专利名称：：用于dna扩增反应的溶液预处理的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及溶液预处理。具体而言，本发明涉及蛋白质溶液的预处理。优选说来，蛋白质溶液用于脱氧核糖核酸(DNA)的扩增反应，所述预处理确保蛋白质溶液中存在的任何污染性DNA不能参加DNA扩增反应。
背景技术：
：核酸的扩增，特别是DNA的扩增，已成为DNA分析工作中广泛使用的工具。在只有微小量DNA存在的情况下尤其如此。目前，DNA扩增的最普遍使用方法是聚合酶链式反应(PCR)。PCR是使用热稳定性DNA聚合酶和两条大约20个碱基的引物来扩增DNA碱基序列的方法，其中一条引物互补于要扩增序列一端的(+)-链，而另一条引物互补于要扩增序列另一端的(-)-链。因为新合成的DNA链可以随后用作相同引物序列的额外模板，引物退火、链延伸和分离的连续循环，使得目标序列迅速且高特异性的扩增。如果相关引物可以被显影的话，PCR还可以用于检测所定义序列在DNA样品中的存在。DNA聚合酶和其他蛋白质PCR试剂被细菌性(或其他)DNA污染是PCR方法学的主要问题。以前，这个问题已经由几个作者提出(Bottger，1990;Rand禾卩Houck，1990;Schmitd等人，1991;Hughes等人，1994;Maiwald等人，1994;Hilali等人，1997)。PCR扩增微小量DNA的能力是它的一个最大优势。不过，这种能力也意味着任何痕量的污染性DNA也一起被扩增。这种污染性DNA的扩增可能产生令人误解的、不明确的或者不正确的结果(Wilson等人，19卯)。具体而言，以高度保守和进化性同源真菌性核糖体的16SrRNA基因为目标使用通用引物来进行系统发生、进化和诊断研究的观念，经常在PCR期间由产生假阳性而被折衷(Hilali等人，1997;Corless等人，2000;Mohammadi等人，2003)。真菌性DNA在环境中是普遍存在的，几乎在实验室人员处理的任何时期，也可能将污染性DNA引入到PCR混合物中(Kitchin等人，1990;Millar等人，2002)。DNA污染的其他源包括气溶胶(Saksena等人，1991)，可消耗的PCR试剂，塑料器皿(Millar等人，2002)或商售PCR引物(Goto等人，2005)。特别是己重复报道，可商售购得的DNA聚合酶是一种最可能的外源性细菌性DNA污染源(Rand和Houck，1990;Bottger，1990;Schmidt等人，1991;Hilali等人，1997;Newsome等人，2004)。Schmidt等人(1991)认为，用来生产DNA聚合酶和酶纯化设备(例如色谱柱)的微生物是将外源性DNA引入到DNA聚合酶的最可能的源。相反，两项其他研究发现没有证据证明r叫-聚合酶中的外源性细菌性DNA来源于生产性生物体，例如大肠杆菌C^c/zen'cWaco/0或水生栖热菌(J/zera7Ma，加'cM力(Rand和Houck，1990;Maiwald等人，1994)，污染性DNA被证明与荧光假单胞菌CP^w^附o"^y/womsce朋)、绿脓杆菌(i^ewt/o附o"oyaerwg7'mwa)、粪产碱杆菌(y4/caf/z'gene51j^ect^X^nl^felSI氮菌04zoto6a"erW"e/a"flK)最为相关(Maiwald等人，1994)。此外，Schmidt等人(1991)也已经检测到，污染性DNA来源于各批Tag-聚合酶制剂中的真核生物。可是这些研究不考虑源，而是致力于强调外源性DNA普遍存在于可商售购得的Tag-聚合酶制剂中。除去所述污染性DNA的策略包括，用紫外光(Ou等人，1991;Sarkar和Sommer,1991;Frothingham等人，1992;Sarkar和Sommer，1993;Goldenberger和Altwegg，1995)、DNaseI(Rochelle等人，1992;Hilali等人，1997)、^辐射(Deragon等人，1990)、限制性内切酶(DeFililppes，1991;Sharma等人，1992;Mohammadi等人，2003)或8-甲氧基补骨脂素与紫外辐射组合(Ji皿o等人，1990;Meier等人，1993;Hughes等人，1994;Fahle等人，1999)来处理PCR主要混合物(mastermix)制剂。不过，后一方法学不能在Schmidt等人(1991)和Corless等人(2000)的研究中分别成功再现。不过这些方法都具有显著缺点。例如，使用紫外辐射(256nrn)以除去外源性DNA是有问题的，因为Taq聚合酶已被证明对于该处理是极端敏感的(Ou等人，1991)，扩增效率降低了105倍以上(Sarkar和Sommer，1990)。类似地，很多引物(取决于它们的序列)对于紫外辐射也是敏感的，然而脱氧核苷酸三磷酸盐却基本上不受紫外处理的影响，但是可以降低净化效率(Frothingham等人，1992)。迄今为止，用来降低不希望DNA的最有效方式是用DNaseI和/或限制性内切酶对PCR试剂进行预处理(Sharma等人，1992;HiMi等人，1997;Carroll等人，1999;Heininger等人，2003;Mohammadi等人，2003)。不过，在模板DNA可以被加入到反应中之前，使用DNaseI需要彻底的热变性步骤，以除去任何残留的酶活性。HiMi等人(1997)报道，高温和延长温育周期(95'C下50分钟，或10(TC下20分钟)对于DNaseI的有效灭活是必不可少的。所述处理无法与大多数Tag-聚合酶的热稳定性相适合。如果不完全灭活的话，那么残留的DNaseI就会损害模板DNA。为了避免PCR效率降低，已推荐使用高度热稳定性DeepventExo-⑧聚合酶。使用限制性内切酶可能还是有问题，因为酶本身可能是外源性真菌性DNA源(Jinno等人，1990)。在扩增之后捕获DNA方面已经有一些成果，如NZ514707中所论述。不过，该组合物和方法需要使用结合增强剂和标签，所述标签随后被用来分析和检测扩增子(amplicon)。因此，如果蛋白质溶液快速且容易的预处理方法是可利用的，所述方法能净化、或者防止任何污染性DNA参加任何进一步PCR反应或其他DNA扩增方法，那么该方法就是有益的。所有参考文献，包括在本说明书中引用的任何专利或专利申请，都以此被参考引入本文中。并不认可任何参考文献构成现有技术。所述参考文献的论述声明了它们作者的断言，而本申请人保留挑战所引用文献精确性和相关性的权利。可以清楚地理解，尽管本文中提及大量现有技术出版物，但所述参考文献并不构成任何所述文献成为本领域一部分公知常识的认可，无论是在新西兰或任何其他国家。公认的是，术语"包括"在不同权限下可以表示除外的或包含有的意思。对于本说明书的目的而言，除非另作说明，术语"包括"将是包含有的意思，也就是说，其将表示不仅包含直接提及的所列出成分、而且还包括其他没有明确说明的成分或要素的意思。当在涉及方法或处理的一个或多个步骤中使用术语"包括的"或"包括"时，同样使用该解释。本发明目的在于处理上述问题，或者至少在于为公众提供有用的选择。本发明的其它方面和优点将由于通过单独举例方式进行的继续描述而变得清楚。发明详述根据本发明的一个方面，提供一种制备用于DNA扩增反应的溶液的方法，包括以下步骤a)将结合剂与碱溶液混合，b)对来自a)的混合物进行刺激以便活化所述结合剂，导致所述结合剂结合到碱溶液中的任何DNA上，从而使得DNA是不起反应性的，并且在DNA扩增反应期间不被一起扩增。根据本发明的第二个方面，提供一种用于DNA扩增反应的溶液，其中所述溶液基本上是经如上所述方法制备的。根据本发明的另一个方面，提供一种DNA扩增的方法，包括以下歩骤a)基本上使用如上所述方法来制备溶液，和b)在DNA扩增反应中使用来自a)的溶液。根据本发明的另一个方面，提供一种制备用于DNA扩增反应的溶液的方法，包括以下步骤a)确定碱溶液中污染性外源性DNA的量，b)确定要结合所有污染性DNA需要的结合剂浓度，c)将所需浓度的结合剂与碱溶液混合，d)对来自(c)的混合物进行刺激以便活化所述结合剂，和e)—旦活化，所述结合剂会结合到碱溶液中的任何DNA上，从而使得所述DNA是不起反应性的，并且在DNA扩增反应期间不被一起扩增。在优选实施方式中，所述碱溶液可以是蛋白质溶液，本文中将这样称呼。不过，本领域技术人员会容易地认识到，结合污染性DNA的相同程序，可以在任何其他用于PCR或其他扩增反应、而对于核酸为游离所必需的溶液中被使用，所述溶液例如氯化镁溶液。设想，几乎所有使用酶来扩增DNA的方法都可能含有污染性DNA，而所述方法应该能除去污染性DNA而不影响酶活性。例如，连接酶链反应，基于核酸序列扩增，链置换扩增和转录介导扩增。本说明书全文中，术语"碱溶液"应该理解为任何蛋白质或其他溶液的意思，其已被制备或者可商售购得，以供DNA扩增反应用，但其可能仍包括污染性DNA。在一个优选实施方式中，所述蛋白质溶液可以是用来在PCR反应中延长核酸链的DNA聚合酶溶液。不过，这不应被视为对本发明的限制，因为对于DNA扩增或检测，本发明也可以使用其他蛋白质溶液，例如限制性内切酶。在一个特别优选的实施方式中，所述蛋白质溶液可以是Taq聚合酶溶液，Taq聚合酶是从水生栖热菌分离的热稳定性DNA聚合酶。在一个替换的实施方式中，所述碱溶液可以是PCR主要混合物，其含有除了要扩增的模板DNA之外，进行PCR反应所需要的全部成分。在一个实施方式中，所述碱溶液可以是RNA制剂。RNA分析经常包括以下步骤从细胞提取RNA，使用逆转录酶进行RNA(例如mRNA、rRNA)分子的DNA复制(cDNA)，然后通过PCR或其他扩增技术来扩增cDNA。对于精确的结果，重要的是RNA提取物不能被细胞DNA污染。因此，在一个实施方式中，所述碱溶液可以是早于cDNA产生的RNA提取物。从任何源获得的蛋白质溶液都可能含有污染性DNA。例如，本发明人已经研究三种最常使用的可商售购得的T叫聚合酶制剂。所有这三者都含有大致相同水平的污染性DNA。必须筛选可商售购得的Taq聚合酶制剂到低于"可接受"水平的DNA污染，不过，这并不意味着它们没有被污染。研究者们一般接受，由扩增引起的假阳性，在没有加入模板DNA时将在延长的PCR运转中发生，即，高于36个循环。因此，很多研究者将限制PCR运转周期，以达到低于36-40个循环数的阳性结果。为了达到该结果，必须确保加入足够的模板DNA以覆盖少量污染性DNA的作用。当使用一般引物或通用引物时，最可能发生污染性DNA的一起扩增。通用引物例如是将要结合到来自任何真菌物种DNA上的那些引物。本申请人发现，在用PCR进行16SrRNA基因研究期间，遇到在没有加入模板DNA的阴性对照样品中产生假阳性的严重问题。使用新批次的PCR缓冲液、氯化镁、脱氧核苷酸三磷酸盐、引物、微孔水制剂、塑料器皿和抗气溶胶性过滤吸头进行广泛试验后，结论则是污染源为AmpliTaq⑧DNA聚合酶本身。因为污染性DNA是唯一值得注意的，或者是污染性DNA扩增到可检测水平时的问题，本发明目标在于作为在DNA扩增反应中使用的溶液而用。在本说明书全文中，扩增反应将被称为PCR，因为这是最常使用的扩增技术，不过，这并不应被视为是限制，因为本领域技术人员能认识到，本发明可以作为对于任何扩增技术的溶液预处理而利用。在本说明书全文中，应该采用PCR的一般意思，也就是使用热稳定性聚合酶和两条大约20个碱基的引物，一条引物互补于要扩增序列一端的(+)-链，而另一条则互补于另一端的(-)-链。引物退火、链延伸和分离的重复循环使得目标序列迅速且高特异性的扩增。本发明提供一种快速且容易的结合污染性DNA并防止其一起扩增的方法。所述防止任何污染性DNA参加DNA扩增反应的方法，能由商品供应者进行，从而能提供保证不含有DNA的聚合酶或主要混合物，或者因为需要且需要时，所述方法也能由各个研究机构或研究人员进行。在本说明书全文中，术语DNA应该理解为它的一般意思，包括由嘌呤碱或嘧啶碱核苷酸组成的任何化合物，每个核苷酸都包括脱氧核糖糖基和磷酸基。为了防止蛋白质溶液进一步污染，优选结合剂将会防止污染性DNA参加扩增反应，而需要最小可能数次的打开、加入或从反应管除去。在优选实施方式中，所述结合剂可以是一种具有两种不同形式的结合剂，一种形式为惰性形式，其中结合剂不会起反应或结合到DNA上，而另一种形式为活性形式，其中结合剂会结合到DNA上。对于结合剂而言，必须能够容易且快速地在惰性和活性形式(反之亦然)之间转换。这意味着，可以向溶液中加入足够数量的结合剂以结合污染性DNA，结合剂处于活化状态时将只与污染性DNA结合。这意味着，一旦有些结合剂已经与所有污染性DNA结合，那么剩余试剂就能回复成惰性形式，并不会结合到任何其它DNA上。这防止结合剂/污染性DNA组合干扰任何进一步反应，或者DNA扩增期间一旦已经加入靶DNA的话。重要的是，结合剂的活化作用和去活作用容易进行并且可控制。这确保，只是在加入模板(靶)DNA和引发DNA扩增反应之前，试剂结合到任何污染性DNA上才会发生。在优选实施方式中，在存在刺激的情况下，所述结合剂将只为活性形式。这是很重要的，因为这意味着，一旦将结合剂从活化刺激中除去，它将不能结合到DNA上，特别是不能结合到之后被加入到所述蛋白质溶液、或蛋白质溶液和其他为扩增所需成分中的模板DNA上。另一个重要特征在于，能够控制什么时候活化结合剂，这意味着，在DNA扩增之前，不必从蛋白质溶液中除去结合剂和被结合的DNA。这是有利的，因为降低了由打开容器/反应管导致的进一歩污染的可能性。所述结合剂不会分解或破坏污染性DNA，这也是有利的，因为这样的片段或部分本身可能会干扰扩增反应。另一个优点在于，没有任何其他溶液成分(例如酶)被结合剂影响的可能性。在优选实施方式中，所述结合剂可以被外部刺激活化，所述外部刺激例如紫外光或普通光。不过，这不应被视为限制，因为刺激将取决于选择的结合剂、和可以导致结合剂从惰性形式向活性形式(或反之亦然)转移的刺激。在一个优选实施方式中，所述结合剂是嵌入剂。在本说明书全文中，术语"嵌入剂"应理解为包括任何能嵌入于DNA中的试剂，就是要可逆地包括于两个相邻碱基对之间。一些充分研究的DNA嵌入剂包括乙锭、原黄素和镇静剂。在一个特别优选的实施方式中，所述结合剂可以是乙锭单叠氮化物(EMA)。在这种情况下，所述方法以污染性DNA与嵌入剂EMA的复合作用为基础。EMA是溴化乙锭的光反应性类似物，其在暗处以与其亲代化合物相类似方式与DNA相互作用(Bolton和Kearns，1978;Garland等人，1980)。在优选实施方式中，所加入结合剂的量可以刚好足够结合污染性DNA。在EMA为结合剂的情况下，EMA优选可以以1和5吗m1—1之间的浓度使用。在特别优选的实施方式中，可以使用约为3吗ml—1的EMA浓度。3吗ml"的EMA浓度可足以从主要混合物制剂(mastermixpreparation)中完全除去污染性DNA，而不影响如10fg那样低浓度的模板DNA的扩增。最佳的是，加入的EMA是刚好足够结合所有外源性DNA的最小滴度，同时使在与羟胺形成有关的溶液中的游离氮宾形成最小化。在大于5呢ml"的EMA浓度下，对于含有低于100pg模板DNA的那些反应而言，PCR的抑制是明显的。可商售购得的PCR试剂中污染性DNA的量会变化。因此，每一批DNA聚合酶或PCR主要混合物都会需要进行EMA滴度的最佳化，以确保最大限度地除去污染性DNA，而同时保持PCR灵敏度。EMA是溴化乙锭的类似物，其中8-位上的氨基已经被叠氮基所取代。EMA在暗处以与其亲代化合物相同的方式嵌入到双链DNA中，但是在用可见光进行光活化作用后，EMA可以另外共价结合DNA(Bolton和Kearns，1978;Garland等人，1980)。因此，已经与叠氮化物起化学反应的DNA不能通过PCR进行扩增。因此，加入例如EMA的结合剂，可以通过向含有除模板DNA外所有扩增成分的主要混合物中加入该成分，用来结合外源性DNA，并防止其在Taq聚合酶和PCR试剂中被一起扩增。在光解作用中，EMA8-位上的叠氮基使用基本上大于400nm的长波光来进行光化学活化(Bolton和Keams，1978)，从而在结合点经氮宾基与核酸共价交联(Hardwick等人，1984;Cantrdl等人，1978)。溶液中残留的未结合氮宾转化成为羟胺(Graves等人，1981)，其与溶液的醛和/或酮成分起反应-优先与胞嘧啶起反应-形成肟(Freese等人，1961)。共价交联的DNA不能参加PCR扩增，因此其干扰被消除(Nogva等人，2003)。在本说明书全文中，关于污染性DNA的术语"不起反应性的"应理解为不能通过DNA扩增技术来扩增的意思。这意味着，尽管结合的污染性DNA残存于溶液中，DNA水平却保持在其最初的低水平上，而该水平通过在DNA扩增后使用的通常检测方法是不可检测出的。在本说明书全文中，术语"主要混合物"应理解为PCR反应所需的一些或所有成分混合物的意思，但不包括要扩增的模板DNA。例如，PCR主要混合物可以含有lXTaq主要混合物lOmMTris-HCL50mMKCL1.5mMMgCL20,2mMdNTPs0.5mMDTT5%甘油0.8%NP-400.05mM吐温-2025U/mlTaqDNA聚合酶用于PCR/扩增反应的成分，可以根据研究者和目的而十分明显的改变。一些添加剂是任选的，例如DTT、甘油、吐温，总是存在其他物质，但是所用浓度可以改变，例如引物和MgCL2。主要混合物的组成没有像大多数污染性DNA都是由Taq聚合酶引入的那么重要，该混合物几乎总是以0.5-2.0单位/反应之间使用(认为1单位/反应是良好的平均值)。在本说明书全文中，术语"模板DNA"应理解为在PCR反应期间进行扩增的靶DNA的思思o在本发明中，我们介绍一种新颖且快速的方法学，该方法在小于IO分钟内从PCR主要混合物中除去任何外源性双链DNA。本发明的优点包括以下它提供一种快速且容易的方法，用来防止蛋白质或其他溶液中的污染性DNA在DNA扩增反应(例如PCR)中被一起扩增，在扩增前捕获DNA意味着，扩增需要最小限度的模板DNA，和进行超过36个循环的PCR循环就有把握不会产生假阳性，它利用可容易利用的场外化合物，由此降低成本和制备时间，它会使得在酶或其他蛋白质或化学成分存在下结合DNA，而对其没有不利影响，结合剂不会导致污染性DNA分解，进而防止其片段干扰DNA扩增反应，带有被结合的污染性DNA的结合剂不必从溶液中除去，因此通过限制容器/反应管需要打开的次数来防止进一歩可能的污染。通过使用例如紫外光的刺激控制结合剂呈活性的时间，防止结合剂或结合DNA的结合剂干扰任何后续扩增反应。结合剂不需要制备，除了在进行本方法前调整到正确浓度，结合剂或者结合污染性DNA的结合剂不抑制Tag聚合酶，只需要将低水平结合剂加入到碱溶液或反应混合物中。附图简述本发明的其它方面将由于以下说明而变得清楚，所述说明通过单独举例和参考附图进行，其中图1是在0.1吗m1—1EMA存在下使用低模板DNA浓度的PCR扩增产物，和产物浓度的象素密度图谱，图2是对于l昭m1—1的象素密度图谱；图3是对于3pgmr1的象素密度图谱；图4是对于5吗m厂1的象素密度图谱；图5是对于10吗ml—1的象素密度图谱；图6是使用IO吗ml—1EMA和200pg牛DNA的象素密度图谱；图7是对于3吗ml—1EMA在JumpStartTaqDNA聚合酶上的象素密度图谱，禾口图8是对于3pgml—1EMA在PlatinumTaqDNA聚合酶上的象素密度图谱。本发明的最佳实施方式呈现的结果证明，EMA能在10分钟内从PCR主要混合物中完全且迅速地消除任何可扩增的外源性DNA。净化PCR主要混合物制剂所需的EMA量，取决于存在的污染性DNA的量。如图1和2中所示，0.1的叠氮化物滴度和l吗m厂1EMA不能从PCR制剂完全除去所有污染性DNA，尽管使用l吗ml—1能除去数量上更多的外源性DNA(图1和2的象素密度图谱，泳道9)。需要EMA的浓度为3呢m1—1，以从所述主要混合物制剂完全除去污染性DNA。该浓度不会影响如10fg低浓度的模板DNA的扩增(图3，泳道8)。需要相同浓度的EMA(3吗m厂1)来完全除去两种其他测试的Taq-聚合酶中的污染性DNA:JumpStartTaq-聚合酶和PlatinumTaq-聚合酶(图7和8，泳道9)。此外，10fgDNA的模板DNA浓度仍会被再次扩增，而没有任何副作用(图7和8，泳道8)。EMA浓度大于5吗m1—1时，对于那些含有小于100pg17模板DNA的反应而言，PCR的抑制是明显的(图4和5，泳道5至8)。令人感到有趣的是，将200pg^tl—1消化的牛DNA加入到同样制备的回复PCR性能的主要混合物中，表明对于模板浓度低于100pg的扩增失败不是由于Tag-聚合酶的抑制，而是由于由未结合的EMA除去模板。相反，消化的牛DNA的20pg^等分样品不足以除去PCR抑制(未显示数据)。在琼脂糖凝胶电泳之后，用NationalInstituteofHealth,USA，提供的可自由下载软件ImageJ进行PCR产物评价。该软件用来计算琼脂糖凝胶图像中所选区域的象素值统计数据，从所述统计数据制定线密度图谱。相对大量扩增子的所述计算机控制测量比直接目测具有优点，特别是对于阴性对照而言。该方法使i于溴化乙锭着色过程和凝胶到凝胶改变中的误解或矛盾导致的不明确结果最小化。因此，本发明人考虑，使用ImageJ或类似计算机程序来监控适当的净化程度。可商售购得的PCR试剂中污染性DNA的量会变化，每批DNA聚合酶或PCR主要混合物都会需要使EMA滴度最佳化，以确保最大限度地除去污染性DNA，同时保持PCR灵敏度。最佳情况是，EMA能被加入到最小滴度-刚好足够结合所有外源性DNA，同时使在与羟胺形成有关的溶液中游离氮宾的形成最小化。已经证明，羟胺是诱变性的，能在高于250至500mM的浓度范围之上结合并化学修饰DNA，诱变时间大于30分钟(Aslanzadeh，1992;Freese等人，1961)。此外，羟胺在Cu(II)存在下、但是没有Mn(III)、Mn(11)、Fe(III)或Fe(II)存在下，诱导DNA损伤(Yamamoto等人，1993)。幸运的是，本发明人能证明，最佳的叠氮化物滴度为7.14pM(3吗ml—1)，其对扩增的模板DNA没有不利作用，如通过自枯草芽孢杆菌(及w6"fc)BS的D-丙氨酸消旋酶基因的序列测定所示。Bolton和Keams(1978)报道，对于低比例的EMA/核酸而言，EMA到DNA的交联产率为常数值75。/。。因此，PCR主要混合物中未结合的和反应性的羟胺的量，在3吗ml—1的最佳EMA滴度下，有效地为1.78pM。即使当EMA以超过除去外源性DNA所需的量加入时，对于11.9pM(5]agml—1)的浓度而言，在扩增的DNA序列中也没有改变，尽管在此浓度下反应性羟胺的部分为6.54^M。因此，本方法学会对无性系化和测序反应没有副作用，所述反应可能在扩增子上进行。理论上说来，模板DNA浓度大于100pg时，EMA最佳化歩骤可能是多余的，B卩，其中由于未结合的EMA而致的模板DNA少量损失可以被证实。在这些情形下，可以推荐EMA的浓度为4到5吗m1—1。总之，本方法能在PCR期间41个扩增循环后(即，没有加入的模板DNA)，完全排除与可商售购得的DNA聚合酶和/或PCR试剂有关的任何污染性DNA被一起扩增。重要的是，浓度为3照ml—iEMA，在消除污染性DNA和不干扰非常低模板浓度下的PCR扩增两方面是有效的。这证实PCR主要混合物制剂含有三种不同的Taq聚合酶。所提出的所述净化方案要迅速简单使用，在PCR扩增中IO分钟内完成。因此，本方法学非常适合作为常规的分子诊断工具，来分析其中不希望背景被扩增的具有极低模板浓度的稀薄/灵敏PCR样品，g卩，临床和法医样品的分析。而且，所述方法能与实时定量的PCR应用组合，尽管其必须产生于这样的精神下，EMA是对于结合的、未结合的和光解状态具有不同激发和发射波长的荧光染料(Bolton和Kearns，1978;Garland等人，1980;Graves等人，1981)。因此，其综合成定量PCR化验肯定会与淬火和/或报道染料一致。此外，可能本方法会对分子生物学中使用的、其中DNA污染可能是问题的任何其他酶同样有效，例如限制性内切酶和蛋白酶。实施例1.材料和方法l丄菌株和培养物制备Anoxybacillusflav他ermus菌株C和枯草芽孢杆菌属(5ad〃wra^7fo)菌株BS被Ronimus等人从新西兰奶粉中分离出来(2003)。培养物在55。C下胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中培养，所述肉汤补充有0.2%(w/v)可溶性马铃薯淀粉(Sigma;S2004)。1.2.模板DNA制备通过修改由Sambrook和Russel所述程序(2001)，从A.flavithermus和枯草芽孢杆菌提取DNA。生长之后，收集10ml细胞悬液，并重新悬浮于1ml的50mMTrisHCL(pH8.0)、100mMNaCL和20mMEDTA中。总共加入2mgml—1溶菌酶和50吗ml—1RNase，将样品在37'C下温育45分钟。将SDS和蛋白酶K分别加至1。/。(w/v)和200吗m厂1。然后将样品在55"下温育1小时。随后，将样品用等体积的苯酚氯仿(1:1)提取，接着用氯仿和氯仿异戊醇(24:1)提取。然后通过加入1/10体积的3M乙酸钠和0.6体积的异丙醇、并在-2(TC下温育15分钟，使DNA沉淀。将DNA沉淀(pellet)用冰冷却的80%乙醇洗涤两次，空气干燥，并将DNA沉淀重新悬浮于500pl的lxTE(10mMTris-HCL，1mMEDTA，pH8.0)中。从Sigma(D4764)购买小牛胸腺脱氧核糖核酸的冻干粉末，并重新悬浮于1XTE中。将牛DNA的25吗等分样品，在100pl的含有1Kunitz单位DNaseI(Sigma,DN25)和10pi10XDNase缓冲液(10mmolI—1EDTA，75mmolI—1MgCL2禾B200mmolI—1Tris-HCL，pH7.5)的全部样品体积中，在37'C下部分消化10分钟。随后，加入20mmol厂1EDTA，将密封样品在沸水浴中温育10分钟，通过琼脂糖凝胶电泳来确认未完成的消化程度。部分消化的牛DNA样品用于从PCR主要混合物中结合并除去未结合的叠氮化物。所有DNA样品都用NanoDrop(NanoDropTechnologies,Wilmington,DE19810，USA)来量化，并在-20°。下存储。而且，在所有DNA处理中，除去实验室污染的措施包括，引入抗气溶胶性过滤吸头用于在无菌层流操作台下移液和处理所有溶液与试剂。在使用前，所有水溶液都在清洁的1.5ml微量离心管中进行45分钟的紫外辐射(256nm)。1.3.聚核苷酸引物来自Rueckert等人(2005)研究的正向引物(5'-AGGAACACCAGTGGCGAAG-3')和反向引物(5'-GGATGTCAAGACCTGGTAAGG-3')，用于扩增在711-998位(根据Brosius等人的编号(1980))的小区域核糖体16SrRNA基因。依据样品中存在的模板DNA，希望PCR扩增子的大小为大约300bp。来自枯草芽孢杆菌BS的D-丙氨酸消旋酶基因被扩增，并使用来自枯草芽孢杆菌属菌株168(NCBI登录号M16207)D-丙氨酸消旋酶基因的衍生引物，来进行测序。正向引物和反向引物分别为5'-AGCACAAAACCTTTTTACAGAGATAC-3'禾卩5'-TTAATTGCTTATATTTACCTGCAATAAAG-3'。1.4.聚合酶链反应在该研究中，使用以下三种DNATag-聚合酶，viz.AmpliTaq聚合酶(Roche，Cat.No.11647687001)，JumpStartTMTaqDNA聚合酶(Sigma，D9307)和PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen，Cat.No.10966-026)。向该反应提供由每个生产商供应的相关镁和PCR缓冲液。所有PCR反应都用EppendorfMastercycler(Gradient)在包括25^终体积的0.5ml微量离心管中进行。该扩增方案使用Rueckert等人(2005)所述方案的修改方案，具有以下循环条件在94'C下150秒，然后在94"C下15秒(共循环41次)，在62"C下10秒，和在68匸下15秒。所述扩增反应含有4mMMgCL2或MgS04、0.2mMdNTPs、lxTaqPCR反应缓冲液、1.25单位的适当Taq聚合酶、100nM正向引物和反向引物、禾P0.1禾H10ml—1范围内的EMA。所述扩增反应含有10ng到10fg十进制稀释范围内的、来自A.flavithermus的DNA。一些PCR反应还含有200和20pgpi—1之间的小牛胸腺DNA(用DNaseI处理后的)。对于每个扩增反应都包括两个阴性对照样品，其中两个阴性对照样品都不含有加入的模板DNA，其中一个阴性对照样品另外不含有EMA。在存在0、3和5吗ml—iEMA的条件下，来自枯草芽孢杆菌属菌株BS的D-丙氨酸消旋酶被扩增。含有EMA的扩增反应和测序反应以一式两份进行。PCR反应含有4mMMgCL2、0.2mMdNTPs、lxAmpliTaqPCR反应缓冲液、1.25单位AmpliTaq聚合酶、600nM正向和反向引物、禾Plng枯草芽孢杆菌属菌株BS的基因组DNA。所述PCR反应在94匸下进行150秒，然后在94'C下进行20秒(循环41次)，在47'C进行20秒和在72°C下进行90秒。最后的在72'C下10分钟的延伸步骤完成扩增。1.5.D-丙氨酸消旋酶测序继PCR之后，将扩增反应电泳通过1.5%(w/v)琼脂糖凝胶(SeaKem，LEAgarose)(部分2.8)。然后在紫外透照仪上简要观察凝胶，同时将D-丙氨酸消旋酶扩增产物用无菌刀片切除。切除的带状物用蜡膜片包裹，并在-20'C下冷冻。随后，对包裹的凝胶施加稳定的不变压力，将渗出液收集到1.5ml微量离心管中。这些DNA样品用苯酚:氯仿、氯仿和氯仿:异戊醇提取，然后进一步用乙酸钠/异丙醇来沉淀，并进行量化，如本文所述。在正向和反向起始方向上，在MegaBACE毛细管DNA分析系统上通过WaikatoDNA测序设备，对每个样品都进行DNA测序。1.6.PCR主要混合物的乙锭单叠氮化物处理从Biotium，Inc.(USA)购买5毫克固体溴化乙锭单叠氮化物(EMA)，根据生产商的建议，在暗处将其溶解于N,N-二甲基甲酰胺中。在-20'C下，将10mgml—iEMA储液的50pl等分样品存储于不透光的微管中。在光解作用和加入A.flavithe匪s的模板DNA之前，以0.1、1、3、5禾H10吗ml—1(用干苗微717k琉鬆、的汰齒炮PMA"fin入至llPPR:t蓝、)巨仝物法ll别由.人人而&会紀迅杜TTMA至关重要的是，在暗室中在无光条件下将EMA加入到清洁的1.5ml微量离心微管中，然后将样品在冰上温育5分钟。然后将样品在500W卤素光源(锇钨灯丝合金，T3Q光亮卤素)下曝光3分钟，光源距样品管20cm远，同时保持样品在冰上。随后，在简单的离心步骤之前，将所述主要混合物被分装到PCR微量离心管中，向每个样品中加入连续稀释的模板DNA，收集管底部的所有反应混合物。然后将管放置到Mastercycler中，开始扩增反应。为了确定残留EMA对AmpliTaq聚合酶活性是否有副作用，组配含有3吗ml—1EMA但不加入Taq聚合酶的主要混合物。所述主要混合物进一步进行所述温育和光解。随后，将所述主要混合物等分到PCR管中，以从1.25到0.0097U变化的两倍连续稀释度加入AmpliTaq聚合酶。加入100pgA.flav池ermus模板DNA后，在每个稀释度下进行PCR反应。类似制备对照主要混合物，但是不加入EMA。1.7.大于5吗ml^的EMA浓度对PCR效率的作用浓度大于5昭ml—1的EMA对PCR效率的作用，用含有10吗m厂1染料的AmpliTaq聚合酶主要混合物进行研究。继2.6部分中概述的方案之后，将所述PCR主要混合物在暗处温育5分钟，并照亮3分钟。在曝光后，向所述主要混合物中加入200或20pg^i户部分DNasel消化的牛DNA，将样品于暗处在冰上再温育5分钟，以使限制性牛DNA能与任何未结合的EMA起反应。然后分配所述主要混合物，将十进制连续稀释的模板DNA的等分样品加入到PCR管中，如2.4下所述引发扩增反应。1.8.琼脂糖凝胶电泳、成像和评价继PCR之后，将扩增产物使用HORIZON11.14电泳箱(LifeTechnologies,GIBCOBRL)在55伏下(PowerPackModel250;LifeTechnologies,GIBCOBRL)电泳通过1.5%(w/v)琼脂糖凝胶(SeaKem，LEAgarose)。凝胶用溴化乙锭(20吗ml—1)染色15分钟，用蒸馏水脱色20分钟。然后使凝胶显现，用AlphalmagerTM(AlphaI皿otech，SanLeandro，CA，USA)捕获图像。在计算机图像上，用可在http:〃rsb.info.nih.gov/ij/在线得到的来自WayneRasband(NationalInstituteofHealth,USA)的ImageJ1.32J软件包，进行数字化的琼脂糖凝胶评价。所述软件用来确定扩增产物的相对量，作为它们象素密度的测量值(灰度值)。打开图像进入ImageJ之后，背景扣除和图像亮度及对比调整两者都用ImageJ的默认设定值进行。凝胶条带使用"绘谱(plotprofile)"选项进行分析。复制数据绘图值坐标，粘贴到MicrosoftExcel2004中，并用线图选项(linechart)标绘数据。2.结果2丄用来消除PCR主要混合物中外源性DNA污染的最佳EMA浓度的确定。用来从含有AmpliTaq聚合酶的PCR主要混合物中除去外源性DNA的最佳量EMA，在0.1、1、3、5和IO吗ml—1的浓度范围上确定。覆盖从10ng到10fgA.flav他ermusDNA的模板DNA浓度，用来评价主要混合物对EMA结合的灵敏度。从这些试验所得结果显示于图1到5中。图1到5的各阴性对照，其不含有模板DNA且不加入EMA(图1到5中的泳道10)，都产生一个到两个大约300bp的扩增子。由此表明，PCR主要混合物中有可扩增的外源性DNA存在。这与含有EMA但不含有模板DNA的阴性对照(图1到5各图中的泳道9)形成对比，其中PCR扩增子的产生取决于所用EMA的量。低于l吗ml—1的EMA浓度(图1禾a2中的泳道9)不能完全除去PCR主要混合物中存在的所有外源性DNA，两个反应都产生适当的扩增子。产生的PCR产物的量-相对于象素密度图谱中灰度值测得-在两个样品间显著变化，用lMgm厂1EMA处理的阴性对照样品(图2，泳道9)比用0.1ugml—iEMA处理的阴性对照样品(图l，泳道9)明显产生更少数量的PCR产物。3吗m厂1和以上的EMA浓度成功地从主要混合物除去所有外源性DNA，对于这些样品没有观察到PCR扩增子(图3到5，泳道9)。5吗m厂1和以上的EMA浓度导致DNA模版浓度在10pg和以下时PCR失败(图4和5,泳道5到8)。因此，用来消除所述主要混合物中外源性DNA的EMA最佳量为3吗m1—1(图3)，而同时在模版DNA浓度低至10fg时显示出不会干扰模板DNA的扩增。2.2.大于5吗m1—1的EMA浓度对PCR效率的作用对于含有10pg到10fg模板DNA并用5和10吗ml—iEMA处理的PCR反应的失败(图4和5，泳道5到8)，有两种可能的解释。首先，这些高浓度EMA使AmpliTaq聚合酶部分灭活，其次，高反应性但未结合的氮宾由于超过EMA而存在于主要混合物中，随后加入模板DNA时氮宾会结合模板DNA。在加入模板DNA之前，但在EMA光解之后，通过向PCR主要混合物中加入20或200pgpi—1DNaseI消化的牛DNA来检验后一解释。所述加入的DNA没有被所用引物对扩增，即，其没有与模板DNA竞争。在较低模板DNA浓度下，向PCR主要混合物中加入20pgpi—1牛DNA，没有恢复PCR性能(没有显示数据)。相反，对于含有10pg到10fg模板DNA的样品而言，向所述主要混合物中加入200pg^d^牛DNA，则成功地恢复了扩增反应(图6)。这些结果表明，AmpliTaq聚合酶活性并不受存在相对高浓度的EMA的影响，扩增失败可能是由于模板被未反应的氮宾结合所致。2.3.残留EMA对AmpliTaq聚合酶和模板DNA活性的作用为了进一步降低残留的未反应叠氮化物对AmpliTaq聚合酶和模板DNA活性的作用，进行另外两个试验。在第一个试验中，使用分别含有0、3和5吗ml—1EMA的PCR主要混合物制剂，从1ng模板DNA扩增出来自枯草芽孢杆菌属BS的D-丙氨酸消旋酶。随后测定PCR产物序列，将它们的序列与己知的枯草芽孢杆菌168的D-丙氨酸消旋酶(1170bp)通过ClustalW比对法进行比较(如表1中所示)。结果显示，在3和5pgm厂1浓度下的EMA，或者光解作用中的任何其它次要产物，对扩增和测序都没有副作用。表l.确定枯草芽孢杆菌BS的D-丙氨酸消旋酶的序列(GenBank登录号DQ291153)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(a)在光解和扩增之前向PCR主要混合物中加入EMA。(b)对枯草芽孢杆菌168的全长度D-丙氨酸消旋酶(1170bp)的绝对得分。在第二个试验中，将两倍稀释度系列的AmpliTaq聚合酶的等分样品加入到用3吗ml^EMA处理的主要混合物中，以便确定残留的EMA对Taq聚合酶活性是否有副作用。从该试验所得结果表明，在对照(没有加入EMA)和EMA处理的主要混合物之间，终点稀释度略有不同。在对照中，在0.039单位/反应的有效Taq聚合酶浓度下发生扩增，然而，对于EMA处理的样品而言，最低浓度为一个稀释度以下，即，0.079单位的Taq聚合酶(未显示数据)。这等同于损失大约7%加入的Taq聚合酶活性，在正常PCR操作下这不会引人注意。2.4.施用DNA聚合酶，而不是AmpliTaq聚合酶对于从1.6部分中用来消除PCR主要混合物制剂中污染性DNA方案的确认，还可以在3吗ml—1EMA存在下、在含有JumpStartTag-聚合酶或Plati皿mTag-聚合酶的主要混合物上进行。两个试验的结果在图7和8中有所说明，它们反映来自图3的那些结果。来自图7和8中泳道10的未处理阴性对照样品证明了特定PCR扩增子的扩增，这证实两种DNA聚合酶都是可扩增的DNA源。密度图谱表明，污染性DNA的定量差异是明显的，JumpStartTaq-聚合酶弓|入大约2fg的可扩增DNA/反应，而PlatinumTag-聚合酶则引入大约40fg的可扩增DNA/反应。至关重要的是，用3吗mrkMA进行处理完全抑制了阴性对照反应中污染性DNA的任何扩增(图7和8，泳道9)。而且，两种PCR主要混合物仍然都能使外部加入的、10fg到10ng范围内的、来自A.flav池ermus的模板DNA扩增(图7禾卩8，泳道2妾U8)。参考文献Aslanzahed,J.(1993).Applicationofhydroxylaminehydrochlorideforpost墨PCRsterilization.M/ecw/or朋dCW/w/ar尸ro6es7(2),145-150.Bolton,P.H.andKearns,D.R.(1978》Spectroscopicpropertiesofethidiummonoazide:afluorescentphotoaffmitylabelfornucleicacid.A^c/'ciesean:/z5(12),4891-4903.Bottger,E.,C.(1990).FrequentcontanminationofTaqpolymerasewithDNA.C7/m'ca/C7ze附/,36(6),1258-1259.Brosius,J.,Dull,T.J.，Sleeter,D.D.,Noller,H.F.(1980).GeneorganizationandprimarystructureofaribosomalRNAoperonfromEsc/zw-c/z/acW.■Aw""/q/"i/o/ogv148(2),107-27.Cantrell,C.E.,Yielding,K.L.,Pruitt,K.M.(1979).Efficiencyofphotolyticbindingofethidiummonoazidetonucleicacidsandsyntheticpolynucleotides.M/ecw/ariVa環aco/ogy15(2),322-330.Carroll,N.M.,Adamson,P.andOkhravi,N.(1999),EliminationofbacterialDNAfrom7^DNApolymerasesbyrestrictionendonucleasedigestion.Jowrwa/o/C7/"Zca/Af/cro^'o/ogy37(10)，3402-3404.Corless,C.E.,Guiver,M.,Borrow,R.,Edwards-Jones,V"Kaczmarski,E.B.andFox.A.J.(2000).Contaminationandsensitivityissueswithareal-timeuniversal16SrRNAPCR.Jowr"a/o/C7/"/ca/她ra6油gy38(5),1747-1752.DeFililppes,RM.(1991).DecontaminatingthepolymeraseChainReaction.别otec/zm々wes10(1)，26-30.Deragon,J.M.,Sinnett,D.，Mitchell,G,Potier,M.andLabudaD.(1990).UseofgammairradiationtoeliminateDNAcontaminationforPCR.M/c/e/c爿c/^y7^yrarc//18(20),6149.Fahle,G,A.,Gill，V.J.andFischer,S.H.(1999》Optimalofisopsoralentopreventampliconcarryover.Jowma/o/C7z'm'ca/M/cra^o/ogy37(1),261-262.Freeze,E.,Bautz,E.andFreese，E.B.(1961).Thechemicalandmutagenicspecificityofhydroxylamine.f/zeAto/ona/」a^附少^/\SWe"ce47,845-855.Frothingham.R.，Blitchington,R.B.,Lee,D，H.,Greene,R.C,Wilson,K.H.，(1992).UVabsorptioncomplicatesPCRdecontamination,5/她c/m々w^y13,208-210.Garland,F.，Graves,D.，E.，Yielding,L.,W.andCheung,H.，C.(1980).Comparativestudiesofthebindingofethidiumbromideanditsphotoreactiveanaloguestonucleicacidsbyfluorescenceandrapidkinetics.19(14)，3221-3226.Goldenberger,D.,Altwegg,M.(1995》EubacterialPCR:contaminatingDNAinprimerpreparationsanditseliminationbyUVlight.Jowraa/Mfcra6zWogy她/^ods21,27-32.Goto,M.,Ando，S.,Hachisuka,Y.andYoneyama,T.(2005).ContaminationofdiversenifHandnifH-likeDNAintocommercialPCRprimers.FEMSM'cro6z'o/og7c丄"&rs246(1),33-88.Graves,D.E.，>Vatkins,C.L.andYielding,L.W.(1981).Ethidiumanditsphotoreactiveanalogues:spectroscopicanalysisofdeoxyribonucleicacidbindingproperties.BZoc/^/mW/^20(7),1887-1892.HardwickJ.M.,vonSpreckenR.S.,Yielding,K.L.,Yielding,L.W.(1984).EthidiumbindingsitesonplasmidDNAdeterminedbyphotoaffinitylabeling.Toi/rwa/C7^mz'Wry1259(17),11090-11097.Heininger,A.,Binder,M.，Ellinger,A.,Botzenhart,K.，Unertl,K.，andDoring,G,,(2003).DNasepretreatmentofmastern;ixreagentsimprovesthevalidityofuniversal16SrRNAgenePCRresults.Towrwa/q/"C7/m'ra/MfcraZnWogy41(4),1763-1765.Hilali，F.,Saulnier,P"Chachaty,E.andAndremont，A.(1997).Decontaminationofpolymerasechainreactionreagentsfordetectionoflowconcentrationsof16SrRNAgenes.M/ecw/"rS/o^c/mo/ogv7(3),207-16.Hughes,M.S.,Beck,L.A.andSkuce,R.A.(1994).IdentificationandeliminationofDNAsequencesinTaqDNApolymerase.Jbwm"/C//mca/M/cra6zo/ogv32(8)，2007-2008.Jinno,Y.,Yoshiura,K.andNiikawa，N.(1990).UseofpsoralenasextinguisherofcontaminatedDNAinPCR.A^/ez"c/"e廳尸c//18(22)，6739.Kitchin，P.A.，Szotyori，A.,Fromholc，C.andAlmondN.，1990.Avoidanceoffalsepositive.淑置344(6263),201.Maiwald,M,,Ditton,H.J.，Sonntag,H.G"vonKnebelDoeberitz,M.(1994).CharacterizationofcontaminatingDNAinTag-polymerasewhichoccursduringamplificationwithaprimersetforZ^g/owe//"5SribosomalRNA.Afo/ecw/"r/VoZ^s8(1)，11-14.Meier,A.,Persing,D.H.，Finken，M.andBottger,E.C.(1993).EliminationofcontaminatingDNAwithinpolymerasechainreactionreagents:implicationsforagen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廉·摩根,安德鲁斯·瑞克特申请人:怀卡托林克有限公司