AlibraryofSolaftumlyeopersicoi(i印intr,o.gy印sionlines:i;n.c必iyatedtomato,.(抓ome48:'685-697.ChristouP，Murphy.J妇，andSw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的或者S./ycopew'CMm的染色体6上的遗传标记P22M50-188h、P14M48隱521e、P15M48-386h、P18M51隱199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e和P22M50-513h的基因组区域表示，-其中所述QTL在所述植物的染色体9上的位置由包含5*./z^rac/za/^的染色体9上的或者S./_ycopeM/cMm的染色体9上的遗传标记P18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50隱599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60陽157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h和P14M50-276h的基因组区域表示，-其中所述QTL在所述植物的染色体11上的位置由包含51./2"6rac/z"/fey的染色体11上的或者》S./_ycopeM/cMm的染色体11上的遗传标记P14M60陽215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51-358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h和P22M51-174e的基因组区域表示，及-其中所述QTL在所述植物的染色体12上的位置由包含S./z^rac/^'b的染色体12上的或者S./^opera/cwm的染色体12上的遗传标记CT19、TG68、P14M48-411e、P18M50画244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50画321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h和P22M51-135h的基因组区域表示，优选由包含S./^6rac/^fey的染色体12上的或者&/ycopera/cMm的染色体12上的遗传标记P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61匿223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50画321e、P14M60陽219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因组区域表示。14.在基因组内包含至少一个QTL或者其赋予^^少to抗性部分的S./_yco;era/cMm种So^yfe抗性植物或其部分，其中所述QTL选自由与So^y^抗性相关的So/aMwm/2"6rac/^zfes染色体4、6、9、11和12上的QTL组成的一组，-其中所述QTL在所述植物的染色体4上的位置由包含51./2^rac/zm'to的染色体4上的或者5*./少c印erw'CMm的染色体4上的遗传标记CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因组区域表示，其中所述QTL或者所述QTL的赋予So^y的抗性部分不在其天然遗传背景中，-其中所述植物任选进一步包含与5o^yto抗性相关的一或多个另外的QTL或者其赋予Sorryto抗性的部分，所述QTL选自So/a做w/^rac/za"^、优选So/aw画/^rac/w/to品系LYC4〃8的染色体1、2禾口/或4上的QTL，其中所述另外的QTL在所述植物的染色体4上的位置由包含S./zWrac/^'tes的染色体4上的或者S./yco/^s/cMm的染色体4、更优选S./2a6rac/za/fesLYC4/78的染色体4上的或S.(ycope^/cwmcv.Moneymaker的染色体4上的遗传标记P18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e、P14M61陽292.7h、TG609、P14M48-345e、P14M48-177e和P18M50-147e的基因组区域表示。15.权利要求14的植物，其中所述QTL在染色体1、2、6、9、11禾口/或12上的位置如权利要求1、2和/或7所述。16.—种产生So^yfe抗性近交系番茄植物的方法，包括a)产生权利要求l-9任一项的&"他抗性番茄植物；b)将所述抗性番茄植物自交或者与另一番茄植物杂交产生后代番茄种子；c)使步骤b)的所述后代番茄种子生长，产生另外的^^yto抗性番茄植物；d)重复杂交和生长步骤0-7次，以产生万W^to抗性近交系番茄植物。17.权利要求16的方法，其中步骤c)进一步包括鉴别呈现抗性并具有希望的商业特性的植物。18.权利要求16或17的方法，其中所述方法进一步包括选择纯合的近交系番茄植物的步骤。19.根据权利要求16-18任一项的方法可获得的5o岬他抗性近交系番茄植物或其部分。20.呈现ft^y&抗性的杂交的番茄植物或其部分，其中所述杂交的番茄植物可通过将根据权利要求16-18任一项的方法可获得的S^o;他抗性近交系番茄植物与呈现希望的商业特性的近交系番茄植物杂交而获得。21.权利要求10、14、15、19或20任一项的番茄植物的可再生细胞的组织培养物，优选所述可再生细胞包括分离自选自如下一组的组织的细胞或原生质体，所述的组由叶、花粉、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎和种子组成。22.选自表1-5列出的遗传标记的遗传标记在检测Bo/o^'^抗性QTL和/或检测抗性番茄植物中的应用。全文摘要本发明涉及检测与番茄中Botrytiscinerea抗性相关的数量性状基因座(QTL)的方法，包括将Botrytis抗性供体番茄植物与非抗性或者Botrytis易感的受体番茄植物杂交，将一或多个后代植物与感染量的Botrytis接触，定量确定所述一或多个后代植物中的发病率和/或病斑生长速度，建立将观测到的所述一或多个后代植物中发病率和/或病斑生长速度与所述供体番茄植物中染色体标记的存在联系起来的遗传连锁图，并将所述连锁图上与降低发病率和/或降低病斑生长速度相关的连续标记指定给QTL。文档编号C12N15/82GK101479386SQ200780023889公开日2009年7月8日申请日期2007年4月25日优先权日2006年4月25日发明者A·W·范赫于斯登,H·J·芬克斯,P·C·马里斯,W·H·林德豪特申请人:德鲁伊特种子研发有限公司