专利名称：：选择高水平表达蛋白质的宿主细胞的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和生物
技术领域：
。更具体的，本发明涉及用于对选择高水平表达蛋白质的宿主细胞进行改进的手段(means)和方法。可以在多种宿主细胞中生产蛋白质用于广泛的生物学和生物技术应用，例如作为生物药物。对于该目的，例如在这些蛋白质具有某些翻译后修饰例如糖基化时，优选真核宿主细胞特别是哺乳动物宿主细胞用于表达许多蛋白质。已经充分建立了这类生产的方法，通常包括在宿主细胞中表达编码感兴趣蛋白质的核酸(也被称作"转基因")。通常将转基因连同可选择标记基因引入到前体细胞中，对细胞进行可选择标记基因表达的选择，对一个或者多个高水平表达感兴趣蛋白质的克隆进行鉴定并用于表达所感兴趣的蛋白质。选择表达相对高水平期望蛋白质的重组宿主细胞的方法是已知的(参见例如在WO2006/048459和US2006/0141577中的介绍)。国际申请PCT/EP2005/055794(公开为WO2006/048459)中公开了一种选择表达高水平感兴趣的多肽的宿主细胞的新理念，其中该国际申请是在本申请的优先权日之前提交，但在本申请的优先权日之后公开的。美国专利申请No.11/359,953(公开为US2006/0141577)和国际申请PCT/EP2007/051696公开了替换的方法，其中这两份申请也是在本申请的优先权日之前提交，但在本申请的优先权日之后公开的。简言之，这些申请教导使用具有非ATG起始密码子如GTG或TTG的编码可选择标记多肽的序列。这达到了可以以高严格性选择克隆，并用于获得表达水平非常高的宿主细胞的克隆。本发明旨在提供进一步改进的途径和方法用于选择表达高水平感兴趣蛋白质的宿主细胞。发明概述在本文中通过参照将申请PCT/EP2005/055794(WO2006/048459)，US11/359,953(US2006/0141577)和PCT/EP2007/051696的公开内容整体并入。简言之，这些申请教导使用具有非ATG起始密码子如GTG或TTG的编码可选择标记多肽的序列。这达到了可以以高严格性选择克隆，并用于获得表达水平非常高的宿主细胞的克隆。本发明公开了具有GTG或TTG起始密码子的改进的可选择标记基因。例如，这些改进的可选择标记基因可以用于在WO2006/048459和US2006/0141577中所公开的转录单位及其所使用的方法中。这获得了进一步改进的高表达水平宿主细胞(的选择)。在一个方面中，本发明提供了一种DNA分子，其包含编码可选择标记多肽的开放阅读框序列，其中所述编码链中的所述DNA分子包含选自由a)GTG起始密码子，和b)TTG起始密码子所组成组的可选择标记多肽的翻译起始序列；其中与编码可选择标记蛋白质的原始开放阅读框序列相比，编码所述可选择标记蛋白质的开放阅读框序列已经被突变以替换其至少一半的CpG二核苷酸。在优选的实施方式中，可选择标记蛋白质提供了针对选择剂例如抗生素致死和/或生长抑制效果的抗性。在某些实施方式中，可选择标记多肽提供了针对Zeocin或针对新霉素的抗性。本发明还提供了一种根据本发明的DNA分子，其中编码所述可选择标记多肽的开放阅读框是多顺反子转录单位的一部分，其中所述多顺反子转录单位还包含编码感兴趣的多肽的开放阅读框序列。本发明还提供了一种包含这类DNA分子的表达盒，所述表达盒包含在所述多顺反子转录单位上游的启动子，以及优选在所述多顺反子转录单位的下游具有转录终止序列。本发明还提供了包含根据本发明的DNA分子或表达盒的宿主细胞。本发明还提供了一种表达感兴趣的多肽的方法，其包括培养包含本发明表达盒的宿主细胞，以及从所述表达盒表达所感兴趣的多肽。图1.在CHO-K1细胞中利用CpG含量减少的Zeocin抗性标记物的结果。点表示单独的数据点，线表示平均表达水平；垂直轴表示d2EGFP信号。详细内容参见实施例1。图2.除在CHO-DG44细胞中外，与图1相同。详细内容参见实施例1。图3.使用具有不同突变的"贫CpG"的新霉素抗性标记的结果。点表示单独的数据点，线表示平均表达水平；垂直轴表示d2EGFP信号。详细内容参见实施例2。发明详述术语"单顺反子基因"被定义为能够提供编码一种多肽的RNA的基因。"多顺反子转录单位"也被称作多顺反子基因，被定义为能提供编码至少两种多肽的RNA分子的基因。术语"双顺反子基因"被定义为能够提供编码两种多肽的RNA分子的基因。因此，双顺反子基因包含在多顺反子基因的定义内。本文中所使用的"多肽"包含通过肽键连接的至少五个氨基酸，例如可以是蛋白质或其一部分例如亚基。多肽可以包含翻译后修饰例如糖基化。通常，术语多肽和蛋白质在本文中是可以互换使用的。在本发明中所使用的"基因"或"转录单位"可以包括染色体DNA、cDNA、人工DNA及其组合等。"可操作地连接"是指允许所描述组分以期望的方式发挥功能的位置关系。因此，例如"可操作地连接"到顺反子的启动子是以一种在与启动子兼容的条件下达到表达顺反子的模式进行连接。类似的，可操作地连接于顺反子的IRES核苷酸序列，是以在与IRES兼容的条件下达到翻译顺反子的模式进行连接。本发明的DNA分子可以以双链DNA的形式存在，关于可选择标记多肽和感兴趣的多肽，其具有编码链和非编码链，其中除了存在T替换U以外，所述编码链具有与被翻译的RNA相同的序列。因此，AUG起始密码子是由编码链中的ATG序列所编码的，包含对应RNA中AUG起始密码子的该ATG序列的链被称作DNA的编码链。对于本领域技术人员明显的是，实际上起始密码子或翻译起始序列存在于RNA分子中，但是这些可以被等价地认为包含在编码这类RNA分子的DNA分子中；因此，除非以其他方式明确说明，无论在本发明中何处提到起始密码子或翻译起始序列，是为了包括除了在所述DNA分子的编码链中存在T替换U外具有与RNA序列相同序列的相应DNA分子，反之亦然。换句话说例如起始密码子是RNA中的AUG序列，但在本发明中DNA编码链中相应的ATG序列也被称作起始密码子。同样的还用于引用"符合阅读框的"编码序列，其意思是被翻译成氨基酸的RNA分子中的三联体(三个碱基)，但也被解释成DNA分子的编码链中相应的三核苷酸序列。在本领域中翻译起始序列通常被称作"Kozak序列"，最佳的Kozak序列是RCCATGG，下划线的是起始密码子，R是嘌呤即A或G(参见KozakM，1986，1987,1989，1990，1997，2002)。因此，除了起始密码子本身外，其背景特别是-31和+4位核苷酸是有关的，最佳的翻译起始序列包括在最佳背景(即ATG之前即是RCC，之后即跟着G)中的最佳启动密码子(即ATG)()。在存在Kozak序列时，核糖体翻译最有效(参见KozakM，1986，1987，1989,19卯，1997，2002)。然而，在小比例事件中，核糖体识别并使用非最佳翻译起始序列来起始翻译。本发明利用该原理，能够减少翻译进而表达可选择标记多肽的量，因此这被用于提高选择系统的严格性。术语"选择标记"或"可选择标记"通常用于指可以直接或间接检测其在细胞中存在的基因和/或蛋白质，例如使选择剂失活并保护宿主细胞免于药物致死或生长抑制作用的多肽(例如抗生素抗性基因和/或蛋白质)。可选择标记多肽是本领域中公知的，并且在要获得真核宿主细胞时被常规使用，WO2006/048459中提供了许多适当的可选择标记蛋白质的某些例子。编码这类可选择标记多肽的DNA序列是己知的，WO2006/048459提供了编码可选择标记蛋白质的DNA野生型序列的某些例子(例如其中的图15~21，通过参照并入本文中)。明显的是也可以适当使用可选择标记的突变体或衍生物，因此只要所述可选择标记蛋白质仍然发挥功能，就包括在术语"可选择标记多肽"的范围内。例如还包括由于遗传密码冗余性而不改变所编码蛋白质的任何沉默突变。还包括其他导致保守氨基酸突变或其他突变的突变，只要所编码的蛋白质仍具有活性，该活性可以比指定序列所编码野生型蛋白质的活性低，或者可以不低于所指定序列所编码野生型蛋白质的活性。特别的，优选所编码的蛋白质与由分别指定序列所编码蛋白质具有至少70%，优选至少80%，更优选至少卯％，更加优选至少95%的同一性。可以通过常规的方法完成对可选择标记蛋白质活性的测试。根据本发明的可选择标记多肽是由核酸编码的蛋白质，其中所述多肽功能上被用于选择，例如由于其提供了对选择剂例如抗生素的抗性。因此，如果使用抗生素作为选择剂，则DNA编码提供对所述选择剂抗性的多肽，该多肽是可选择标记多肽。可选择标记多肽是由本发明的DNA所编码的。根据本发明的可选择标记多肽必须在真核宿主细胞中有功能，因此能够被选择用于真核宿主细胞中。对于本发明适当的可选择标记基因的例子是Zoecin和新霉素。其他适当的候选物包括例如杀稻瘟菌素、嘌呤霉素、博来霉素、潮霉素、DHFR、GS等(同样参见WO2006/048459)。其他可以使用的可选择标记基因以及它们的选择剂被列举在例如美国专利5，561，053的表1中；还可以参见Kaufinan,MethodsinEnzymology，185:537-566(1990)，或者这些的综述。术语"选择"通常被定义为使用选择标记/可选择标记以及选择剂以鉴定具有具体遗传特征的宿主细胞(例如宿主细胞包含整合到其基因组上的转基因)的过程。为了方便并且通常本领域技术人员能够接受，在许多出版物以及本文中，经常讲编码对选择剂抗性的基因和蛋白质分别称作"可选择剂(抗性)基因"或"选择剂(抗性)蛋白质"，尽管正式名称可能不同，例如编码提供对新霉素(以及对G418和卡那霉素)抗性的蛋白质的基因经常被称作新霉素(抗性)(或nec/)基因，而其正式名称为氨基葡糖苷3，-磷酸转移酶基因。WO2006/048459和US2006/0141577在优选的实施方式中编码可选择标记蛋白质的序列具有GTG起始密码子，或者更优选TTG起始密码子。这达到了非常严格的选择以及在所获得的克隆中蛋白质非常高水平的表达。在本发明中，通过降低其中CpG的含量对可选择标记蛋白质的编码序列进行进一步改进，这达到了更高的严格性以及进一步提高的表达水平。优选，可选择标记多肽编码链中的翻译起始序列包含TTG起始密码子。优选GTG或TTG起始密码子的侧面是提供对非ATG序列相对好地识别为起始密码子的序列，以便至少某些核糖体从这些起始密码子开始翻译，即翻译起始序列优选包含序列ACC[GTG或TTG起始密码子]G或者GCC[GTG或TTG起始密码子]G。在一个方面中，本发明提供了一种DNA分子，其包含编码可选择标记多肽的开放阅读框序列，其中编码链中的DNA分子包含选自由a)GTG起始密码子和b)TTG起始密码子所组成组的可选择标记多肽的翻译起始序列；其中与编码可选择标记蛋白质的原始开放阅读框序列相比，编码所述可选择标记蛋白质的开放阅读框序列已经被突变以替换至少10%的CpG二核苷酸(该序列中的所有"CG")。根据本发明，通过选择可选择标记多肽的表达，这类DNA分子可以用于获得表达高水平感兴趣的多肽的真核宿主细胞。接着，或者同时，可以鉴定一种或者多种表达感兴趣的多肽的宿主细胞，并进一步用于表达高水平的感兴趣的多肽。本文中显示本发明可选择标记基因(即具有TTG或GTG起始密码子)中CpG含量的降低能够引起感兴趣的多肽提高的表达，其中所述感兴趣的多肽是从同样翻译出可选择标记多肽的多顺反子转录单位中翻译的。不希望受到理论的限制，相信，CpG含量的降低可以降低转录沉默的可能性，因为在真核细胞中CpG二核苷酸能够被甲基化并沉默。具有相对高CpG含量的基因所编码的可选择标记多肽通常来自细菌序列，例如Zeocin和新霉素可以最大受益于CpG含量的降低，尽管已经发现具有相对低CpG含量的选择基因的某些益处。在某些实施方式中，从编码可选择标记多肽的序列中除去CpG二核苷酸而不改变所编码的氨基酸序列。可以通过利用遗传密码子的冗余性完成这一点，并且对于分子生物学领域普通技术人员而言是公知并且常规的。期望在可选择标记基因的编码序列中至少10%的CpG二核苷酸已经被替换时，除去CpG二核苷酸的积极效果是明显的。期望除去更多的CpG二核苷酸会提高效果，因此在某些实施方式中，与编码可选择标记蛋白质的原始幵放阅读框序列相比，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的CpG二核苷酸被突变。在某些有利的实施方式中，与编码可选择标记多肽的原始开放阅读框序列相比，编码可选择标记多肽的开放阅读框序列中至少一半CpG二核苷酸被替换。SEQ.ID.NO.l(包含内部ATG)给出了编码提供对Zeocin抗性的可选择标记多肽的原始开放阅读框序列()，在该序列中第280位的A突变成T提供了缺少内部ATG的序列，其中在第94位内部编码的甲硫氨酸被替换成为亮氨酸。对于本发明的DNA序列，起始密码子(DNA序列的开始三个核苷酸)被突变成GTG起始密码子或突变成TTG起始密码子。在某些有利的实施方式中，可选择标记多肽提供了针对Zeodn的抗性。在其某些实施方式中，DNA分子包含SEQ，ID.NO.1，其中至少一半CpG二核苷酸已经被替换而没有突变所编码的氨基酸序列，前提是起始密码子(DNA序列的开始三个核苷酸)被替换为选自GTG或TTG的起始密码子。在替换的实施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.1，其中第280位的核苷酸A被替换为T，以便第94位氨基酸(甲硫氨酸)被替换为亮氨酸，其中至少一半CpG二核苷酸已经被替换而没有突变所编码的氨基酸序列，前提是起始密码子(DNA序列的开始三个核苷酸)被替换为选自GTG或TTG的起始密码子。该实施方式在Zeodn抗性基因的编码序列中缺少ATG序列，因此其适合本发明的多顺反子转录单位，其中可选择标记多肽的编码序列在感兴趣的多肽编码序列的上游。在本发明的一个优选实施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.3。SEQ.ID.NO.5(包含内部ATG)和SEQ.ID.NO.7(缺少内部ATG)中给出了编码提供对新霉素抗性的可选择标记多肽的原始开放阅读框。在有利的实施方式中，这些序列可以包含一个或者更多个其他的突变，以便所编码的多肽在第201位缬氨酸突变成甘氨酸(201V〉G)，第185位的谷氨酸突变成天冬氨酸(185E〉D)，或者都突变(185E〉D，201V>G)。在其他有利的实施方式中，可选择标记多肽提供了针对新霉素的抗性。在本发明的某些实施方式中，DNA分子包含选自由a)SEQ.ID.N0.5，前提是至少一半CpG二核苷酸已经被替换而没有突变所编码的氨基酸序列，进一步的前提是起始密码子(开始的ATG序列)被替换为GTG或TTG;b)SEQ.ID.NO.7，前提是至少一半CpG二核苷酸已经被替换而没有突变所编码的氨基酸序列，进一步的前提是起始密码子(开始的ATG序列)被替换为GTG或TTG;和c)SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.7中任意一种所组成的组，与所指定序列编码的序列相比，其包含突变以编码新霉素抗性蛋白质变体，所述变体在所编码蛋白质的第201位具有甘氨酸(201G变体)，或者在第185位具有天冬氨酸(185D变体)或者同时在第201位具有甘氨酸在第185位具有天冬氨酸(185D，201G变体)，前提是给定DNA序列中至少一半CpG二核苷酸已经被替换而没有进一步突变所编码的氨基酸序列，进一步的前提是起始密码子(开始的ATG序列)被替换为GTG或TTG。例如185D变体是通过将所提供核酸序列中第553555位的密码子替换为GAC而获得的，例如201G变体是通过将给定核酸序列中第601~603位的密码子替换为GGT而获得的。在一个优选的实施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.9，前提是第555位的核苷酸A被替换为C(以编码185E>D变体)，第602位的核苷酸T替换为G并且第603位的核苷酸G被替换为T(以编码201V>G变体)，进一步的前体是启动密码子(第1~3位的ATG)被替换为GTG或TTG。对于本领域技术人员明显的是本领域技术人员可以制备其他的变体而不离开本发明的教导，因此只要启动密码子不是ATG并且所编码的蛋白质提供针对新霉素(或G418)的抗性则这些其他的变体也包含在本发明中。185D和201G变体进一步提高了本发明的选择严格性。在某些实施方式中，可选择标记多肽还包含与野生型对应物相比降低可选择标记多肽活性的突变。这可以用于进一步提高选择的严格性。作为非限制性实施例，可以对Zeocin抗性多肽中第9位的脯氨酸进行突变，例如突变成Thr或Phe，对于新霉素抗性多肽，则第182位或第261位的氨基酸或者两个氨基酸都可以被进一步突变(参见例如WO01/32901)。原则上，本发明编码可选择标记多肽的DNA分子可以用于任何表达载体中，例如作为单顺反子基因。他们提供了严格的选择标准。然而在优选的实施方式中，编码可选择标记多肽的ORF是还包含编码感兴趣的多肽的ORF的多顺反子转录单位的一部分。本发明的多顺反子转录单位可以是例如包含编码5'到3'为可选择标记多肽和感兴趣的多肽的序列的多顺反子转录单位，或者例如包含编码5'到3，为感兴趣多肽和可选择标记多肽的序列的多顺反子转录单位。在前一种情况中，优选可选择标记多肽的编码序列在编码链中不含ATG序列(参见WO2006/048459)。在后一种情况中，从可选择标记多肽编码序列的上游编码感兴趣的多肽，并且内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接于编码可选择标记多肽的序列，因此可选择标记多肽依赖IRES进行其翻译(参见US2006/0141577)。因此，在一个实施方式中，本发明的多顺反子转录单位按照下列顺序包含a)启动子；b)编码可选择标记蛋白质的序列；以及C)编码感兴趣蛋白质的序列。在另一个实施方式中，本发明的多顺反子转录单位按照下列顺序包含a)启动子；b)编码感兴趣蛋白质的序列；以及C)内部核糖体进入位点(IRES)，其可操作地连接于d)编码可选择标记蛋白质的序列。在某些实施方式中，多顺反子转录单位在第二顺反子的下游包含第三顺反子，所述第三顺反子优选可操作地连接于IRES,例如第三顺反子是编码第二可选择标记多肽。在某些实施方式中这种第二可选择标记多肽是DHFR，优选具有GTG或TTG起始密码子以能够在dhfr缺陷型细胞中进行连续选择(参见例如PCT/EP2007/0516%，在本文中通过参照并入)。在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明DNA分子的表达盒，其中所述表达盒在本发明多顺反子转录单位的上游包含启动子，以及在本发明多顺反子转录单位的下游包含转录终止序列。在真核宿主细胞中，所述表达盒是有功能的，用于驱动多顺反子转录单位的转录。在本文中所使用的"表达盒"是至少包含功能上连接于期望表达序列的启动子的核酸序列。优选，表达盒还包含转录终止和聚腺苷酸化序列。适当的启动子和转录终止/聚腺苷酸化序列的例子是公知的，并易于被本领域技术人员获得，例如在WO2006/048459，第28~29页中所讨论的，在本文中通过参照并入。还可以包含其他调控序列例如增强子。启动子必须能够在真核宿主细胞中发挥作用，即其必须能够驱动转录单位的转录。因此，启动子可操作地连接于转录单位。表达盒可以可选择地还包含本领域中己知的其他元件例如剪切位点以包含内含子等。在可选择标记多肽是在感兴趣的多肽的下游被编码的实施方式中，IRES被可操作地连接于包含编码可选择标记多肽序列的顺反子。在可选择标记多肽是在感兴趣的多肽的上游被编码的实施方式中，编码可选择标记多肽的序列在编码链中不包含ATG序列。本文中所使用的"内部核糖体进入位点"或"IRES"是指促进内部核糖体直接进入起始密码子的元件，例如通常为顺反子(编码蛋白质的区域)的ATG，但在本发明中优选为GTG或TTG，使得基因不依赖于帽进行翻译。IRES序列和其应用对于本领域技术人员是公知的，如在US2006/0141577和PCT/EP2007/051696中所教导的，在本文中通过参照并入US2006/0141577和PCT/EP2007/051696。还参见例如JacksonRJ，HowellMT，KaminskiA(1990)TrendsBiochemSci15(12):477-83)，JacksonRJandKaminski,A.(1995)RNA1(10):985-1000，Martinez-Salas，1999，Venkatesan&Dasgupta，2001，Rees等人，1996和Mizuguchi等人，2000。在US2006/0141577(其中的SEQIDNO.127)的实施例19中提供了适当的IRES序列的例子，在本文中通过参照并入。可以通过本领域技术人员能够利用的标准分子生物学方法产生本发明的DNA分子。例如，可以通过常规的方法对原始序列例如来自商业上可以获得的质粒进行突变。此外，目前还可以任意合成(如果需要，使用亚克隆步骤)具有可选择标记多肽ORF的充分长度的DNA序列，目前这类合成的DNA序列可以从各种公司商业订购。因此，根据本发明的教导，本领域技术人员可以设计本发明编码可选择标记多肽的适当序列(具有GTG或TTG起始密码子，CpG含量降低，在某些实施方式中不包含内部ATG)，合成该序列，并且通过将该DNA分子引入到真核宿主细胞中对DNA分子测试所编码可选择标记的功能，以及测试发挥功能的可选择标记多肽的表达。这些序列的商业可获得性使得便于提供缺少内部的ATG编码选择标记的序列而没有过分的压力，其中选择标记多肽的野生型序列包含某些这类的内部ATG(参见WO2006/048459)。在某些实施方式中，本发明的DNA分子是载体如质粒的一部分。通过本领域技术人员公知的方法，容易对这些载体进行处理，例如可以被设计成能够在原核细胞和/或真核细胞中复制。另外，许多载体可以直接或者以从其分离的期望片段的形式用于转化真核细胞，并能够全部或部分整合到这些细胞的基因组中，得到在它们的基因组中包含期望核酸的稳定宿主细胞。所使用的载体可以是任何适合克隆DNA的载体，并能够用于感兴趣核酸的转录。在使用宿主细胞吋，优选所述载体是整合型载体。可替换的，所述载体可以是游离复制型载体。广泛接受的是染色质结构和其它外遗传调控机制可以影响转基因在真核细胞中的表达(例如Whitelaw等人，2001)。本发明的多顺反子表达单位形成了选择体系的一部分，其具有相当严格的选择方案。通常，这需要在所选择宿主细胞中的高转录水平。为了提高发现在严格选择方案中存活的宿主细胞克隆的机会，并可能提高在所获得克隆中表达的稳定性，通常优选提高转录的可预测性。因此，在优选的实施方式中，本发明的表达盒还包含至少一个染色质调控元件。本文中所使用的"染色质调控元件"是能够以某种方式影响染色质结构，进而在真核细胞中影响邻近转基因的表达水平和/或稳定性(它们顺式发挥作用，因此优选置于距离转基因5kb以内，更优选在2kb以内，更加优选在lkb以内)的DNA序列的总称。优选这类染色质调控元件选自由绝缘子序列、遍在染色质开放元件(UCOE)、基质或支架附着区(MAR/SAR)和抗阻抑物(STAR)序列所组成的组。在WO2006/048459第32~37页提供了染色质调控元件的例子以及获得和使用它们以及功能上进行测试的方法，通过参照并入本文中。在某些实施方式中，所述至少一个染色质调控元件是抗阻抑物元件，其选自由WO2006/048459中SEQ.ID.NO.1~SEQ.ID.NO.66的任何一种及其片段所组成的组。在其某些实施方式中，所述表达盒包含WO2006/048459的SEQ.ID.NO.66或其片段，其位于驱动多顺反子转录单位转录的启动子的上游。在其它一些实施方式中，多顺反子转录单位的两侧连接至少一个抗阻抑物序列，所述抗阻抑物序列选自由WO2006/048459中SEQ.ID.NO.1~SEQ.ID.NO.65的任何一种或其片段所组成的组。优选，所述染色质调控元件选自由STAR67、STAR7、STAR9、STAR17、STAR27、STAR29、STAR43、STAR44、STAR45、STAR47、STAR61或所述STAR序列的功能片段或衍生物所组成的组(参见例如WO2006/048459获得这些STAR元件的序列和优选应用，通过参照并入本文中)。本发明的感兴趣的多肽可以是任何蛋白质，并且可以是单体蛋白质或者多聚体蛋白质(的一部分)。多聚体蛋白质包含至少两条多肽链。本发明感兴趣蛋白质的非限制性例子是酶、激素、免疫球蛋白链、诸如抗癌蛋白质的治疗性蛋白质、诸如VIII因子的血液凝集蛋白质、诸如红细胞生成素的多功能蛋白质、诊断性蛋白质，或者可以用于免疫目的的蛋白质或其片段，所有都是本领域技术人员已知的。感兴趣的多肽可以来自任何来源，在某些实施方式中是哺乳动物蛋白质、人工蛋白质(例如融合蛋白或突变的蛋白质)，并优选是人蛋白质。包含本发明的多顺反子转录单位和/或表达盒的DNA分子可以用于提高核酸的表达，优选在宿主细胞中。术语"细胞"/"宿主细胞"和"细胞系"/"宿主细胞系"通常分别被定义为通过本领域中已知的方法可以维持在细胞培养中并且具有表达异源或同源蛋白质能力的细胞和其均一的群体。本发明还提供了包含本发明DNA分子或表达盒的宿主细胞。原核宿主细胞可以用于繁殖和/或使用本发明的DNA分子进行遗传工程。本发明的DNA分子，特别是出现在质粒上时能够在原核宿主细胞例如细菌中复制。根据本发明的宿主细胞优选是真核细胞，更优选哺乳动物细胞，例如啮齿类动物(例如小鼠、仓鼠)细胞或人细胞或者不同细胞的融合。在某些非限制性实施方式中，所述细胞是U-20S骨肉瘤、HEK293、HuNS-l骨髓瘤、WERI-Rb陽l眼癌、BHK、COS、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO、NCI-H295R肾上腺癌或PEILC6②细胞。对于本发明的目的，PER.C6细胞的意思是在ECACCno.96022940保藏的细胞(参见例如美国专利5,994,128)传代的上游或下游，或者其上游或下游的派生物即具有这些细胞特征。之前已经显示这些细胞能够以高水平表达蛋白质(例如WO00/63403和Jones等人，2003)。在某些优选的实施方式中，宿主细胞是CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44、CHO-DUKXB11等。在某些实施方式中，所述CHO细胞具有dhfr—表型。这些真核宿主细胞能够表达期望的多肽，并且通常用于该目的。能够通过将本发明的DNA分子优选以表达盒的形式引入到细胞中，获得这些真核宿主细胞。优选，表达盒被整合到宿主细胞的基因组中，在各种宿主细胞中可以整合在基因组的不同位置中，选择将提供转基因被整合到适当位置的克隆，这得到了在表达水平、稳定性、生长特征等方面具有期望性能的宿主细胞克隆。可替换的，可以靶向或随即选择转录单位用于整合到转录活跃的染色体区域例如在基因组中所存在启动子的后面。优选，宿主细胞来自根据本领域技术人员己知的标准程序可以选择并增殖的稳定克隆。如果细胞包含编码感兴趣的多肽的转录单位，则这类克隆的培养物能够产生感兴趣的多肽。本发明还提供了一种产生能够表达感兴趣多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括步骤a)将本发明的DNA分子或表达盒引入到多个前体细胞中，b)在适合表达可选择标记多肽的条件下培养这些前体细胞，以及c)选择至少一个表达所述可选择标记多肽的宿主细胞。完成对可选择标记多肽表达的选择，例如通过施加选择压力(例如在存在选择剂时培养)，并将保证在本发明的多顺反子转录单位和表达盒中感兴趣的多肽的表达。在所获得克隆与期望多肽高表达的克隆的比例方面，该新型方法提供了非常好的结果使用相同浓度的选择剂获得了比使用已知的选择系统少得多的集落，以及相对高比例的所获得克隆以高水平产生感兴趣的多肽。本发明还提供了一种生产感兴趣的多肽的方法，其包括培养包含本发明表达盒的宿主细胞，以在所述细胞中表达编码感兴趣蛋白质的核酸。在优选的实施方式中，从所述细胞或这从培养基中或者同时从两者中收获感兴趣的蛋白质。在优选的实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。可以通过多种方法之一完成在细胞中引入待表达的核酸，同样这也是本领域技术人员所已知的，也依赖于所要引入核酸的模式。所述方法包括但不限于转染、感染、注射、转化等。在某些实施方式中至少在培养过程中的部分时间内，在培养基中存在选择剂，其浓度足以选择表达可选择标记多肽的细胞，或者以较低的浓度。在其他实施方式中，如果表达多肽，则在生产阶段，在培养基中不再出现选择剂。进行培养细胞，以使其能够代谢和/或生长和/或分裂和/或生产感兴趣的重组蛋白。这可以通过本领域技术人员熟知的方法完成，其包括但不限于为细胞提供营养物。这些方法包括附着到表面的生长，在悬浮液中的生长，或其组合。例如可以在盘、滚瓶或者在生物反应器中使用分批系统、补料分批系统、连续系统例如灌注系统等进行培养。为了达到通过细胞培养大规模(连续)生产重组蛋白质，本领域中优选使用能够在悬浮液中生长的细胞，并且优选使用在无血清甚至无蛋白质的培养基中能够生长的细胞。细胞生长和繁殖的条件(参见例如TissueCulture,AcademicPress,Kruse和Paterson，编辑(1973))以及表达重组蛋白的条件是本领域技术人员已知的。通常，可以在哺乳动物细胞生物技术实用方法(MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach)(M.Butler，ed.，IRLPress,1991)中发现用于使哺乳动物培养物产量最大化的原理、方案和实用技术。在优选的实施方式中，从细胞或者从培养基或者从二者收集(分离)表达的蛋白质。接着可以使用己知的方法进行进一步纯化，例如通过本领域技术人员公知的方法进行过滤、柱层析等。显然，在最终目的不是生产感兴趣的多肽，而是RNA本身时，也可以使用该结构的表达盒，例如用于从表达盒来生产量提高的RNA，其可以用于调节其他基因的目的(例如RNAi，反义RNA)、基因治疗、体外蛋白质生产等。除非以其他方式明确说明，本发明的实践将采用在本领域技术范围内的免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的传统技术。参见，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验室手册第2版(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition),1989;分子生物学当前方案(CmrentProtocolsinMolecularBiology),AusubelFM，etal，eds，1987;酶学系列手册(theseriesMethodsinEnzymology)(AcademicPress,Inc.);PCR2:实用方法(PCR2:APracticalApproach),MacPhersonMJ，HamsBD，TaylorGR,编辑，1995;抗体实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual),Harlow和Lane，编辑，1988。在下面的实施例中对本发明进行进一步解释。这些实施例不以任何方式限制本发明。它们仅仅是为了阐明本发明。实施例实施例1:从编码可选择标记的序列除去CpG二核苷酸提高了使用本发明选择方法的表达使用可选择标记的不同翻译起始密码子如GTG或TTG的选择方法可以达到非常严格的选择，并且感兴趣的多肽非常高水平地产生感兴趣的多肽(参见WO2006/048459和US2006/0141577，例如后者中的实施例119)。在该实施例中，通过除去CpG二核苷酸对可选择标记多肽基因本身的编码区进行修饰。基本原理是CpG核苷酸中的C核苷酸可以倾向于甲基化，这可能导致可选择标记的基因沉默，因此除去CpG二核苷酸可能改进结果。采用具有TTG起始密码子的Zeocin抗性基因作为标记，尽可能除去CpG二核苷酸，而不改变Zeocin抗性蛋白质的氨基酸序列，进一步不在编码链中引入ATG序列以防止在Zeocin抗性蛋白质的编码区中不期望的翻译起始(例如在WO2006/048459中所解释的)。因此，某些CG未被除去。原始序列的CpG含量(此处:包含TTG起始密码子，突变以除去内部ATG序列)为13.3%，而在CpG突变之后，CpG含量降低到1.8%[称作"TTGZeo(贫CpG)"]。在d2EGFP编码区的上游克隆CpG含量降低的Zeocin抗性基因以得到多顺反子表达构建体。检测d2EGFP的表达水平。制备构建体，其在CMV启动子的上游包含STAR7和67，接着是TTGZeo(贫CpG)选择标记(GeneArtGmbH，Regensburg，Germany合成，参见SEQ.ID.NO3;参见SEQ.ID.NO.l，具有天然CpG含量的Zeocin抗性编码序列)，d2EGFP基因和STAR7(图1)。将这些构建体转染到CHO-K1细胞。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染DNA，在补加10%FBS(Invitrogen)的HAM-F12培养基(Invitrogen)中存在150pg/mlZeocin时培养细胞。在以对照"富CpG"TTGZeo构建体转染后出现了8个集落(图1中的A)，而在转染包含"贫CpG"TTGZeo的构建体后则没有出现集落(图1中的C)。相反，如果构建体中包含STAR7/67-7，则使用"富CpG"TTGZeo(图1中的B)选择标记和使用"贫CpG"TTGZeo(图1中的D)选择标记都会出现超过24个集落。使用"富CpG"TTGZeo选择标记(图1中的A)，禾U用STAR-少的对照构建体，d2EGFP的平均表达为140，而利用包含STAR的构建体，d2EGFP的平均表达为1332(图1中的B)。这是由于存在STAR元件的提高。使用包含STAR的构建体以及"贫CpG"TTGZeo，d2EGFP的平均表达为2453(图1中的D)，与使用"富CpG"TTGZeo(图1中的B)相比，几乎提高了两倍。此外，使用"富CpG"TTGZeo(B)达到的最高d2EGFP值是2481，使用"贫CpG"TTGZeo(D)达到的最高值是4308。我们得出结论降低Zeocin标记基因的CpG含量提高了选择系统的严格性。这达到了如果构建体中包含STAR元件则d2EGFP表达值较高，而使用对照构建体则没有集落。还将相同的构建体转染CHO-DG44细胞。这是使用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行的，并使用在培养基中的150pg/mlZeocin进行选择。该培养基由HAMF12:DMEM-1:1，加上10°/。胎牛血清构成。利用"富CpG"TTGZeocin选择标记，通过STAR-少的对照构建体，d2EGFP的平均表达为43(图2中的A)，通过包含STAR的构建体，d2EGFP的平均表达为586(图2中的B)。这是由于存在STAR元件的提高。利用STAR构建体和"贫CpG"Zeo，平均d2EGFP表达为1152(图2中的D)，与"富CpG"TTGZeo(图2中的D)相比，提高了几乎两倍。此外，使用"富CpG"TTGZeo构建体达到的最高d2EGFP值是1296(图2中的B)，使用"贫CpG"TTGZeo构建体则到达的最高值时2416(图2中的D)。与使用"贫CpG"TTGZeo构建体没有出现对照集落(图1中的C)的CHO-K1相反，使用CHO-DG44出现了对照集落，但平均d2EGFP值是52，集落中最高值是15(图2中的C)。我们得出结论，同样在CHO-DG44中，向构建体加入"贫CpG"TTGZeo选择标记达到了在采用STAR元件时的高蛋白质表达。实施例2:在本发明的选择系统中新霉素抗性编码序列的修饰在该实施例中，除了起始密码子外，还修饰了新霉素抗性基因的编码区，其通过尽可能多地除去新霉素抗性基因的CpG二核苷酸(ATG-少，因此已经排除了编码链中的ATG序列)，而没有改变新霉素抗性蛋白质的氨基酸序列(与野生型序列相比，除了Me^Leu突变夕卜，在该突变处内部ATG序列符合阅读框并且被替换为CTG:显然这是由于从编码链中除去ATG序列并且独立于降低CpG含量的努力，参见WO2006/04845的实施例17)，在编码链中没有引入新的ATG序列，这与在实施例1种对Zeocin抗性基因所进行的一样。野生型新霉素选择标记基因的CpG含量为10.4%(SEQ.ID.NO.5)，而改变后，CpG含量降低到2.3。/。(SEQ.ID.N0.9)。在该实施例中包含新霉素抗性基因的构建体是从GeneArtGmbH，Regensburg，德国订购的。作为起始密码子，在该实施例中使用TTG。因此，所使用的序列由SEQ.ID.NO.9构成，前提是起始密码子(开始三个核苷酸，ATG)被替换为TTG起始密码子，进一步在某些情况中包含下面所提到突变之一。在"贫CpG"新霉素抗性基因中，进行某些突变以改变新霉素抗性蛋白质中的氨基酸，以测试在本发明的多顺反子转录单位中使用时，是否这些突变对所感兴趣多肽的表达水平有影响。这些突变(Sautter等人，2005;注意与(Sautter等人，2005)所使用的序列相比，在本发明中所使用的neo序列编码在紧接着起始密码子后的三个额外氨基酸，因此本申请中的氨基酸编号比在(Sautter等人，2005)中的编号高三个数)由下列构成第201位氨基酸缬氨酸(Sautter等人，2005中的第198位)改变成第201位甘氨酸(TTGNeo201V>G)，第185位谷氨酸(Sautter等人，2005中的第182位)改变成第185位天冬氨酸(TTGNeo185E>D)，以及第201位缬氨酸和第185位谷氨酸分别改变成第201位甘氨酸和第185位天冬氨酸的双突变(TTGNeo185E>D/201V〉G)(图3)。将这些修饰与对照新霉素(贫CpG的TTGNeo185E/201V)进行比较。在所有情况中，制备具有或没有STAR元件的构建体(图3)。将修饰的TTGNeo选择标记并入到构建体中，所述构建体在CMV启动子的上游包含STAR7和67，接着是所述TTGNeo选择标记、d2EGFP基因和STAR7(图3)。将构建体转染到CHO-Kl细胞。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染DNA，在补加10%FBS(Invitrogen)的HAM-F12培养基(Invitrogen)中存在500ng/mlG418遗传霉素时培养细胞。使用对照Neo构建体(185E/201V)，仅观察到STAR元件非常有限的影响。这可能至少部分是由于在500pg/mlG418遗传霉素下所产生的许多集落，这说明TTG新霉素修饰的严格性低。然而，具有本发明修饰的新霉素是可以运行的在TTGNeol85E201V构建体中，从新霉素抗性基因的编码链中除去所有ATG，尽管d2EGFP值低，但明显ATG的除去仍能够在遗传霉素选择压力下进行正常的选择。在进一步修饰新霉素抗性基因时，观察到了加入STAR元件的显著影响。21个TTGNeo201V>G对照集落的平均值是65(图3中的A2)，而24个具有STAR元件的TTGNeo201V>G集落的平均d2EGFP信号是150(图3中的B2)。使用TTGNeo185E>D突变，进一步提高了选择严格性，因为没有STAR元件的话，没有对照集落存活(图3中的A3)，而17个存活的TTGNeo185E>DSTAR集落的平均d2EGFP信号是204(图3中的B3)。这意味着GFP荧光比TTGNeo201V>G集落的荧光高(图3中的B2)。与TTGNeo201V>G集落中最高值433相比，TTGNeo185E〉D201V〉G集落中d2EGFP的最高值是715，(比较图3中的B3禾HB2)。没有对照集落存活(图3中的A4)而7个存活的STARTTGNeo185E>D201V>G集落的平均d2EGFP值是513，最高d2EGFP值是923(图3中的B4)。结论是引入特定的突变提高了根据本发明在使用新霉素抗性基因时的选择严格性。这些修饰中的某些将该选择严格性转移到了新霉素抗性基因，其仅在并入STAR元件之后才能由于高表达值而存活。这伴随着达到了更高的d2EGFP表达值。显然，本文所描述的新霉素抗性基因的有利实施方式进一步提高了该基因用于根据本发明应用的适当性。明显的是在将新霉素抗性蛋白质置于IRES调控下时(参见，例如US2006/0141577的实施例19)，CpG含量降低并具有GTG或TTG起始密码子并具有指定突变(185E〉D和/或201V〉G)的新霉素抗性基因的构造也能够被置于所感兴趣的多肽(这里使用d2EGFP作为模型)编码序列的下游。对于Zeocin抗性基因也一样(实施例1)。在这种情况中，不需要关注CpG而据核苷酸的突变会引入ATG序列。在这些实施方式中，也期望能够得到良好的结果，即CpG含量的降低以及在可选择标记蛋白质编码序列中指定位点的突变会提高表达水平。参考文献JonesD，KroosN，AnemaR，VanMontfortB,VooysA，VanDerKraatsS，VanDerHelmE，SmitsS，SchoutenJ，BrouwerK,LagerwerfF，VanBerkelP，OpsteltenD-J，LogtenbergT，BoutA(2003)High-levelexpressionofrecombinantIgGinthehumancelllinePER.C6.万/o/ec/zwo/.19:163-168.KozakM.(1986)PointmutationsdefineasequenceflankingtheAUGinitiatorcodonthatmodulatestranslationbyeukaryoticribosomes.Ce〃44:283-292.KozakM.(1987)Ananalysisof5'-noncodingsequencesfrom699vertebratemessengerRNAs.TVwc/e/d^Was.15:8125-8148.KozakM.(1989)Contexteffectsandinefficientinitiationatnon-AUGcodonsineucaryoticcell-freetranslationsystems.M/Ce//伤o/.9:5073-5080.KozakM.(1990)Downstreamsecondarystructurefacilitatesrecognitionofinitiatorcodonsbyeukaryoticribosomes,尸racTV""/87:8301-8305.KozakM.(1997)RecognitionofAUGandalternativeinitiatorcodonsisaugmentedbyGinposition+4butisnotgenerallyaffectedbythenucleotidesinpositions+5and+6.￡細0J.16:2482-2492.KozakM.(2002)加大扫描机制的限制用于起始翻译(Pushingthelimitsofthescanningmechanismforinitiationoftranslation),Gewe299:1-34.Martinez-Salas，E.(1999)InternalribosomeentrysitebiologyanditsuseinexpressionvectorsCm/tO//"万/0/ec/7w0//0，458-64.Mizuguchi，H，Xu，Z，Ishii-Watabe，A，Uchida，E，andHayakawa，T.(2000)IRES-dependentsecondgeneexpressionissignificantlylowerthancap-dependentfirstgeneexpressioninabicistronicvectorMo/7Tzer/，376-82.Rees，S，Coote，J，Stables,J，Goodson，S，Harris,S，andLee，MG.(1996)Bicistronicvectorforthecreationofstablemammaliancelllinesthatpredisposesallantibiotic-resistantcellstoexpressrecombinantprotein所她c—i/es20，102-104，106，108-110.Sautter,K，Enenkel，B.2005.Selectionofhigh-producingCHOcellsusingNPTselectionmarkerwithreducedenzymeactivity.历ofec/z"o/89，530-538.Venkatesan，A，andDasgupta,A.(2001)Novelfluorescence-basedscreentoidentifysmallsyntheticinternalribosomeentrysiteelementsM/Ce//说o/2/，2826-37.Whitelaw，E，Sutherland,H，Kearns，M，Morgan,H，Weaving,L，andGarrick，D.(2001)EpigeneticeffectsontransgeneexpressionAfeAo^feAfo/5/o〃5S，351-68.权利要求1、一种DNA分子，其包含编码可选择标记多肽的开放阅读框序列，其特征在于所述DNA分子在所述可选择标记多肽的编码链中具有GTG起始密码子或TTG起始密码子，并且，与编码所述可选择标记蛋白质的原始开放阅读框序列相比，编码所述可选择标记蛋白质的开放阅读框序列已经被突变，以替换其至少一半的CpG二核苷酸。2、根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述起始密码子是TTG。3、根据权利要求1或2所述的DNA分子，其中所述可选择标记多肽提供针对Zeodn或针对新霉素的抗性。4、根据权利要求3所述的DNA分子，其包含编码提供针对Zeocin抗性的多肽的开放阅读框序列，其中所述DNA分子包含以下序列中的一种a)SEQ.ID.NO.1，前提是至少一半的CpG二核苷酸已经被替换，而没有突变其所编码的氨基酸序列，进一步的前提是所述起始密码子是GTG或TTG;禾口b)SEQ.ID.NO.1，其中第280位的核苷酸A被替换为T，前提是至少一半的CpG二核苷酸已经被替换，而没有突变其所编码的氨基酸序列，进一步的前提是所述起始密码子是GTG或TTG。5、根据权利要求4所述的DNA分子，其包含SEQ.ID.N0.3。6、根据权利要求3所述的DNA分子，其包含编码提供针对新霉素抗性的多肽的开放阅读框序列，其中所述DNA分子包含选自以下一组中的序列a)SEQ.ID.NO.5，前提是至少一半的CpG二核苷酸已经被替换，而没有突变其所编码的氨基酸序列，进一步的前提是所述起始密码子是GTG或TTG;和b)SEQ.ID.NO.7，前提是编码链至少一半的CpG二核苷酸已经被替换，而没有突变其所编码的氨基酸序列,进一步的前提是所述起始密码子是GTG或TTG;和c)SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.7，前提是与原始序列所编码的多肽相比，其包含突变以编码下列多肽变体中的任何一种(i)第201位的缬氨酸置换成甘氨酸(201V〉G)，或(ii)第185位的谷氨酸置换成天冬氨酸(185E〉D)，或(iii)突变(i)和(ii)的组合(185E〉D和201V>G)，进一步的前提是，编码链至少一半的CpG二核苷酸己经被替换，而除了(i)(iii)中所指定的突变外，没有进一步突变所编码的氨基酸序列，进一步的前提是所述起始密码子是GTG或TTG。7、根据权利要求6所述的DNA分子，其包含SEQ.ID.N0.9，前提是第555位的核苷酸A被替换为C，第602位的核苷酸T被替换为G，第603位的核苷酸G被替换为T，进一步的前提是所述始密码子是GTG或TTG。8、根据权利要求1~7中任一项所述的DNA分子，其中所述编码可选择标记多肽的开放阅读框序列是还包含编码感兴趣的多肽的开放阅读框序列的多顺反子转录单位的一部分。9、根据权利要求8所述的DNA分子，其中所述编码可选择标记多肽的开放阅读框在编码感兴趣的多肽的开放阅读框的上游，并且其中编码可选择标记多肽的开放阅读框在编码链中没有ATG序列。10、根据权利要求8所述的DNA分子，其中所述编码感兴趣的多肽的开放阅读框在编码可选择标记多肽的开放阅读框的上游，并且其中所述编码可选择标记多肽的开放阅读框可操作地连接于内部核糖体进入位点(IRES)。11、一种表达盒，其包含根据权利要求810中任一项所述的DNA分子，所述表达盒在所述多顺反子表达单位的上游包含启动子，在所述多顺反子表达单位的下游包含转录终止序列。12、根据要求ll所述的表达盒，其还包含至少一个染色质调控元件。13、一种宿主细胞，其包含权利要求110中任一项所述的DNA分子，或者权利要求11或12所述的表达盒。14、一种产生能够表达感兴趣的多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括下列步骤a)将权利要求810中任一项所述的DNA分子或权利要求11或12所述的表达盒引入到多个前体细胞中，b)在适合所述可选择标记多肽表达的条件下培养所述多个前体细胞，以及c)选择至少一个表达感兴趣的多肽的宿主细胞。15、一种表达感兴趣的多肽的方法，其包括培养包含权利要求11或12所述表达盒的宿主细胞，以及从所述表达盒表达所述感兴趣的多肽。16、根据权利要求16的方法，其还包括收获所述感兴趣的多肽。全文摘要本发明提供了一种DNA分子，其包含编码可选择标记多肽的开放阅读框序列，其中编码链中的所述DNA分子包含具有GTG起始密码子或TTG起始密码子的可选择标记多肽的翻译起始序列，其中，与编码所述可选择标记蛋白质的原始开放阅读框序列相比，编码所述可选择标记蛋白质的开放阅读框序列被替换其至少一半的CpG二核苷酸。文档编号C12N15/67GK101437946SQ200780015813公开日2009年5月20日申请日期2007年4月24日优先权日2006年5月2日发明者A·P·奥特,H·J·M·范布洛克兰,R·G·A·B·赛沃尔特,T·H·J·克瓦克斯申请人:科罗迈吉尼科斯公司