从细胞培养物分离纯化的水泡性口炎病毒的纯化方法

专利名称：：从细胞培养物分离纯化的水泡性口炎病毒的纯化方法
技术领域：
：本发明描述从细胞培养物分离纯化的水泡性口炎病毒的纯化方法。
背景技术：
：水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)的成员，具有非节段性、负股、单链RNA基因组。其11kb基冈组具有编码所述病毒的五种结构蛋白的五个基因核壳体蛋白(N)，其化学计量量为壳体化所复制的RNA所需的；磷蛋ft(P),其为RNA依赖性RNA聚合酶(L)的辅因子；基质蛋白(M)和附着糖蛋白(G)(例如参见伽里昂(Gallione)等人，1981病毒学杂志(J.Virol.),39:529-535;罗斯(Rose)和伽里昂(Gallione)，1981,病毒学杂志(J.Virol.)，39:519-528:美国专利第6,033,886号；美国专利第6，168，943号)。一般来说，不认为VSV是人类病原体，且因而，对VSV的预存在的免疫性在人类群体中是罕见的。因此，源自VSV的载体的发展已成为诸如免疫原性组合物(例如疫苗)和传递编码治疗性蛋白质的基因的领域的关注焦点。举例来说，研究已确定VSV可用作用于表达流感病毒血细胞凝集素蛋白(罗伯茨(Roberts)等人，1999病毒学杂志(J.Virol.),73:3723-3732)、麻疹病毒H蛋白(施勒雷特(Schlereth)等人，2000病毒学杂志(J.Virol.)，74:4652-4657)和HIV-1env和gag蛋0(罗斯(Rose)等人，2001细胞(Cell),106(5):539-49)的有效载体。VSV的使其成为有吸引力的载体的其它特征包括(a)能够在细胞培养物中有力地复制；(b)不能整合到宿主细胞DNA中或经受遗传重组；(c)存在多种血清型，允许用于初始-加强(prime-boost)免疫策略的可能性；(d)可将所关注的外来基因插入VSV基因组中且通过病毒转录酶大量地表达；和(e)发展从病毒基因组的cDNA拷贝拯救感染性病毒的专门系统(例如参见美国专利第6,033,886号；美国专利第6,168,943号)。vsv作为载体的免疫原性组合物的产生通常包括用重组体vsv感染合适的细胞培养物(宿主)，使vsv在细胞培养物中生长，在适当时刻收获细胞培养液且从所述细胞培养液纯化vsv。vsv载体和其免疫原性组合物在临床应用中的用途将需要适当纯度的vsv样品(或剂量)以便遵守全世界各种药物安全管理机构(例如，食品与药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)、欧洲l药品局(EuropeanMedicinesAgency,5EMEA)、加拿大保健品与食品局(HealthProductsandFoodBranch,HPFB)等)的安全条例。然而，使用目前可用的vsv纯化方法(例如通过蔗糖梯度离心来纯化)通常难以从细胞培养物污染物(例如细胞培养物杂质蛋白质和DNA)中分离VSV和获得适当纯度和产率的VSV。举例来说，使用目前可用的纯化方法，VSV样品的纯度与回收率(产率百分比)之间通常存在反比关系，从而使得难以制造足够量的纯化的VSV。另外，在当今基于生物反应器的方法中，细胞浓度增加和培养时间较长导致VSV效价较高，伴以生物反应器流体屮的细胞碎片和有机组分浓度增加，进'步使VSV纯化方法复杂化。从1964年起，蔗糖梯度超速离心已成为病毒纯化(包括VSV纯化)的标准方法(山田(Yamada)等人，2003生物技术(BioTechniques),34(5):1074-1078，1080;布朗(Brown)等人，1967免疫学杂志(J.Immun.)，99(1):171-7;鲁宾逊(Robinson)等人，1965国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,54(1):137-44;西村(Nishimura)等人，1964口本医学科学与生物学杂志(Japan.J.Med.Sci.Biol.)，17(6):295-305)。然而，随着病毒浓度增加，同时还出现细胞碎片、宿主DNA和蛋白质杂质的增加，很难在较高浓度下通过蔗糖梯度超速离心将其移除。另外，蔗糖梯度超速离心按比例扩大的成本极高。通过聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)沉淀(麦克沙力(McSharry)等人，1970病毒学(Virol.),40(3):745-6)浓縮和纯化VSV具有高杂质含量的类似问题。已通过尺寸排阻色谱法获得相对高质量的病毒(川斯菲格瑞兹恩(Transfiguracion)等人，2003人类基因疗法(HumanGeneTher.)，14(12):1139-1153;威尔卡姆普(Vellekamp)等人，2001人类基因疗法(HumanGeneTher.)，12(15):1923-36;拉伯迪(Rabotti)等人，1971ComptesRendusdesSeancesdeI'AcademiedesSciences,D系歹lj:自然科学(SerieD:SciencesNaturelles),272(2):343-6;嘉克力(Jacoli)等人，1968生物化学与生物物理学学报普通主题(Biochim.Biophys.Acta,GenlSubj,),165(2):99-302)。然而，由于方法成本和操作困难，通常不可用于大规模病毒生产。亲和色谱法，诸如肝素(维尔热宾茨基(Zolotukhin)等人，1999基因疗法(GeneTher.)，6(6):973-985)、外源凝集素(卡尔森艾斯(Kaarsnaes)等人，1983色谱法杂志(J,Chromatog.)，266:643-9;克里斯蒂安森(Kristiansen)等人，1976生液学报(Prot.Biol.Fluids),23:663-5)和麦卓斯赛李方(MatrexCellufine)硫酸盐(唐宁(Downing)等人，1992病毒学方法杂志(J.Virol.Meth.)，38(2):215-228)已在病毒纯化方面有些应用。由于可能出现浸析问题，肝素和外源凝集素通常并不是cGMP病毒生产优选的(或用于cGMP病毒生产)，在产品发布之前将需要附加测试。由于病毒纯化的效率、病毒质量和柱再生，使用麦卓斯赛李方硫酸盐亲和力纯化病毒是一个未解决的问题。对于VSV纯化来说，需要极大的亲和管柱(例如，每升细胞培养物0.2L麦卓斯赛李方硫酸盐树脂；韦思疫苗公司(WyethVaccine)未公开的结果)。当通过单独离子交换色谱法或结合用于病毒纯化的其它类型的传统色谱技术纯化时，观察到低病毒产率(国际专利公开案第WO2006/011580号；斯倍驰(Specht)等人，2004生物技术与生物工程学(Biotech.Bioeng.)，88(4):465-173;山田(Yamada)等人，2003，卜.文所引用；威尔卡姆普(Vellekamp)等人，2001上文所引用；维尔热宾茨基(Zolotukhin)等人，1999，上文所引用；(国际专利公开案第W01997/06243号卡尔森艾斯(Kaarsnaes)等人，1983,上文所引用)。__因此，此项技术中目前正需要可产生适当纯度和回收率(产率)的VSV的纯化方法。
发明内容本文所述的方法和组合物通常涉及病毒学、微生物学、免疫学和方法发展领域。更特定来说，描述用于获得具有改良纯度和产率的水泡性口炎病毒(vsv)的新颖纯化方法。一方面，从感染vsv的哺乳动物细胞培养的细胞培养液纯化vsv的方法包含以下步骤(a)初次澄清、(b)二次澄清、(c)阴离子交换膜吸附、(d)切向流动过滤和(e)过滤。在一实施例中，步骤(a)包含通过低速离心使细胞培养液澄清和回收上清液中的VSV。在一实施例中，步骤(b)包含通过0.2Hm到0.45pm过滤器过滤所述上清液和回收过滤溶液屮的VSV。在另-'实施例中，步骤(c)包含将所述VSV过滤的溶液装载到用第一pH值缓冲盐溶液平衡的阴离子交换膜吸附剂上，用第二pH值缓冲盐溶液从所述阴离子交换膜吸附剂洗脱VSV，和回收洗脱VSV的洗脱份。在一实施例中，步骤(d)包含通过切向流动过滤(tangentialflowfiltration,TFF)使用具有介于300kDa与1,000kDa之间的截留分子量的中空纤维膜纯化回收的VSV和回收保留物(retentate)中的VSV。在一实施例中，步骤(e)包含通过0.2pm到0.22pm过滤器过滤VSV保留物和回收过滤溶液中的VSV。在某些实施例中，所述哺乳动物细胞培养的细胞是选自人类胚肾(humanembryonickidney,HEK)细胞、HEK293细胞、中同仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞、幼仓鼠肾(babyhamsterkidney,BHK)细胞和非洲绿猴肾(Africangreenmonkeykidney,AGMK)细胞(又称为维拉细胞(verocell))。在某些实施例中，所述纯化方法的低速离心步骤是介于4,400Xg到8,000Xg之间。在一特定实施例中，低速离心是6，238Xg。在另一实施例屮，所述0.2至l」0.45pm过滤器是密理博密勒-GV(MilliporeMillex-GV)过滤装置、密理博密勒-GP(MilliporeMillex-GP)过滤装置、颇尔梭伯(PallSupor)过滤装置、赛多利斯赛多朗(SartoriusSartobranTM)过滤装置或赛多利斯赛多博2(SartoriusSartopore2)过滤装置。在一特定实施例中，所述过滤器是0.2pm赛多利斯赛多朗过滤装置。在其它实施例中，所述阴离子交换膜吸附剂是赛多利斯赛多结Q(SartoriusSartobindQ)膜吸附剂或颇尔妙丁Q(PallMustangQ)膜吸附剂。在一特定实施例中，阴离子交换膜吸附剂是颇尔妙丁Q膜吸附剂。在某些其它实施例中，步骤(c)的所述第一pH值缓冲盐溶液中的盐是NaCl或KC1。在另一实施例中，所述NaCl或KCl的离子强度是O.lM到0.4M。在一特定实施例中，所述盐是NaCl且NaCl的离子强度是0.3M。在另一实施例中，步骤(c)的所述第二pH值缓冲盐溶液中的盐是NaCl或KC1。在一特定实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的盐是NaCl。在一特定实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离-了强度是介于0.5M到0.75M之间。在另一特定实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度是0.6M。在其它实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度是0.75M。在某些其它实施例中，第二pH值缓冲盐溶液具有10容器体积/分钟(capsulevolume/minute;CV/分钟)到30CV/分钟的洗脱流动速率。在其它实施例中，洗脱流动速率是20CV/分钟。在某些其它实施例中，在10CV/分钟到30CV/分钟的洗脱流动速率下第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度从0.001M线性增加到0.75M。在一特定实施例中，线性洗脱梯度流动速率是20CV/分钟。在其它实施例中，步骤(c)的第一和第二缓冲液具有介于6.0到8.5之间的pKa。在其它实施例中，步骤(c)的第一pH值缓冲盐溶液具有6.5到8.0的pH值。在一特定实施例中，第一pH值缓冲盐溶液具有7.5的pH值。在其它实施例中，步骤(c)的第二pH值缓冲盐溶液具有6.5到8.0的pH值。在一特定实施例中，第一.pH值缓冲盐溶液具有7.5的pH值。在某些其它实施例中，步骤(c)的第一和第二缓冲液是磷酸盐缓冲液、N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicacid，HEPES)缓冲液或三(羟基甲基)氨基甲垸(TRIS)。在另一实施例中，步骤(c)的第一和第二pH值缓冲盐溶液还包含浓度为1.5%到5%的蔗糖。在一特定实施例中，蔗糖浓度为2%。在某些其它实施例中，所述TFF膜具有300kDa截留分子量。在其它实施例中，TFF膜具有750kDa截留分子量。在其它实施例中，TFF膜具有至少350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、800kDa、850kDa、900kDa、950kDa或l，OOOkDa截留分子量。在一特定实施例中，TFF膜是中空纤维膜模块。在另一实施例中，TFF包含将从步骤(c)回收的VSV浓縮至少5倍，随后缓冲液交换至少一次。在乂一实施例中，TFF包含将从步骤(c)回收的VSV浓縮至少5倍，随后缓冲液交换至少五次。在一特定实施例中，用于缓冲液交换的缓冲液是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液或TRIS缓冲液，其中所述缓冲液具有5mM到15mM的浓度和7.2到7.5的pH值。在另一实施例中，缓冲液交换缓冲液还包含0.10M到0.20MNaCl和3.5%到4.5%蔗糖。在其它实施例中，纯化方法步骤(a)到(e)是在室温下执行，其中室温定义为15'C和25'C或介于约15'C到约25'C之间的温度。在一特定实施例中，纯化方法步骤(a)到(e)是在20'C下执行。在又一实施例中，步骤(a)中细胞培养液的澄清是通过1.0pm到4.5nm深度过滤模块进行，其中步骤(a)中省略低速离心。在特定实施例中，所述深度过滤模块为沃特曼聚盖HD模块(WhatmanPolycapHDmodule)、赛多利斯赛多清P模块或密理博密理组HC模块(MilliporeMillistak+HCmodule)。另一方面，从哺乳动物细胞培养物获得具有改良纯度的vsv。在某些实施例中，纯化的VSV至少90.0%不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。在其它实施例中，纯化的VSV99.07。不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。在一特定实施例中，纯化的VSV99.8%不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。在某些其它实施例中，提供具有改良纯度的VSV，根据本文所述的新颖纯化方法将其纯化和分离。在某些实施例中，纯化的VSV的特征是下列特征中的一种或多种所选的VSV血清型或血清型的组合；包含至少一个突变或至少两个突变的基因组序列，所述突变减弱VSV的致病性；包含外来多核苷酸序列开放阅读框架(openreadingframe,ORF)的基因组序列；编码本说明书的详细描述部分中详细叙述的各种蛋白质(治疗性或免疫原性)中的一种或多种的序列。本文所述的组合物和方法的其它特征和优点将从以下详细描述、从其优选实施例和从权利要求书中显而易见。图1是展示从哺乳动物细胞培养液获得具有改良纯度的VSV的纯化方法的流程图(以黑框概述)。图2A是展示在妙丁Q膜吸附剂上在洗脱缓冲液(10mM磷酸钠、l.OMNaCl)中添加2呢蔗糖的情况下纯化后通过银染色分离VSV蛋白质的电泳凝胶。条带1-10是(1)离心前(细胞培养物)、(2)进料、(3)流过和洗涤、(4)5呢缓冲液B(洗脱份1-5)、(5)60呢缓冲液B(洗脱份6-7)、(6)60呢缓冲液B(洗脱份8-10)、(7)60%缓冲液B(洗脱份11-25)、(8)100免缓冲液B(洗脱份26-35)、(9)柱再生和(10)伯乐标准蛋白(Bio-RadPrecisionPlusProtein)标准物。妙丁Q的流动速率在线性洗脱梯度下是3.5毫升/分钟。SDS-PAGE分析使用4-20%Tris-甘氨酸凝胶且蛋白质检测是通过银染色进行。图2B是展示根据图2A的描述、通过西方印迹法分离VSV蛋白质的电泳凝胶。西方印迹法检测使用抗-VSV多株抗体。图3A是展示在妙丁Q膜吸附剂上在洗脱缓冲液(lOmM磷酸钠、1.0MNaCl)中不添加蔗糖的情况下纯化后通过银染色和西方印迹法分离VSV蛋白质的电泳凝胶。条带l-9是(l)进料、(2)流过和洗涤、(3)5%缓冲液B(洗脱份1-5)、(4)60呢B(洗脱份6-11)、(5)60呢缓冲液B(洗脱份12-25)、(6)100%缓冲液B(洗脱份26-35)、(7)伯乐标准蛋白标准物、(8)VSV标准物(即，蔗糖梯度纯化的VSV)和(9)柱再生混合物。妙丁Q的流动速率在步进洗脱梯度下是3.5毫升/分钟(10CV/分钟)。SDS-PAGE分析使用4-207。Tris-甘氨酸凝胶且蛋白质检测是通过银染色进行。图3B是展示在如图3A中所述的纯化后通过西方印迹法分离VSV蛋白质的电泳凝胶。西方印迹法检测使用抗-VSV多株抗体。缓冲液B(又称为"洗脱缓冲液")是10mM磷酸钠(pH7.0)禾PlMNaCl。图4A是在图1中所述的纯化方法的各步骤时通过银+胶体染色对VSV的SDS-PAGE分析(4-20y。Tris-甘氨酸凝胶)。条带1-12是(1)离心前、(2)离心后(1°澄清)、(3)0.2pm过滤前、(4)0.2pm过滤后(2°澄清)、(5)来自妙丁Q膜吸附剂的流过和洗涤混合物、(6)来自妙丁Q膜吸附剂的VSV洗脱份混合物、(7)来自TFFUF/DF的VSV保留物、(8)浓縮和透滤混合物、(9)0.2pm(最终)过滤前、(10)0.2^un(最终)过滤后(VSV纯化的整体浓缩物)、(11)伯乐标准蛋白标准物和(12)VSV对照组(3号组，纯化的整体浓缩物)。图4B是根据图4A中所述的方法通过西方印迹法对VSV的SDS-PAGE分析(4-20%Tris-甘氨酸凝胶)。图5A是通过银+胶体染色对根据图1中所示的方法所纯化的VSV对比通过蔗糖梯度离心(条带11)所纯化的VSV的SDS-PAGE(4-20%Tris-甘氨酸凝胶)比较。条带1-12是(1)细胞培养液、(2)离心后(1°澄清)、(3)0.2pm过滤前、(4)0.2pm过滤后(2。澄清)、(5)来自妙丁Q膜吸附剂的流过和洗涤混合物、(6)来自妙丁Q膜吸附剂的VSV洗脱份、(7)来自TFFUF/DF的VSV保留物、(8)0.2|iim(最终)过滤前、(9)0.2nm(最终)过滤后(VSV纯化的整体浓缩物)、(10)伯乐标准蛋白标准物、(U)通过蔗糖梯度纯化的VSV(仅添加条带9的一半容量)和(12)VSV对照组(1弓组，纯化的整体浓缩物)。图5B是通过西方印迹法对根据图1中所示的方法所纯化的VSV对比通过如图5A中所述的蔗糖梯度离心(条带11)所纯化的VSV的SDS-PAGE(4-20%Tris-甘氨酸凝胶)比较。图6是展示来自四个按比例扩大组(细胞培养物容量为4.5L)的VSV效价回收率百分比的条形图。CR弁1是实验组1，CR弁2是实验组2，CR#3是实验组3且TT01是实验组4。图7是展示VSVwN4CT,-gagl构筑体的妙丁Q纯化步骤中的杂质蛋白移除的条形图。图8A是展示在pH6.5下在TMAE条件筛选中VSVwN4CT,-gagl回收率的条形图。图8B是展示在pH7.0下在TMAE条件筛选屮VSVn;N4CT,-gagl回收率的条形图。图8C是展示在pH7.5下在TMAE条件筛选中VSVNjN4CT,-gagl回收率的条形图。具体实施例方式因为水泡性口炎病毒(vsv)具有许多使其成为用于免疫原性组合物中和/或传递编码如上文所述的治疗性蛋白的基因的有吸引力的载体的特征，所以此项技术中正需要从哺乳动物细胞培养物产生具有改良纯度的重组vsv的纯化方法。下文所述的组合物和方法解决此需要。如下文实例3-8中所陈述，描述从哺乳动物细胞培养物纯化VSV的改良方法(例如参见图1)和由此纯化的VSV。I.在哺乳动物细胞培养物中产生vsv在哺乳动物细胞培养物中产生vsv为所属领域的技术人员所熟知，且通常包括用重组vsv感染所述细胞培养物(宿主细胞)，使vsv在细胞培养物中生长并且在适当时刻收获细胞培养物。因为vsv从宿主细胞分泌到培养基中，所以从细胞培养液中收集vsv产物。11从哺乳动物细胞培养物产生VSV和由此如本文所述从其中纯化VSV的新颖方法利用用于使VSV(非节段性、负股、单链RNA病毒)增殖(或生长)的合适哺乳动物细胞培养物，其为此项技术所己知。所述细胞培养物包括(但不限于)人类胚肾(HEK)细胞(诸如HEK293细胞)、非洲绿猴肾(AGMK)细胞(诸如维拉细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。另外，细胞培养材料、方法和技术为所属领域的技术人员所熟知。举例来说，在生物反应器中以给定病毒感染剂量(multiplicityofinfection)使用重组VSV种子储备(例如获救的VSV，参见下文II部分)感染融合的宿主细胞群体或一定密度的宿主细胞群体(例如维拉细胞培养物)，在给定时间和温度下使VSV在细胞培养物中生长；且在细胞培养液中收获新生的VSV子代。如下文所定义，术语"培养液"、"细胞培养液"、"细胞培养基"、"培养基"和/或"生物反应器流体"(bioreactorfluid)可互换使用，且指的是细胞培养物生长于其中的培养基或溶液。II.从哺乳动物细胞培养物纯化vsv从感染本文所述的vsv的哺乳动物细胞培养的细胞培养液纯化vsv的新颖方法包含某些纯化步骤。图1中的流程图概述整个纯化流程，其包括(a)初次澄清、(b)二次澄清、(c)阴离了交换膜吸附、(d)切向流动过滤和(e)过滤的步骤。更特定来说，所述步骤包含(a)通过低速离心使细胞培养液澄清、(b)通过由0.2^m到0.45过滤器过滤进一步使上清液澄清、(c)在阴离子交换膜吸附剂上纯化VSV过滤的溶液、(d)通过切向流动过滤(TFF)进行缓冲液交换和浓縮VSV和(e)通过0.2nm到0.22^m过滤器对VSV保留物进行最终过滤。在某些其它实施例中，以上纯化方法步骤(a)到(e)是在室温下执行。如下文所定义，"室温"是约15'C和25'C或介于约15'C与25'C之间的温度。因此，举例来说，用于执行步骤(a)到(e)的合适温度包括至少15。C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C、22°C、23°C、24。C和包括25°C的温度或介于其之间的部分温度。在一特定实施例中，纯化方法步骤(a)到(e)是在20'C下执行。效汰澄獰在某些实施例中，通过低速离心(或者，通过深度过滤)使感染VSV的哺乳动物细胞培养的细胞培养液澄淸且在上淸液中回收VSV，本文中乂称为细胞培养液的"初次(或1°)澄清"。在某些实施例屮，细胞培养液的初次澄清是在室温下进行。用于细胞培养液的初次澄清的离心方法和设备为所属领域的技术人员所熟知。如下文所定义，"低速"离心是离心速度低于10，000rpm。在某些实施例中，用于使细胞培养液澄清的低速离心速度是在4,000Xg(士100Xg)至lj8，000Xg(士100Xg)范围内的离心速度。在某些其它实施例中，用于使细胞培养液澄清的低速离心速度是至少4.000xg、4，500xg、5，000xg、5，500xg、6，000xg、6,500xg、7,000xg、7，500xg或8，000xg或介于其之间的每分钟转数(rpm)的离心速度。在'特定实施例屮，通过低速离心对细胞培养液的初次澄清是在6，238xg下在室温下进行三十分钟(实例3，表2)。如上文所述，在某些实施例中，通过深度过滤(即，代替低速离心)使感染VSV的哺乳动物细胞培养的细胞培养液澄清(1°)。当步骤(a)的初次澄清中省略低速离心时可使用深度过滤。深度过滤(与表面过滤相反)通常指的是将污染物截获在其结构内的"厚"过滤器。深度过滤材料和方法为所属领域的技术人员所熟知。举例来说，过滤材料通常由厚的且纤维纤维素结构和嵌入纤维开口中的无机助滤剂(诸如硅藻土粒子)组成。这种过滤材料具有大内表面积，这是粒子截获和过滤能力的关键。所述深度过滤模块含有直径尺寸为1.0um和4.5pm或介于1.0pm与4.5之间的小孔，包括至少1.0pm、1.5pm、2.0pm、2.5|im、3.0^m、3.5|tim、4.0|_un禾B4.5|tim的过滤器尺寸，和介于其之间的部分过滤器尺寸。示范性深度过滤模块包括(但不限于)沃特曼聚盖模块(沃特曼公司(WhatmanInc.);新泽西州弗伦翰公园(FlorhamPark,NJ))、赛多利斯赛多清P模块(赛多利斯公司(SartoriusCorp.);纽约埃奇伍德(Edgewood,NY))和密理博密理组HC模块(密理博公司(Millipore);马萨诸塞州比尔里卡(Billerica,MA))。在一特定实施例中，通过深度过滤(在室温下执行)使细胞培养液澄清且在滤液中回收VSV(实例3,表1)。"J二汰澄獰通过离心(或深度过滤)初次澄清后，通过过滤或微滤，通过0.2到0.25过滤器进一步使VSV上清液(或滤液)澄清(2°)且在过滤溶液中回收VSV。在一特定实施例中，如上文所定义，微滤是在室温下执行。过滤/微滤介质可用于各种制造材料和方法中，其为所属领域的技术人员所已知。示范性微滤过滤装置包括(但不限于)密理博密勒GV过滤装置(密理博公司(Millipore);马萨诸塞州比尔里卡(Billerica,MA))、密理博密勒-GP过滤装置、颇尔梭伯过滤装置(颇尔公司(PallCorp.);纽约东山(EastHills,NY))、赛多利斯赛多朗过滤装置(赛多利斯公司(SartoriusCorp.);纽约埃奇伍德(Edgewood,NY))和赛多利斯赛多博2过滤装置。在某些实施例中，这些过滤装置具有尺寸介于0.2到0.45|iim之间的过滤器。这些过滤器包括具有至少0.2pm、0.25pm、0.3pm、0.35pm、0.4和0.45和介于其之间的部分孔径的小孔的过滤器。在一特定实施例中，所述过滤器是0.2赛多利斯赛多朗，过滤装置。在过滤溶液中回收过滤的VSV。0麟伎雄级,已通过澄清(即，上文所述的1。和2。)回收VSV产物后，在阴离子交换膜吸附剂上进一步纯化VSV。膜吸附剂材料为所属领域的技术人员所熟知且可得自诸如赛多利斯公司(纽约埃奇伍德(Edgewood，NY))、颇尔公司(纽约东山(EastHills，NY))和希格玛-阿尔德里希公司(Sigma-AldrichCorp.)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))的供应商。示范性阴离子交换膜吸附剂包括(但不限于)赛多结Q膜吸附剂(赛多利斯公司)和妙丁Q膜吸附剂(颇尔公司)。在一特定实施例中，阴离子交换膜吸附剂是颇尔妙丁Q膜吸附剂。一般来说，自常规离子交换色谱法已知的方法和缓冲液可直接应用于膜吸附剂色谱法，其为所属领域的技术人员所己知。在某些实施例中，如上文所定义，阴离子交换膜吸附剂色谱法是在室温下执行。因此，在某些实施例中，通过阴离了交换膜吸附剂纯化VSV，其中将来Q二次澄清的VSV过滤的溶液装载到用第一pH值缓冲盐溶液(又称为"平衡缓冲液"或VSV"结合缓冲液")平衡的阴离子交换膜吸附剂上。用第二pH值缓冲盐溶液("洗脱缓冲液")从阴离子交换膜吸附剂洗脱VSV且回收洗脱的VSV洗脱份(例如参见下文实例6)。在某些实施例中，所述第一pH值缓冲盐溶液或平衡缓冲液是NaCl或KC1盐溶液。所述NaCl或KC1是以介于约至少0.1M到约0.4M之间的离子强度存在于溶液中。因此，所述盐的离子强度包括至少0.1M、0.2M、0.3M和0.4M,包括介于其之间的部分离子强度。在一特定实施例中，所述盐是NaCl且NaCl溶液的离子强度是0.3M。缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液或三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液。在某些实施例中，这些缓冲液具有介于约6.0到约8.0之间的pH值，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7,2、7.4、7.6、7,8和8.0的pH值或介于其之间的pH值数。在一特定实施例中，第一pH值缓冲盐溶液具有7.5的pH值。在其它实施例中，阴离子交换膜吸附步骤的第'缓冲液具有介于6.0到8.5之间的pKa，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4禾口8.5的pKa或介于其之间的pKa数。在特定实施例中，平衡缓冲液还包含约1%蔗糖到约5%蔗糖。在某些实施例中，平衡缓冲液包含约1%蔗糖。在一特定实施例中，蔗糖浓度是2%。在另一实施例中，缓冲液包含约3%蔗糖。在另一实施例中，缓冲液包含约4%蔗糖。在另一实施例中，缓冲液包含约5%蔗糖。可用介于以上指定整数之间的蔗糖浓度的其它百分比。第二pH值缓冲盐溶液("洗脱缓冲液")也可以包含与第一(平衡)缓冲液相同的缓冲组分。在某些实施例中，第二pH值缓冲盐溶液或平衡缓冲液是NaCl或KC1盐溶液。在一特定实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的盐是NaCl。所述NaCl或KCl是以介于约至少O.lM到约0.4M之间的离子强度存在于溶液中。因此，所述盐的离子强度包括至少0.1M、0.2M、0.3M和0.4M,包括介于其之间的部分离子强度。在.特定实施例中，所述盐是NaCl且NaCl溶液的离子强度是0.3M。缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液或三(羟基甲基)氨基甲垸(TRIS)缓冲液。在某些实施例中，这些缓冲液具有介于约6.0到约8.0之间的pH值，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0的pH值或介于其之间的pH值数。在-"特定实施例中，第二pH值缓冲盐溶液具有7.5的pH值。在其它实施例屮，阴离子交换膜吸附步骤的第二缓冲液具有介于6.0到8.5之间的pKa，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5的pKa或介于其之间的pKa数。在特定实施例中，洗脱缓冲液还包含约1%蔗糖到约5%蔗糖。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含约1%蔗糖。在一特定实施例中，蔗糖浓度是2%。在另一实施例中，缓冲液包含约3%蔗糖。在另.实施例'l'，缓冲液包含约4%蔗糖。在另实施例'l'，缓冲液包含约5%蔗糖。可用介于以上指定整数之问的蔗糖浓度的其它百分比。为从膜上洗脱VSV，通过线性梯度或单步骤洗脱过程来增加洗脱缓冲液的盐(NaCl或KC1)浓度(离子强度)(实例6)。两个步骤同样有效从阴离-了-交换膜吸附剂洗脱VSV。在一特定实施例中，第一.pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度是介于0.5M到0.75M之间。在另一特定实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度是0.6M。在其它实施例中，第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度是0.75M。在某些其它实施例中，第二pH值缓冲盐溶液具有10容器体积/分钟(CV/分钟)到30CV/分钟的洗脱流动速率。因此，在某些实施例中，洗脱流动速率至少是10、12、14、16、18、20、22、24、26、28到30CV/分钟，或介于其之间的速率。在一特定实施例中，洗脱流动速率是20CV/分钟。在某些其它实施例中，在如上所述10CV/分钟到30CV/分钟的洗脱流动速率下第二pH值缓冲盐溶液中的NaCl的离子强度从0.001M线性增加到0.75M。在一特定实施例中，线性洗脱梯度流动速率是20CV/分钟。"J雄磁动雄rrFfV通过阴离子交换膜吸附剂色谱法进行VSV纯化后，通过切向流动过滤(TFF)进_-步纯化VSV。一般来说，TFF是使用膜来分离液体溶液(或悬浮液)中的组分的压力驱动过程，其中沿所述膜的表面将流体(进料流体)切向抽汲且使用外加压力迫使流体的一"部分"通过膜到(膜的)滤液侧。在某些实施例中，TFF是在室温下执行。在这个过程中，交换缓冲液且浓縮VSV。在一实施例中，TFF包含将从阴离子交换膜吸附步骤回收的VSV浓縮至少5倍，随后缓冲液交换至少一次。在另一实施例中，TFF包含将从阴离子交换膜吸附步骤回收的VSV浓縮至少五倍到十倍，随后缓冲液交换至少五次或至少六次。其它实施例在浓縮从阴离子交换膜吸附步骤回收的VSV后包含至少两次、至少三次、至少四次、至少五次或至少六次缓冲液交换。TFF材料(例如中空纤维、螺巻式、平板)和方法(例如超滤(UF)、透滤(DF)、微滤)为所属领域的技术人员所熟知。在某些实施例中，TFF膜具有300kDa截留分子量。在某些实施例'i1，TFF膜具有350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa或700kDa截留分子量。在又一实施例中，TFF膜具有750kDa截留分子量。在一实施例中，TFF膜是中空纤维膜模块。在一特定实施例中，用于TFF的缓冲液交换的缓冲液是如上文所述的磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液或TRIS缓冲液。然而，在某些实施例中，缓冲液具有5mM到15mM的浓度，包括至少5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM和15mM的浓度且还包括介于其之间的毫摩尔浓度。在某些实施例中，缓冲液具有介于约7.2到7.5之间的pH值。因此，在一实施例中，缓冲液具有7.2、7.3、7.4或7.5的pH值或介于其之间的部分pH值。在另一实施例中，缓冲液交换缓冲液还包含0.10M到0.20MNaCl和3.5%到4.5%蔗糖。在'特定实施例屮(参见实例7)，混合来自阴离子交换膜吸附剂纯化的VSV洗脱份，且浓縮混合溶液并通过TFF使用具有750kDa的截留分子量的中空纤维TFF膜滤筒(通用电气医疗生物科学公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp.);新泽西州皮斯卡塔市(Piscataway，NJ))交换缓冲液。"J过滤纯化中的最后加工步骤是来自TFF的VSV保留物的最终微滤，其中如上文对于通过微滤进行二次澄清所述和下文实例7中进一步所述，通过0.2pm到0.25过滤器过滤所述保留物。举例来说，所述过滤设置可利用尺寸0.20pm、0.21pm、0.22pm、0.23pm、0.24pm或0.25pm或介于其之间的部分尺寸的过滤器。根据本文所述的新颖方法纯化VSV在下文实例中详细描述，所述描述包括培养液的初次(实例3)和二次(实例4)澄清，分别包含低速离心(或深度过滤)和0.2-0.45liini过滤。澄清步骤后，依序通过阴离子交换膜吸附剂(实例6)、切向流动过滤、超滤和透滤(实例7)和0.2-0.22iiim过滤(实例7)来进一步纯化VSV。还根据本文所述的新颖方16法纯化四个大量(4.5L)VSV细胞培养物组(按比例扩大组)(实例8),其中在纯化期间移除分别大于99.9%和99.8%的蛋白质杂质(表11)和DNA(表13)。III.重组水泡性口炎病毒如本文所述，通过利用上文所述的新颖纯化方法从哺乳动物细胞培养物获得具有改良纯度的VSV。改良纯度的意思是纯化的VSV至少90.0%不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。在其它实施例中，具有改良纯度的VSV99.0呢不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。在一特定实施例中，具有改良纯度的VSV99.8呢不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。在特定实施例中，通过上文所述的方法从哺乳动物细胞培养的细胞培养液纯化的水泡性口炎病毒(VSV)是重组或基因改造VSV。制造重组RNA病毒(诸如VSV)的方法众所周知且在此项技术中称为"拯救"或"反向遗传学"方法。用于VSV的示范性拯救方法包括(但不限于)美国专利6,033,886和美国专利6，168，943中所述的方法，每一专利皆以引用的方式并入本文中。用于进行病毒(诸如VSV)拯救的其它技术在美国专利6,673,572禾BWO2004/113517中有描述，所述专利以引用的方式并入本文中。根据本文所述的新颖纯化方法纯化和分离的具有改fe纯度的VSV可为具有指定血清型的VSV。在某些实施例中，纯化的VSV是印第安纳(Indiana)血清型、新泽西(NewJersey)血清型、圣胡安(SanJuan)血清型、伊斯法罕(Isfahan)血清型、格拉斯哥(Glasgow)血清型或金迪普拉(Chandipura)血清型。在某些实施例中，VSV可含有来自-'种以上所述血清型的序列。根据本文所述的方法纯化的VSV载体(和免疫原性组合物)常常在VSV基因组内包含一种或多种减毒突变。在某些实施例中，纯化的VSV具有包含至少一个减弱VSV的致病性的突变的基因组序列。在其它实施例中，纯化的VSV具有包含至少两个减弱VSV的致病性的突变的基因组序列。举例来说，减毒VSV包含两个或两个以上已知减毒突变，诸如国际专利申请案第PCT/US2005/011499号(国际专利公开案第号WO2005/098009)中所陈述的减毒突变，所述专利以引用的方式并入本文中。举例来说，已知VSV减毒突变包括(但不限于)基因改组突变(包括形成VSV基因组的VSV基因的基因改组且称为N、P、M、G和L)、G蛋白插入性突变、G蛋白截断突变、热敏性(ts)突变(和其它点突变)、非细胞病变M基丙突变、G-茎(G-stem)突变、双义RNA突变和基因缺失突变，其中每一者在国际公开案第WO2005/098009号中有详细陈述。因此，在某些实施例中，纯化的VSV包含一种或多种减毒突变，其包括(但不限于)热敏性(ts)突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截断G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在某些实施例中，通过本文所述的纯化方法纯化的VSV具有包含一种或多种外来或异源(或外来)多核苷酸序列(诸如外来RNA开放阅读框架(ORF))的基闲组序列。所述异源多核苷酸序列可按需要改变，且包括(但不限于)编码细胞因子(诸如介白素)的基因、编码T辅助表位的基因、编码CTL表位的基因、编码佐剂的基因和编码辅因子的基因、编码限制性标记的基因、编码治疗性蛋白质或不同微生物病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的蛋白质(特别是能够激发所需免疫反应的蛋白质)的基因。举例来说，编码不同微生物病原体的蛋白质的异源多核苷酸序列可为下列基冈屮的种或多种HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)基因、水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zostervirus)基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、A型肝炎病毒基因、B型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒基因、诺沃克病毒(Norwalkvirus)基冈、外衣病毒基闲、a病毒基冈、风疹病毒基冈、狂犬病病毒基冈、马尔堡病毒(Marburgvirus)基因、埃博拉病毒(Ebolavirus)基因、乳头瘤病毒基因、多形瘤病毒基因、偏肺病毒基因、冠状病毒基因、霍乱弧菌(W^/oc/u/erae)基因、肺炎链球菌(5Yre辯coccws戸e匪謹'ae)基因、化脓性链球菌(Sfr，ococc"51pyogenes)基因、幽门螺杆菌(//e/!'co&fl"erp;y/or!')基因、无乳链球菌(版一coc面agfl/ac""e)基因、脑月莫炎？K球菌(yVe/^e〃'amem'rtg"!W")基因、許木病奈瑟菌(yVe!'Me〃'ago"OAr/ieae)基丙、白喉杆菌(Cory"eZ7ac"〃'aA'p/U/ien'w)基因、破伤风梭菌(C/c^m^Kmfeam')基因、百日咳杆菌(SoWe"〃apemiM")基因、嗜血杆菌(//aemop/j!7w)基因、衣原体(C/i/amyWa)基因和大肠杆菌(^c/ienWn'aco"')基因。在某些实施例中，纯化的VSV包含HIV基因序列，其中所述HIV序列是选自由gag、e"v、poZ、vz/、"e/、tof、v/r、wv或vp"组成的群组。在一特定实施例中，HIV基因为gag或e肌。在某些其它实施例中，纯化的VSV含有至少一个减毒突变和至少一个如上文所述的异源ORF。举例来说，根据新颖方法纯化和下文V部分(实例2-8)中所示范的VSV免疫原性组合物(即，VSVINN4CT9-gagl)是包含两个减毒突变和一个编码HIV-1gag蛋白质的ORF的重组VSV。在其它实施例中，根据本文所述的新颖方法纯化的VSV编码HIVgag基丙，其屮所述gag基因插入VSV基因组中的位置一(3'-gagl-NPMGL-5')、位置二(3言匿N-gag2-PMGL-5')、位置三(3'-NP-gag3-MGL-5')、位置四O'-NPM-gag4-GL-5')、位置五(3'-NPMG-gag5-L-5')或位置六(3'-NPMGL-gag6-5')处。在其它实施例中，根据本文所述的新颖方法纯化的VSV编码HIVe"v基因，其中所述e肌基因插入VSV基因组中的位置一(3'-env广NPMGL-5')、位置二(3'-N-env2-PMGL-5')、位置三(3'-NP-env3-MGL-5')、位置四(3'-NPM-env4-GL-5')、位置五(3'-NPMG-env5-L-5')或位置六(3'-NPMGL-env6-5')处。所属领域的技术人员将从以上描述了解到各种重组VSV可根据上文所述的方法和方法来设计和纯化。IV.免疫原性和医药组合物在某些实施例屮，所述免疫原性组合物包含免疫原性剂量的根据本文所述的纯化方法纯化的基因改造vsv。举例来说，在某些实施例中，免疫原性组合物包含根据本文所述的纯化方法纯化的重组VSV，其中所述VSV包含一种或多种外来RNA序列插入复制不需要之VSV基因组区域中或置换所述区域。卜.文III部分中所述的重组VSV的实施例中的任一个可用于这些免疫原性组合物中。因此，在某些实施例中，调配纯化的VSV免疫原性组合物以向哺乳动物个体(例如人类)投药。所述组合物通常包含纯化的VSV载体和医药学上可接受的载剂。如下文所使用，措辞"医药学上可接受的载剂"意欲包括任何和所有与医药学投药相容的溶剂、分散介质、涂/S、抗齒剂和抗真齒剂、等张剂和吸收延迟剂等等。所述介质和药剂用于医药活性物质的用途为此项技术所熟知。除非任何常规介质或药剂与vsv载体不相容，否则将所述介质用于本文所述的免疫原性组合物中。补充活性化合物也可以并入组合物中。因此，将本文所述的vsv免疫原性组合物调配成与其所欲投药途径相容。投药途径的实例包括非经肠(例如，静脉内、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内)和粘膜(例如，口服、直肠、鼻内、颊、阴道、呼吸)。用于非经肠、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液包括下列组分无菌稀释剂，诸如注射用水、生理食盐水溶液、不挥发性油类、聚乙一醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、拧檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的药剂，诸如氯化钠或右旋糖。用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节pH值。非经肠制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。适合于可注射用途的医药组合物包括无菌水性溶液(当水可溶时)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内投药来说，合适的载剂包括生理食盐水、抑菌水、克莫弗EL(CremophorEL巴斯夫公司(BASF),新泽西州帕瑟伯尼(Parsippany，NJ))。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的且应为达到存在容19易注射性的程度的流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的且必须防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。所述载剂为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，丙二醇、丙二醇和液体聚乙二醇等等)的溶剂或分散介质和其合适的混合物。例如通过使用诸如卵磷脂之涂层，通过在分散液的情况下维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。通过例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸等等的各种抗菌剂和抗真菌剂来达成防止微生物的作用。在多数情况下，组合物中优选包括等张剂，例如糖类、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过组合物中包括延迟吸收的药剂(例如甲-硬脂酸铝和明胶)促使可注射组合物的延长吸收。通过将所需量(或剂量)的VSV载体并入按要求具有一种上文所列举的成分或成分组合的适当溶剂中、随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活件化合物并入含有基础分散介质和来自上文所列举的那些中的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，产生活性成分的粉末加上任何其它来自其预先无菌过滤的溶液屮的所需成分。对于通过吸入投药来说，以气溶胶喷雾的形式从含有合适推进剂(例如，诸如二氧化碳的气体，或雾化器)的压力容器或分配器传递化合物。全身性投药也可通过粘膜或透皮方式进行。对于粘膜或透皮投药来说，将适合于待渗透的障壁的渗透剂用于调配物中。所述渗透剂通常为此项技术中所已知，且对于粘膜投药来说，包括(例如)清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍牛物。通过使用鼻用喷雾器或栓剂来完成粘膜投药。对于直肠传递来说，也以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，诸如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备化合物。在某些实施例中，有利的是以剂量单位形式调配口服或非经肠组合物以便于剂量的投药和均-"性。如下文所使用，剂量单位形式指的是适合作为用于待治疗个体的单剂量的物理离散单位；各单位含有预定量的活性化合物，其计划联合所需医药载剂产生所需治疗性效应。本文所述的剂量单位形式的规格是由活性化合物的独特特征和待达成的特定治疗性效应以及化合所述活性化合物以用于个体治疗的技术中固有的局限性决定且直接取决于所述条件。V.实例下列实例是使用标准技术进行，所述标准技术为所属领域的技术人员所熟知且为常规的，除了另外详细描述之处。下列实例是提供用于说明性目的，且不应以任何方式解释为限制本文所述的组合物和方法的范围。实例1和2涉及所示范的所有三种VSV构筑体。实例3-9具体涉及构筑体VSVINN4CT9-gagl。实例10-11具体涉及构筑体VSV1NN4CT,-gagl。实例12具体涉及构筑体VSVNjN4CT,-gagl。下列实例中纯化的重组VSV(印第安纳血清型；rVSV1N)包含VSV基肉组的第位置处的HIVgag基因(gagl)，和改组到VSV基因组的第四位置处的N基因(N4)。在一种构筑体中，VSV具有有截断胞质尾("CT9")的G基因，其中这种构筑体称为"VSV^N4CT9-gagl"。在另一种构筑体中，VSV具有有截断胞质尾("CT,")的G基因，其中这种构筑体称为"VSVwN4CTVgagl"。在其它实例中，下列实例中纯化的重组VSV(新泽西血清型；rVSVNj)包含VSV基冈组的第-位置处的HlVg。g基丙(gagl)，改组到VSV基因组的第四位置处的N基因(N4)，和具有截断胞质尾("CT,")的G基因，其中这种构筑体称为"VSVNjN4CTVgagl"。这些构筑体和突变在以引用的方式并入本文中的国际专利公开案第WO2005/098009号中有详细定义。然而，本文所述的新颖纯化方法决不限于特定rVSV构筑体或血清型(例如，印第安纳、新泽西等)，且因而，这些纯化方法包括纯化包含野生型基因组序列、减毒基因组序列、"外来"核酸序列或其任何组合的VSV构筑体(例如参见用于综述所述VSV构筑体的上文ni部分)。此外，制造"重组"RNA病毒的方法众所周知且在此项技术中称为"拯救"或"反向遗传学"方法。用于重组VSV的示范性拯救方法在卜.文III部分中有描述。下列实例描述从维拉细胞纯化rVSV(如用VSV1NN4CTVgagl、VSVINN4CT,-gagl或VSVwN4CT,-gagl构筑体作示范)。然而，本文所陈述的VSV纯化方法同样适从伃何合适的哺乳动物细胞培养物纯化VSV,所述细胞培养物包括(但不限于)人类胚肾(HEK)细胞(例如HEK293细胞)、中同仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。实例l:蛋白质、DNA和VSV效能测定利用下列测定评估下文实例2-12中所述的纯化方法。总蛋白质浓度。使用二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)测定(伯乐公司(Bio-RadLaboratoriesInc.);加利福尼亚州赫库里斯(Hercules,CA))以牛血清A蛋闩(bovineserumalbumin,BSA)作为蛋白质标准物来测定总蛋白质浓度。SDS-PAGE和西方印迹法分析。对于蛋白质分离和检测来说，将VSV样品与Tri-甘氨酸样品缓冲液以1:1(对于VSVINN4CTVgagl构筑体来说)或3:1(对于VSVINN4CTVgagl构筑体来说)比率混合，在IO(TC下沸腾十分钟，并且通过4-20%Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)解析，随后用银染(美国和光公口j(WakoChemicalsUSA，Inc.):弗吉尼亚州里士满(Richmond,VA))和胶态克玛西(Coomassie)蓝染(英杰公司(InvitrogenCorp.);加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))进行双重染色。双重染色的敏感性使得可能容易检测VSV样品中的高分子量杂质。凝胶电泳后，将蛋白质用电泳方法转移到硝化纤维膜(安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciencesCorp.);新泽西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))上。在含有3%BSA的Tri-缓冲生理食盐水(Tri-bufferedsaline,TBS)中阻断一小时后，将所述膜培养于抗体溶液(于具有0.05%吐温-20(Tween-20)的TBS(TTBS)中的1%BSA，其含有从BHK细胞产生的兔子抗-VSV多株抗体，1:1000v/v)屮，且用与辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP，1:1000(v/v))结合的山羊抗-兔子抗体(伯乐公司(Bio-RadLaboratoriesInc.);加利福尼亚州赫库里斯(Hercules,CA))作为探针。用TTBS禾UTBS洗涤后，添加HRP显色剂(伯乐公司(Bio-RadLaboratoriesInc.);加利福尼亚州赫库里斯(Hercules,CA))以用于检测，且用蒸馏水中止反应。通过安莱影像(Alphalmager)成像系统(安莱公司(AlphaInnotechCorp.);加利福尼亚州旧金山(SanLeandro，CA))用AlphaEaseFC⑧软件捕捉染色的凝胶和显影的膜。尺寸排阻髙效液相色谱法(Size-ExclusionHighPerformanceLiquidChromatography,SE-HPLC)。发展尺寸排阻-HPLC方案以用于使VSV与杂质蛋白质快速分离，从而允许VSV纯化方法的定性分析。因此，将"加工中"VSV样品(100pL)和纯化的整体浓縮物VSV(100pL)装载到分析型尺寸排阻管柱(TSK-GelPW管柱G6000PWXL，粒径17p，孔径1000人)(藤昌生物科学公司(ToshoBiosciencesLLC.);宾夕法尼亚州蒙格马利(Montgomeryville，PA))上，用PBS缓冲液(无Ca2+或Mg2+)平衡且在每分钟1mL的流动速率下进行。用受化学站(ChemStation)软件控制的安捷伦1100(Agilent1100)溶剂传递系统(安捷伦科技公司(AgilentTechnologiesInc.);加利福尼亚州帕洛阿尔托(PaloAlto，CA))给所述系统提供动力。通过光电二极管测定检测器收集紫外(UV)光谱且通过监测215nm下的UV吸收来获得色谱图。VSV效能测定。通过两种不同方法，传统空斑测定和免疫荧光'卒:斑测定来量化VSV效能。对于传统空斑测定来说，将DMEM+10%FBS中的维拉细胞以1乂106个细胞/孔的浓度(2mL细胞培养物/L)接种于6孔培养盘上且在37'C下培养隔夜。第二天检査细胞以确保形成融合牟.层细胞。将未知效价的病毒样品以及阳性和阴性对照组在DMEM+10ml/L丙酮酸钠+0.5ml/L庆大霉素(Gentamicin)中以1:10连续稀释到预期效价范围。阳性对照组足已知效价的VSV标准物。阴性对照组(或'+:A)仅含有培养基。从6孔培养盘中吸出细胞培养基，接着将稀释的病毒(0.5ml病毒溶液/孔)添加到所述孔中，重复实验一次。使病毒在室温下吸附十五分钟，接着在32'C下培养三十分钟。每五到十分钟用手摇动所述培养盘以保持细胞单层湿润。将琼脂糖(5CTC)和DMEM(37°C，10ml/L丙酮酸钠和0.5ml/L庆大霉素)以1:4比率组合以形成琼脂覆层培养基。从培芥盘中吸出病毒，且使用中继器吸管每孔添加3ml覆层。将经覆盖的培养盘在室温下在通风橱下冷却，接着转移到32'C培养72小时或直到+:斑明显可见(直径约1mm或更人)。通过将培养盘举高到光源处来对空斑计数。使用所得空斑计数测定各样品的效价且用每毫升空斑形成单位(plaqueformingunits,PFU)表示。通过用VSV感染维拉细胞争层(在48孔培养盘中)来执行第二种测定(免疫荧光空斑测定)。24到36小时后，将维拉细胞同定且先用抵抗VSVw或VSVNj(取决于所用的构筑体)的单株抗体作为探针，且接着用结合于荧光染料的二次抗体作为探针。使用荧光显微术量化感染性粒子以检测维拉细胞单层中的荧光焦点。计算荧光焦点且将样品的效价表示为每毫升感染单位(infectiousunit,IU)或空斑形成单位(PFU)。残余DNA测定。测试宿主细胞DNA且使用皮可林定量-IT(PicoGreenQuant-iT)DNA微测定试剂盒(英杰公司(InvitrogenCorp.):加利福尼业州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))量化。所述微测定足根据制造商的说明书使用XDNA作为标准物来执行。实例2:在维拉细胞培养物中产生VSV在IO升生物反应器中使用维拉细胞(非洲猴肾细胞)微载体培养物产生VSV实验组。所用的维拉细胞是从cGMP主细胞库(MasterCellBank)获得。使维拉细胞以7.5公克干珠粒/升的密度在(赛托蹲TM)CytodeXI微载体(安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciencesCorp.);新泽西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))上生长。生物反应器培养物的工作体积为5.5到6.5升。对于接种来说，将维拉细胞与(赛托蹲'fM)CytodexTMi微载体以约2升的总体积组合。培养物的目标接种密度为5><105细胞/毫升。在这縮小的体积下执行2小时间歇搅拌循环以促进细胞附着于微载体上。将培养物在40rpm下搅拌5分钟，接着使其在0rpm下静置20分钟，历时四个完整循环。在间歇搅拌后对培养物取样，且如果附着是令人满意的，那么将病毒产生无血清培养基(VirusProductionSerum-FreeMedium,VP-SFM)添加到培养物中，直到5.5升或6.5升工作体积。使细胞在37。C和40rpm下生长到2-4乂106个细胞/毫升。以50立方厘米/分钟不断地给覆层供应空气。按需要以50立方厘米/分钟给覆层供应二氧化碳和氧气。2培养物的需氧量超过覆层所提供的需氧量时，通过烧结喷雾器以6立力—厘米/分钟的初始速率将氧气添加到培养物中。当需氧量增加时手动增加所述速率。使用二氧化碳(酸性)和7.5%重量/体积碳酸氢钠溶液(碱性)来控制pH值，使用pH7.30的培养物设定值。从经过约48小时培养时间开始，培养物每天经受用一半培养物体积的新鲜培养基灌注。在32'C禾B0.01的病毒感染剂量(MOI)下进行用rVSV感染维拉细胞。为促进病毒吸附于细胞上，在将病毒添加到生物反应器培养物屮后立即执行-小吋间歇搅拌循环。将培养物在40rpm下搅拌六分钟，接着使其在Orpm下静置二十四分钟，历时两个完整循环。一小时间歇投拌后，在40rpm下以分批模式进行感染的剩余部分。毎6-16小时对受感染的培养物取样以观察细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)，对细胞计数，且收集病毒上清液样品以用于生长动力学测定。对于VSVINN4CT9-gagl来说在感染后约44小时时，对于VSVINN4CT,-gagl来说在感染后约48小时时，且对于VSVwN4CT,-gagl来说在感染后约60小时时，通过使微载体静置且收集培养液上清液来收获细胞培养物。对于后一构筑体来说，将来自两个生物反应器的细胞培养液组合。实例3:VSV纯化方法VSVINN4CT9-gagl的VSV细胞培养液的初次澄清从生物反应器收获细胞培养物后，在称为"产物回收"的过程中移除细胞/细胞碎片和其它微粒杂质。因为VSV是从维拉细胞分泌到培养液中，所以在澄清的培养液中回收VSV。因此，通过深度过滤或低速离心使VSV细胞培养液上清液(例如，来自10L生物反应器组的约4.0-4,5L)澄清。通过深度过滤澄清是在室温下执行且在滤液中回收VSV。测试下列深度过滤模块沃特曼聚盖HD模块(沃特曼公司)；新泽西州弗伦翰公园(FlorhamPark，NJ))、赛多利斯赛多清P模块(赛多利斯公司(SartoriusCorp.);纽约埃奇伍德(Edgewood，NY))、密理博密理组HC模块(密理博公司(Millipore);马萨诸塞州比尔里卡(Billerica，MA))和CUNO05/60HP(坤诺公司(CUNOInc)，3M公司，康涅狄格州梅里登(Meriden,CT))。给深度过滤器装载滤液直到过滤器饱和(约100-500ml滤液)。通过浊度计测定深度过滤模块的澄清效率，而通过病毒空斑测定来评估病毒回收率。下表1总结不同深度过滤器的性能。可使用沃特曼聚盖HD75达成高病毒回收率。然而，在大规模生产中，观察到低浊度去除效率和低过滤能力。来自不同供应商的其它过滤器可基于其病毒产物回收率的评估来选择用于澄清过稈。表l.不同深度过滤器的细胞培养物澄清性能<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>77.0%浊度1=滤液或上清液浊度NTU实例4:VSV纯化方法VSV细胞培养液的二次澄清上文实例3中所述的初次澄清后，将上清液(或滤液)进一步加工(二次澄清)以降低浊度水平。评估若干种无菌微滤过滤器(0.2prn到0.25pm)(表3)，其包括密理博密勒-GV过滤装置(密理博公司马萨诸塞州比尔里卡)、密理博密勒-GP过滤装置、颇尔梭伯过滤装置(颇尔公司纽约东山)、赛多利斯赛多朗过滤装置(赛多利斯公司；纽约埃奇伍德)和赛多利斯赛多博2过滤装置。最优过滤器应具有有限(或无)VSV结合能力，仍移除尽可能多的微粒污染。使用来自预接种产生的VSV作为所选微滤过滤器的进料(起始物质)，所述进料搀有1X磷酸谷氨酸蔗糖(sucrosephosphateglutamate，SPG)。按照供应商提供的方案过滤相同进料。因为澄清的细胞培养物质的量是有限的，所以使用注射器或盘式过滤器代替大型过滤器。如表3中所示，用颇尔梭伯和赛多利斯赛多朗M无菌过滤器达成最高VSV效价回收率。表3.二次澄清-过滤器筛选<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>回收率*:将1XSPG溶液添加到进料溶液中。SPG是磷酸谷氨酸蔗糖。使用赛多利斯赛多朗过滤装置进一步评估VSV的二次澄清，其结果总结于下表4中。表4.使用赛多利斯赛多朗过滤器的二次澄清<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>上清液浊度1=NTU0.62*:低滤液浊度由低进料浊度引起NA=不适用；SPG是磷酸谷氨酸蔗糖表4中的数据显示在可接受的回收率程度下进一步降低实验2和实验3的溶液浊度。在这些实验中还确定，将1XSPG添加到进料溶液中(即，实验2:85.9%效价回收率和实验3:110%效价回收率)相对于未添加SPG的实验1(65.8%效价回收率)显著改善VSV产物回收的产率。实例5:VSV纯化方法柱色谱法实例4中所述的二次澄清步骤后，使用若干种色谱树脂测试/筛选VSV滤液的纯化。因为VSV粒子的尺寸相对于污染物蛋白质较大，所以仅评估具有大孔径的树脂，其包括优诺史飞(UNOsphereTM)Q阴离子交换树脂(伯乐公司(Bio-RadLaboratoriesInc.))、优诺史飞S阳离子交换树脂(伯乐公司)、CHT陶瓷羟磷灰石I型树脂(伯乐公司)、CFT陶瓷氟磷灰石I型树脂(伯乐公司)和CSTI混合型树脂(通用电气医疗公司(GEHealthcare))。为作比较，也评估两个亲和树脂，麦卓斯赛李方硫酸盐树脂(密理博(Millipore))和肝素琼脂糖凝胶树脂(通用电气医疗公司(GEHealthcare))。所述实验是在室温下以分批方式执行。收集来自不同洗涤和洗脱条件的样品且通过SDS-PAGE和空斑测定来测定。在用优诺史飞Q阴离子交换和优诺史飞S阳离子交换树脂的初始实验中观察到，VSV仅在中性pH值下与优诺史飞Q阴离子交换树脂结合，表示VSV在中性pH值卜带负电。在伯乐优诺史飞O阴离子交换树脂上评估VSV纯化。将澄清的VSV装载到填满优诺史飞Q树脂的管柱上。在管柱上在VSV产物与杂质蛋白质之问不存在可区别的分离，并且大部分病毒仍然与管柱结合，甚至在用于10mM磷酸钠缓冲液中的2MNaCl洗脱后也如此(数据未展示)。在伯乐陶瓷羟磷灰石I型(CHTI)树脂上评估VSV纯化VSV有效吸附于羟磷灰石管柱上。通过SDS-PAGE观察到VSV与污染物蛋白质的-'些分离(数据未展示)，但大部分VSV仍结合于管柱上，甚至在用0.8M磷酸钠(pH6.88)洗脱后也如此，其中结合的VSV最后在1MNaOH清洗步骤期间从管柱上洗脱下来。在另一实验中，使用0.9M磷酸钾缓冲液作为洗脱缓冲液。达成VSV与杂质蛋白质之间的少量分离(数据未展示)。大部分VSV仍与管柱结合并且需要1.0MNaOH来从管柱上洗脱下来。用陶瓷氟磷灰石(CFT)I型树脂和CSTI树脂观察到类似结果(即，弱VSV/污染物蛋白质分离和强VSV与树脂的结合)。在麦卓斯赛李方硫酸盐亲和树脂上评估VSV纯化。将澄清的VSV进料溶液以3毫升/分钟的流动速率装载到预平衡(1.47mM磷酸钾、8.06niM磷酸钠、140mMNaCl，pH7.0)的赛李方硫酸盐管柱(容器体积(CV)=2ml)上。用10CV的平衡缓冲液洗涤所述管柱，所述缓冲液是磷酸盐缓冲生理食盐水(1.47mM磷酸钾、8.06mM磷酸钠、140mMNaCl，pH7.0)。将流过物和洗涤物混合。接着用30CV线性梯度到10mM磷酸钠、1.5MNaCl(pH7.0)洗脱吸附的材料。SDS-PAGE分析显示在洗脱期间杂质蛋白质与病毒之间的分离并不有效且在所有管柱洗脱份中观察到VSV(数据未展示)。大量VSV还残留在管柱上。总VSV产物回收率(即，来自所有收集的洗脱份；F3-F25)仅为45.2%(表5)。ffl肝素琼脂糖凝胶树脂观察到类似结果(即，低VSV回收率)。表5.在麦卓斯赛李方硫酸盐管柱上的VSV纯化<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>FT&W=流过和洗涤混合物F3-F25是洗脱份3-25。实例6:VSV纯化方法阴离子交换膜吸附剂如上文实例5中所述，当用优诺史飞Q树脂、优诺史飞S树脂、CHTI树脂、CFTI树脂、CSTI树脂、赛李方树脂或肝素琼脂糖凝胶树脂纯化来自二次澄清步骤(即，0.2pm赛多朗过滤器)的滤液时，VSV回收率相对低。因此，使用两种阴离子交换膜吸附剂进一步评佔来自实例4的VSV滤液的纯化；赛多结Q膜吸附剂(赛多利斯公司；纽约埃奇伍德)和妙丁Q膜吸附剂(颇尔公司)；纽约东山)。在赛多结O膜吸附剂上的VSV纯化用于膜吸附剂纯化的VSV进料(起始物质)是来自切向流动过滤(TFF)分离(使用具有750kDa的截留分子量的TFF膜)的保留物。接着将来自TFF分离的VSV保留物(其包含VSV和杂质/污染物蛋白质和DNA)储存在4'C或-70'C下。用储存在4'C下的VSV保留物执行初始赛多结Q膜吸附剂研究，其中使用20mMHEPES(pH7.1)作为平衡缓冲液且保留物吸附于赛多结Q膜吸附剂(2.1ml膜体积)上。用20mMHEPES(pH7.1)禾卩1.0MNaCl的洗脱缓冲液有效洗脱杂质蛋白质(数据未展示)。然而，在任一洗脱份中未回收到VSV效价。将缓冲液从HEPES改为磷酸钠缓冲液，但观察到类似结果(即，所收集的洗脱份中无VSV效价)，甚至在磷酸盐洗脱缓冲液中的高(1.5M)NaCl浓度下也如此。相反，当使用储存在-70'C下的VSV保留物作为起始物质且吸附于赛多结Q膜吸附剂(用20mMHEPESpH7.1平衡)上时，在洗脱份中观察到VSV(洗脱缓冲液为20mMHEPES和l.OMNaCl),其中根据BCA结果在流过和洗涤混合物中观察到74.2%的蛋白质杂质(数据未展示)。对于总蛋白质的质量平衡分析在下表6中展示。对于-70'CVSV起始物质使用线性洗脱梯度到30%缓冲液B，在色谱图中观察到两个主峰(数据未展示)。缓冲液A(平衡缓冲液)为10mM磷酸钠(pH7.0)和0.3MNaCl。缓冲液B(洗脱缓冲液)为10mM磷酸钠(pH7.0)、2.0MNaCl和10mM蔗糖，其中30%B约为0.81MNaCl。第一峰为具有相对高纯度的VSV(洗脱份4-10)。第.一.峰为宿主DNA污染物(洗脱份11-20)。皮可林测定结果(数据未展示)指出，用赛多结Q膜吸附剂移除97.3%的残余宿主DNA。因此，这些数据指出赛多结Q膜吸附剂提供从VSV产物移除宿主DNA污染物的有效方法。然而，来自VSV效价测定的结果(数据未展示)指出来自赛多结Q纯化方法的VSV回收率以病毒效价计小于30%。使用妙丁Q膜吸附剂在相同起始物质情况下观察到较高VSV回收率。表6:对于赛多结Q膜吸附剂的总蛋白质质量平衡<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>FT&W=流过和洗涤混合物F3-F40为洗脱份3-40在妙丁O膜吸附剂上的VSV纯化也以VSV纯化方式研究妙丁Q膜吸附剂。优化用于妙丁Q吸附剂的操作条件且在下文描述。蔗糖改善从妙丁Q膜洗脱的VSV的回收产率。当优化用于妙丁Q的条件时的初始观察结果是色谱缓冲液中包括蔗糖的重要性。举例来说，用调配有蔗糖(图2A和2B)和无蔗糖(图3A和3B)的缓冲液执行并行纯化实验。使用下列色谱缓冲液缓冲液A(平衡缓冲液)是10mM磷酸钠(pH7.0)和300mMNaCl。缓冲液B(洗脱缓冲液)是10mM磷酸钠(pH7.0)、1MNaCl、有和无(即，+/-2%蔗糖)。在两个实验(即，+/-2%蔗糖)中，获得高纯度VSV产物。空斑测定(数据未展示)指出当缓冲液中包括蔗糖时，VSV回收率显著较高(32.8%对比19.0%)。缓冲液pH值和VSV与妙丁Q膜的结合。评估三种不同缓冲液pH值范围(pH6.5、7.0和7.5)以确定用于VSV与妙丁Q膜结合的最优缓冲液pH值。在这些实验中，澄清后将改良新鲜细胞培养物装载到用lOmM磷酸钠缓冲液(pH6.5)、10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)或10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)(各缓冲液还包含300mMNaCl和2%蔗糖)平衡的妙丁Q膜上。通过步骤洗脱(洗脱缓冲液10mM磷酸钠(pH6.5、7.0或7.5)、720mMNaCl和2%蔗糖)以每分钟3.5ml(10CV/min)的流动速率从膜洗脱VSV。从妙丁Q洗脱的VSV的纯度(通过SDS-PAGE和西方印迹法测定；数据未展示)对于所测试的缓冲液pH值的每一者是同等的。然而，在pH6.5下，在色谱过程期问大量VSV分散于流过、洗涤和洗脱步骤中，且因而，在这pH值下在洗脱混合物中观察到较低VSV效价回收率(参见表7)。表7.不同结合pH值条件下的VSV方法回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>离子强度和VSV与妙丁Q膜的结合。在VSV吸附于妙丁Q膜吋测试10mM磷酸钠结合(平衡)缓冲液中的两种不同NaCl浓度(0.15MNaCl和0.3MNaCl)。在0.3MNaCl下观察到VSV与杂质蛋白质之间的较好分离。举例来说，^磷酸钠结合缓冲液中使用0.3MNaCl时，在流过混合物中移除高分子量污染物，其中VSV仍与膜结合(数据未展示)。离子强度和VSV从妙丁Q膜的洗脱。通过线性梯度洗脱测定洗脱缓冲液(缓冲液B)离子强度(即，洗脱缓冲液中的NaCl浓度)，其中洗脱缓冲液(缓冲液B)的浓度在30CV下以3.5毫升/分钟的流动速率从0%增加到60%。平衡缓冲液(缓冲液A)是10mM磷酸钠pH7.1、300mMNaCl且洗脱缓冲液(缓冲液B)￡10mM磷酸钠pH值7.1、2MNaCl、10mM蔗糖。从色谱图(数据未展示)可看出，需要0.6M的NaCl浓度来从妙丁Q膜吸附剂洗脱73.39bVSV。线性梯度洗脱对比单步骤洗脱。从线性梯度洗脱(上文所述)和"单步骤"洗脱策略(数据未展示)获得高质量VSV产物。单步骤洗脱过程包含平衡缓冲液(缓冲液A;例如，lOmM磷酸钠(pH7.1)、300mMNaCl)和洗脱缓冲液(缓冲液B;例如，10mM磷酸钠(pH7.1)、2MNaCl、10mM蔗糖)。与线性梯度洗脱相反，单步骤洗脱过程通过即刻添加特定最终盐浓度的缓冲液B(例如，即刻添加最终NaCl浓度为0.6M的缓冲液B)来从膜吸附剂洗脱VSV。单步骤洗脱过程移除大于99%的杂质蛋白质(BCA测定；数据未展示)，其中在洗脱份中回收70-95%的VSV(+:斑测定；数据未展不)。因此，木文将使用单步骤洗脱过程，因为使用这种简单单步骤洗脱策略获得高VSV效价。操作流动速率。研究两种不同流动速率，即，10容器体积(CV)/分钟和20CV/分钟。在任一流动速率下在纯化方法性能方面未观察到变化。本卓酶(Benzonase)处理。本卓酶核酸酶是遗传工程化核酸内切酶。其降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和圆形)，而不具有蛋白质分解活性。其在各种条件下有效，具有高比活性。因此，本卓酶核酸酶对于从重组产物移除核酸是理想的，能够符合关于核酸污染的FDA准则。本文观察到，本卓酶核酸酶显著降低VSV纯化方法中的DNA含量和最终VSV纯化的整体浓縮物。然而，在于妙丁Q膜吸附剂上纯化之前添加本卓酶核酸酶导致病毒效价降低(数据未展示)。相反，膜色谱纯化步骤后的本卓酶核酸酶处理不具有相同效应(即，未观察到效价降低)。然而，肉为本文所述的完整VSV纯化方法(例如参见图1)移除大于99%的细胞培养物污染物，所以在无本卓酶核酸酶处理的情况下最终VSV纯化的整体浓缩物中的DNA含量低于规格(例如，WHO规格<10毫微克/剂量)。因此，本卓酶核酸酶处理不必用于VSV纯化方法中，所述方法与传统病毒产物/病毒疫苗纯化方法(其所需本卓酶核酸酶处理)相比是显著改良。妙丁Q结合能力。通过VSV突破使用小体积(0.35ml体积)妙丁Q膜吸附剂(即，妙丁Q币状物)测定妙丁Q膜吸附剂的结合能力。当装载和纯化妙丁Q币状物上的改良细胞培养液时，最初观察到由于UV吸收杂质的流过而不能通过UV吸收来测量VSV突破。因此，在本实例中，收集VSV流过洗脱份且通过SDS-PAGE和VSV效价测定来检测VSV。妙丁Q平衡缓冲液是10mMHEPESpH7.5、0.3mMNaCl和2%蔗糖。令人惊讶的是，未达到常规色谱1%突破(参见下表8)，甚至在将400ml细胞培养液装载到妙丁Q币状物上后(VSV培养液效价为6.9X106/ml)后也如此。然而，如表8中所示，当给妙丁Q币状物装载400ml培养液样品时，观察到流过物中的较高VSV效价。另外，当装载体积达到400ml时，币状物中的分压增加到1.8巴(Bar)。因此，从这个实验可推断，每0.35ml妙丁Q膜吸附剂350ml改良培养液为过滤器装载能力，其相当于500ml细胞培养物/ml膜吸附剂。或者，妙丁Q结合能力也可描述为6.9x109pfu/ml膜。在三个稠度组中，实际装载能力(以病毒效价计)略微高于这个结合能力，其并不影响方法性能。因此，这个数据指出所测定的结合能力是保守性能力数，且因而，可容易用于人规模制造生产。表8.妙丁Q装载能力研究装载体积1(ml)流过物中的VSV效价2(pfu/ml)0-200(FT1)ND*200-300(FT2)6.80X103300-350(FT3)8.80X103350-400(FT4)1.30X104ND*=未测定装载体积'是以培养物体积计VSV效价2:VSV进料效价是6.9E+06/mL妙丁Q过滤膜体积是0.35mlFT1-FT4分别是流过物1-4妙丁Q膜吸附剂结论。用妙丁Q膜吸附剂达成具有"冋收率的"质量VSV产物。与"传统"色谱过程相比，妙丁Q纯化方法(除了是简单和冇效方法)具有若干优点。举例来说，所述方法产生具有比通过庶糖梯度超速离心纯化高的质量的VSV产物(例如参见图5A和5B)。此外，(a)妙丁Q膜吸附剂的高结合能力意味着较小方法设备和较低生产成本、(b)相对于所测试的其它色谱树脂较高的流动速率导致生产量和生产率增加和(c)一次性妙丁Q膜吸附剂装置消除清洗验证和使用期限验证的必要性。下文总结所发展和上文所述的妙丁Q操作条件(3)装载能力=每毫升妙丁Q膜吸附剂0.5L细胞培养物、(b)流动速率=每分钟20容器体积(CV)、(c)VSV结合pH值二pH7.5土0.1pH值单位、(d)VSV结合离子强度=0.3土0.2M盐；(e)VSV洗脱=以15CV的步进梯度和(f)VSV洗脱离子强度二0.7M盐。实例7:VSV纯化方法切向流动过滤、抛光、缓冲液交换VSV浓度和缓冲液交换是使用切向流动过滤(TFF)超滤/透滤(UF/DF)系统执行。来自妙丁Q膜吸附剂的VSV洗脱混合物是在具有高(0.7MNaCl)盐浓度的10mMHEPES缓冲液中且仍然具有微量杂质。因此，UF/DF步骤是移除残余杂质所必需的且在适当产物调配物缓冲液中产生最终VSV产物。将来自五个妙丁Q实验组的洗脱混合物组合且用于这个实验。利用截留分子量为750kDa的16cm2屮空TFF膜滤筒(通用电气医疗生物科学公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp.);新泽西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))。先将混合溶液浓縮到10ml。在磷酸盐缓冲生理食盐水(lOmM磷酸钾缓冲液(PBS)(pH7.1)和138mMNaCl)中执行五次(5次)缓冲液交换。对加工中样品的SDS-PAGE分析指出纯化的VSV仅存在于保留物和冲洗物中，且通过银染色或西方印迹法分析未检测到渗透物中的VSV损失(数据未展示)。SDS-PAGE数据证明VSV方法回收率是可接受的且在每次缓冲液交换后逐渐移除杂质(数据未展示)。为完全移除残余杂质，需要总共五到六次缓冲液交换。UF/DF操作条件优化。研究缓冲液组合物对TFFUF/DF性能的影响。使用相同妙—J_Q洗脱混合物作为所有实验的进料(表9)。最初二个实验是在16cr^中空纤维TFF膜(通用电气医疗生物科学公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp.))上执行，而最后-一组是用420cm2TFF膜(通用电气医疗生物科学公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp))完成。对于所有实验来说，产物质量类似(根据SDS-PAGE分析和SE-HPLC)。表9.TFF缓冲液组合物实验<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>与所用的缓冲液无关，在透滤渗透物中未观察到VSV产物(根据SDS-PAGE/银染色；数据未展示)。然而，总蛋白质和DNA测定指出在最初三透滤体积中移除装载的约34-41%总蛋白质和装载的33-40%DNA。关于缓冲液交换，五透滤体积(diafiltrationvolume,DV)足以使渗透传导性降低到令人满意的程度。因此，下列TFFUF/DF操作条件发展如下(a)TFF膜滤筒中空纤维TFF滤筒(750kDa)，(b)TFF膜容量95L细胞培养物/平方米，(c)操作压力pl=3-4psig;p2=l-2psig;TMP=1.5-2.5psig，(d)操作温度室温，(e)交叉流动速率700LMH，(f)渗透流量>30LMH，禾口(g)5次浓縮和6次透滤到PBS+4呢蔗糖(lOmM磷酸钾、138mMNaCl，pH7.2)中；其中pl是入口压力，p2是出口压力，TMP是跨膜压力和LMH是升/平方米小时。实例8:VSV纯化方法最终过滤VSV纯化方法中的最后一步是上文所述的TFF纯化物质的最终过滤。使用0.2(0.45/0.2pm)赛多利斯赛多朗TM过滤装置(赛多利斯公司(赛多利斯Corp.);纽约埃奇伍德(Edgewood，NY))以每分钟100ml的流动速率移除可能的生物负荷而使VSV产物损失最小。缓冲液是lOmM磷酸钾(pH7.1-7.3)、138mMNaCl和7.5%蔗糖。实例9:VSVINN4CTVgagl构筑体的VSV按比例扩大纯化执行四个4.5L按比例扩大组(即，细胞培养物体积)。这些按比例扩大组的概要在下文表10和表11以及图6中展示。执行包括SDS-PAGE(数据未展不)、总蛋白质(表11)、病毒效价(表10和图6)和SE-HPLC(数据未展示)的测定。使用图1中所示的方法，在按比例扩大组的每一者中达成一致方法性能(即，VSV产物质量)和杂质移除。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ND=未测定vsv按比例扩大纯化方法的分析发展本文所述的新颖VSV纯化方法(例如参见图1)的目标是产生高纯度vsv以及高回收率的纯化的VSV产物。以下分析根据四个4.5L细胞培养物按比例扩大组来描述VSV纯化和稳定性。SDS-PAGE分析和杂质蛋白质移除。纯化方法的重要方面是从VSV产物消除(或移除)细胞培养物杂质蛋白质。如上文实例1中所陈述，本文所示范的rVSV^构筑体是rVSVINN4CT9-gagl构筑体。VSV产物是通过检测其主要病毒蛋白M(27kDa)、N/P(49kDa)、G(55kDa)和L(250kDa)来监测。在所述VSV蛋白质中，M和N/P蛋白质的表达量比G(CT9)和L蛋白质高，其中L蛋白质含量最低。因此，观察到M和N/P蛋白质在SDS-PAGE凝胶分析屮的条带相对于G和L蛋白质密度更高。在所有实验中，将相同样品体积装入凝胶中(除非另有说明)。此外，利用银/克玛两蓝双重染色代替诸如银染或克玛西染色的单一蛋白质检测方法，从而提供更灵敏的蛋白质检测。对按比例扩大第4组的SDS-PAGE分析(图4A和4B)揭露在低速离心的初次澄清步骤中通过移除细胞碎片移除大多数宿主蛋白质(图4A、4B，条带1和2)。根据BCA分析，移除91.5%的总蛋白质，表示低速离心是有效杂质移除步骤。用lOmMHEPES缓冲液(pH7.5,添加1X磷酸谷氨酸蔗糖(SPG;7.5%蔗糖、10mM磷酸钾、5mM谷氨酸))、0.465MNaCl和2%蔗糖稀释来自离心的上清液(图4A、4B，条带3)，其中由于稀释而观察到较淡染色条带。接着通过0.2)am过滤器抽汲稀释的溶液以移除任何残余微粒污染物(在这个步骤中未移除杂质蛋白质；图4A、4B，条带4)。收集VSV滤液作为妙丁Q步骤的进料并且装载到膜吸附剂上。在妙丁Q膜吸附剂上移除大于99.5%的残余杂质蛋0质(表ll)。通过SDS-PAGE分析观察到杂质蛋白质的移除(图4A、4B,条带4和5)，其中从妙丁Q膜洗脱高质量VSV产物(图4A、4B,条带6)。将洗脱的VSV浓缩且透滤到PBS缓冲液(+7.5%蔗糖)中。在UF/DF纯化步骤中移除大于48%的残余蛋白质杂质(表11)，其中检测到密度极高的VSV蛋白质条带(图4A、4B，条带7)。在UF/DF渗透混合物中仅观察到微量杂质蛋白质(图4A、4B，条带8)。在最终0.2pm过滤前后，没有可检测的关于VSV蛋白质质量或杂质蛋白质概况的变化(图4A、4B，条带9和10)。来自最新发展的方法的VSV纯化的整体浓缩物还证明与通过蔗糖梯度离心的纯化相比高的纯度和低的残余含量。举例来说，来自最新发展的方法的VSV蛋白质(M、N、P、G禾UL)的染色条带(图5A、5B,条带9)比通过蔗糖梯度离心纯化的VSV的染色条带(图5A、5B，条带11)密度更高(杂质蛋白质染色条带密度更小)，表示通过图1中所示的新颖纯化方法达成较高质量VSV产物。在所有四个按比例扩大组中，根据杂质蛋白质概况和VSV蛋白质条带的密度达成类似产物质量(数据未展示)。尺寸排阻-高效液相色谱法(SE.HPLC)分析。发展对VSV的SE-HPLC分析(参见实例！)，其提供将VSV与杂质蛋A质分离且定性地分析VSV纯化方法的简便方法。为保护管柱，仅将澄清的样品注入管柱中。VSV以洗脱峰、7.5分钟的滞留时间从管杵流出(数据未展示)。在VSV峰后污染物/杂质蛋白质峰(其具有较长管柱滞留时间)从管柱洗脱且因此需要从VSV产物消除/移除。在妙丁Q流过物和洗涤物中移除大多数杂质，这证实SDS-PAGE分析的结果。在UF/DF步骤中，移除缓冲液相关杂质且在任一渗透物中未损失VSV(数据未展示)。在最终0.2nm过滤后，VSV产物从SE-HPLC管柱以单一主峰、7.5分钟的滞留时间洗脱，随后为对应于缓冲液空白的两个较小峰(数据未展示)。残余宿主DNA的移除。细胞培养物(宿主细胞)DNA是使用重组技术的纯化方法中的主要污染物之一。VSV纯化的整体浓縮物中的残余DNA含量应低于10毫微克/剂量(10、fu)。四个按比例扩大组的DNA移除概况总结在下表12中，其中在各纯化步骤中达成一致DNA移除。在产物回收步骤(艮卩，通过低速离心的1°澄清，随后通过0.2pm过滤的2。澄清)和妙丁Q膜吸附剂步骤中观察到主要DNA清除。在妙丁Q步骤中移除大于80%的残余DNA且在UF/DF步骤中达成大于60%的DNA清除。在所有四个按比例扩大组中，总DNA移除百分比是99.89±0.03%。此外，残余DNA含量远低于10毫微克/剂量(表13)。表12.宿主DNA移除(％)的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>产物回收率1是低速离心、随后0.2pm过滤的培养液澄清步骤。表13.VSV纯化的整体浓縮物中的DNA含量的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>Gag蛋白质的移除。通过ELISA测定Gag蛋白质浓度，ELISA提供数据以确定VSV产物中的残余Gag含量。纯化方法中的Gag蛋白质的概况总结于下表14中。在二次澄淸步骤(即，0.2)nm过滤)和妙丁Q膜吸附剂步骤中移除大多数Gag蛋白质。如表15中所示，在最终纯化的整体浓縮物中残余Gag蛋白质含量在0.08毫微克/剂量到8.93毫微克/剂量(107pfU)的范围内。表14.残余GAG移除的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>实例10:VSVINN4CTl-gagl构筑体的VSV按比例扩大纯化用于VSVinN4CT,-gagl构筑体的纯化方法发展的最初难题是细胞培养液中的低产物效价(<106pfu/ml)，其导致最终纯化的整体浓縮物中的低产物效价和高DNA污染。然而，如实例9'l，所述的用于VSVINN4CT9-gagl的纯化方法成功地应川于这种VSV构筑体且按比例扩大到IOL规模(以细胞培养物体积计)。已通过这种纯化方法产牛高质量VSV产物。在纯化方法中，初次和二次澄清步骤实质上类似于实例3和4中所述的那些步骤。使用妙丁Q吸附剂的阴离子交换膜吸附步骤优化如下。切向流动过滤使用(快斯坦tm)QuixstandTM或(弗莱坦tm)FlexstancFM系统以及中空纤维膜滤筒(通用电气医疗公司(GEHealthcare);新泽西州皮斯卡塔巿(Piscataway,NJ))进行。在这个研究中还测试截留分子量(MWCO)为750kDa的GE聚醚砜超滤膜。所有膜具有420cm2或1200cm2的标称过滤表面积。膜色谱法实验使用(阿克托tm)AKTATM探测机和(阿克托派莱tm)AKTAPilotTM系统(通用电气医疗公司(GEHealthcare);新泽西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))以及颇尔妙丁Q膜吸附剂(颇尔公司；纽约东山(EastHills,NY))进行。对于VSVnsN4C!Vgagl的首次妙丁Q纯化试验妙丁Q吸附步骤使用与VSV1NN4CT9-gagl纯化方法中所述相同的缓冲液和操作条件执行。总之，先通过离心移除细胞和碎片。添加1:9比率(v/v)的lOx磷酸谷氨酸蔗糖(SPG)和具有10mMHEPES、0.465MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖的2倍稀释液后，通过0.2过滤器抽汲溶液。将滤液装入预平衡的颇尔妙丁Q膜吸附剂中(0.35ml容器体积)，收集流过和洗涤(FT&W)混合物。使用与VSVINN4CT9-gagl方法中所述相同的洗脱条件在洗脱混合物中回收VSV产物。获得高质量病毒产物(数据未展示)。然而，在FT&W混合物中观察到三分之一的病毒产物(表16)，.目.妙丁Q洗脱混合物中的病毒效价由于生物反应器中的低病毒产生效价而极低(VSV^N4CT,-gagl为4.6xl05pfu/ml对比VSVINN4CT9-gagl为〉1.0xl07pfu/ml)。表16.方法分析-首次妙丁Q步骤中的效价回收率方法体积(ml)病毒效价(pfu/ml)病毒效价(pfu)回收率(％)进料2509.90X1042.48XI07腦FT&W3003.20X1049.60X10b38.838<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*BD表示DNA含量低于检测含量由通过空斑测定所测定的病毒效价计算方法回收率。当装载缓冲液pH值在6.6到7.5的范围内，且NaCl浓度为0.28M到0.30M时，如等高线图中所示，达成可接受的方法回收率(数据未展示)。最优装载缓冲液条件为10mMHEPES、2呢蔗糖中的0.29MNaCl，pH7.0。因为优选在进料调节中无pH值调节，所以认为pH7.5可为妙丁Q平衡缓冲液pH值所接受。同时，确定0.60-0.70MNaCl和pH6.75-7.25为妙丁洗脱缓冲液条件。最优洗脱缓冲液条件为10mMHEPES、0.65MNaCl、2%蔗糖，pH7.0。妙丁Q缓冲液条件总结于表19中。在这些发展条件下，洗脱混合物中的DNA污染物降低到可接受的含量(数据未展不)。表19.妙丁Q缓冲液条件<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>其它实验与这些结果一致且证明在某些实施例中0.28M到0.30MNaCl和pH7.2-7.5为优选结合缓冲液条件以确保高产物冋收率，和洗脱混合物中DNA污染物可接受的减少。实例11:用于VSV^N4CTVgagl构筑体的VSV按比例扩大纯化三个小规模的验证组是用相同进料物质、使用上文所发展的妙丁Q条件来完成。平衡缓冲液是10mMHEPES、0.29MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖；而洗脱缓冲液是10mMHEPES、0.65MNaCl(pH7.0)、2%蔗糖。对于所有组保持相同操作条件相同流动速率、相同装载体积和相同洗脱体积。实验结果总结于表20中。根据由效价测定结果计算的产物回收率达成极其一致方法性能。表20.妙丁Q验证组<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>VSV,NN4CTVgagl纯化方法按比例扩大、一致性组和技术转移使用移除微载体后含有VSVwN4CTVgagl的细胞培养液作为整个纯化方法的起始物质。所述方法包含通过低速离心使细胞培养液澄清和回收上清液中的VSV;通过0.45/0.2)am过滤器过滤所述上清液和回收过滤溶液中的VSV;将VSV过滤溶液装载到阴离子交换膜吸附剂上，回收洗脱混合物中的VSV产物；通过切向流动过滤(TFF)使用750kDa截留分子量膜纯化回收的VSV和回收保留物中的VSV，并且最后通过0.2pm过滤器过滤VSV保留物和回收过滤溶液中的VSV。成功地完成三个6L按比例扩大/一致性组(CR)和一个10L组(TTR)。实验条件总结于表21屮。表21.VSVinN4CTl-gagl按比例扩大/一致性组的方法条件<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>1,2:CR#l-3的平均值和STDEV;N/D:未测定。用于VSVwN4CT,-gagl的纯化方法成功产生高质量产物。在一致方法性能下将纯化条件按比例扩大到IOL规模(以细胞培养物体积计)。根据来自空斑测定的VSV效价的总方法产率低于从VSV1NN4CT9-gagl和VSVNjN4CTrgagl所达成的总方法产率。在最终0.2pm过滤中观察到主要效价损失且也可能在妙丁Q步骤中观察到。非特异性结合可解释所述损失，特别是当研究的难题是低效价起始物质时。效价越低，越多部分的病毒将在过滤器中损失。增加细胞培养物的VSV效价是良好的解决方法。用于降低纯化方法中的病毒效价损失的不同缓冲液组分、赋形剂和操作条件和病毒-产物友好缓冲系统的选择是对这种纯化系统的改良，相信这在此项技术的技能范围内而无需过多实验。实例12:用于VSVwN4CTVgagl构筑体的VSV按比例扩大纯化如实例9中所述的用于VSVINN4CT9-gagl的纯化方法成功地应用于这种VSV构筑体且按比例扩大到IOL规模(以细胞培养物体积计)。已通过这种纯化方法产生高质量VSV产物。在纯化方法中，初次和二次澄清步骤实质上类似于实例3和4中所述的那些步骤。使用妙丁Q吸附剂的阴离子交换膜吸附步骤优化如下。切向流动过滤使用(快斯坦TM)QuixstancFM或(弗莱坦TM)FlexstandTM系统以及中空纤维膜滤筒(通用电气医疗公司(GEHealthcare);新泽西州皮斯卡塔巿(Piscataway，NJ))进行。在这个研究中测试截留分子量(MWCO)为750kDa的GE聚醚砜超滤膜。所有膜具有420cm2或1200cm2的标称过滤表面积。膜色谱法实验使用(阿克托TM)AKTATM探测器和(阿克托派莱TM)AKTAPilotTM系统(通用电气医疗公司(GEHealthcare);新泽西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))以及颇尔妙丁Q膜吸附剂(颇尔公司；纽约东山(EastHills,NY))进行。根据SDS-PAGE分析，利用与VSV,NN4CT9-gagl纯化方法屮所述相同的操作条件，对于VSVwN4CT,-gagl的首次妙丁Q纯化试验产生高质量产物。然而，在产物洗脱混合物中检测到高残余DNA含量。使用膜色谱法，发展妙丁Q结合和洗脱条件以达成高纯化倍数和高质量VSV产物。在包括小规模组和按比例扩大/一致性组的随后实验中使用下列操作条件证明高方法性能一致性。纯化方法还成功地转移到用于临床试验材料生产的合同生产机构(contractmanufacturingorganization,CMO)。用于VSV^NACTVgagl的首次妙丁Q纯化妙丁Q步骤使用细胞培养液和与VSVINN4CT9-gagl纯化方法中所述相同的缓冲液和操作条件执行。总之，通过离心移除细胞和碎片。通过添加lx磷酸谷氨酸蔗糖(SPG)和具有10mMHEPES、0.465MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖的2倍稀释液调节后，通过0.2pm过滤器抽汲上清液。将滤液装载到预平衡的妙丁Q膜吸附剂上，收集流过和洗涤混合物。通过使用如VSV|NN4CT9-gagl纯化方法中所述的洗脱缓冲液和操作条件获得VSV产物。还收集来自使用10mMHEPES、1.0MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖再生的混合物。最后，用1.0MNaOH溶液清洗妙丁Q。在实验中观察到高VSV结合能力。然而，在洗脱混合物中回收极少产物(数据未展示)。主要在再生混合物中检测到病毒产物，且根本无法回收一半以上的病毒产物(参见表24)。在洗脱和再生混合物中检测到高DNA污染物含量。用于妙丁Q的结合和洗脱条件进一步优化用于这种新构筑体以增加产物回收率且同时降低残余DNA含量。表24.妙丁Q方法分析-效价回收率和DNA移除<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*1剂量二1.0Xl()7pfu;BD:低于检测限度如先前所述，VSV1NN4CT9-gagl纯化的难题是从最终产物清除残余DNA。使用(默克凯吉艾TM)MerckKGaATMTMAE和颇尔妙丁Q进行进一步条件优化。使用(替默艾依TM)TMAETM树脂的VSV纯化发展使用如表25中所示的全因子实验设计执行在TMAE树脂上的VSV结合缓冲液条件筛选。进料是调节为不同装载缓冲液条件的细胞培养物上清液。使用西方印迹法分析监测流过物中的VSV。表25.用于(替默艾依TM)TMAETM结合条件的全因子设计<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如西方印迹法分析所示(未图示)，当平衡缓冲液中的NaCl浓度达到200mM时，在流过混合物中观察到大量VSV。为获得在TMAE上的合理的VSV结合能力，平衡缓冲液中的NaCl浓度应低于200mM。VSV的结合情况在所测试的pH值条件中未受显著影响。然而，对洗脱混合物中的VSV回收率的分析(通过TMAE洗脱混合物的SE-HPLC峰积分面积佔算(图8A、8B和8C))指出在相同结合NaCl浓度下，在较高pH值条件下(pH7.5对比pH7.0和6.5)达成较高能力。使用TMAE管柱的VSV纯化试验通过在20-24i:下在5000rpm下离心30分钟从含有VSV1NN4CT9-gagl的细胞培养液移除细胞和细胞碎片。在以9比1的比率与10xSPG原料溶液混合后，通过0.45/0.2)tim过滤器抽汲上清液。使用滤液作为TMAE管柱的进料(2ml)，流动速率为4ml/min。用10mMHEPES、0.145MNaCl、2%蔗糖(pH7.4)使所述管柱预平衡。用IO管柱体积(CV)的平衡缓冲液追加管柱后，通过线性梯度到10mMHEPES、1.5MNaCl、2%蔗糖(pH7.5)以30CV将结合的物质从管柱洗脱。收集不同洗脱混合物。表26:从TMAE管柱的VSV洗脱<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>SDS-PAGE凝胶电泳(未图示)允许在洗脱图屮观察到两个主峰。第峰Fl具有低UV254/280比率，表示较"蛋0质/病毒含量。第二峰F2具有"UV254/280比率，表明较高核酸含量。皮可林测定证实洗脱份混合物F1中的DNA含量极低(数据未展示)。因此，这种管柱用于DNA移除。这个峰的效价回收率根据空斑测定是81.4%。然而，注意到高蛋白质杂质含量。使用妙丁Q膜吸附剂的VSV纯化使用如表27中所示的全因子实验设计执行在妙丁Q膜吸附剂上的VSV结合条件筛选。进料是调节为不同装载缓冲液条件的细胞培养物上清液。使用SDS-PAGE分析分析不同妙丁Q洗脱混合物(未图示)。表27.用于妙丁Q结合条件筛选的全因子设计<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>对在妙丁Q吸附剂上的VSV结合条件筛选的SDS-PAGE分析展示分别在不同结合NaCl浓度下的洗脱混合物0.15M、0.20M、0.22M、0.24M、0.26M、0.28M。当平衡缓冲液中的NaCl浓度达到0.26M时，在所有测试的pH值条件下从洗脱混合物移除高分子量蛋白质杂质。洗脱条件筛选用HEPES原料溶液(10mMHEPES、0.415MNaCl、2%蔗糖，pH7.25)将含有VSVINN4CT9-gagl的细胞培养物上清液稀释两倍以达到0.28M的最终NaCl浓度。使用所制备的溶液作为实验的进料。用于这个研究的实验设计总结于表28中。与妙丁QMA结合后，用不同NaCl浓度的洗脱缓冲液洗脱VSV。表28.用于妙丁Q洗脱条件筛选研究的全因子设计<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>方法回收率的等高线图分析(未图示)指出为了得到合理的方法回收率(>55%)，洗脱缓冲液条件应维持在pH=6.5-6.9和NaCl浓度0.55-0.70M。在这些条件下，如对妙丁Q洗脱混合物的SDS-PAGE分析(未图示)'l'所示已产生高质量VSV产物。使用DOE方法的妙丁Q条件优化妙丁Q步骤中的进一步优化导致较好VSV结合和洗脱条件以达成高DNA清除程度和高方法产率。实验设计在表29中展示。根据初始筛选研究和VSVINN4CT9-gagl中的先前经验选择6.5到7.0的装载和洗脱pH值。还从初始筛选研究的结果中选择装载和洗脱缓冲液屮的不同NaCI浓度。所有实验屮的流动速率维持在7.0ml/min，其为20容器体积(CV)/分钟。表29.在妙丁Q吸附剂上的VSV纯化实<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>实验结果根据通过空斑测定所测定的vsv产物效价计算方法产率。结果总结于预测概况(未图示)中。为使方法产率最大，鉴别妙丁Q吸附中的下列缓冲液条件装载缓冲液中的NaCl浓度0.26-0.30M装载缓冲液pH值7.0-7.5洗脱缓冲液中的NaCl浓度0.55-0.65洗脱缓冲液pH值6.5-7.0在不同结合条件下妙丁Q洗脱混合物中的残余DNA含量在等高线图中报道(未图示)。根据DNA清除结果进一步改进妙丁Q缓冲液条件装载缓冲液中的NaCl浓度0.27-0.29M装载缓冲液pH值7.0-7.5洗脱缓冲液中的NaCl浓度0.55-0.65洗脱缓冲液pH值6.5-7.0通过SDS-PAGE(未图示)的密度测定法估算妙丁Q洗脱混合物中的VSV产物纯度。分析不同结合缓冲液条件下和不同洗脱缓冲液条件下的产物纯度。考虑密度测定法分析的变化，对于所有情况来说不存在VSV产物纯度的显著差异。在所有实验'l'产生高质量VSV产物。妙丁Q操作范围通过在如表30中所示的发展条件内和发展条件外用更多操作点执行实验来定义妙丁Q膜色谱法的结合和洗脱缓冲液条件。平衡/洗脱缓冲液是10mMHEPES、2%蔗糖以及各种量的NaCl和不同pH值条件。对于所有组保持相同操作条件相同流动速率、相同装载体积和相同洗脱体积。如表30中所示，观察到一致方法性能根据SDS-PAGE分析产生高质量VSV产物；在所有妙丁Q洗脱混合物中达成可接受的残余DNA清除程度；同时获得类似方法产率。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>N/D:未测定VSVINN4CT9-gagl—致性组使用含有VSVINN4CT9-gagl的细胞培养液执行整个纯化方法。所述方法包含通过低速离心使细胞培养液澄清和回收上清液中的VSV;通过0.45/0.2pm过滤器过滤所述上清液和回收过滤溶液中的VSV;将VSV滤液装载到阴离子交换膜吸附剂上，从所述阴离子交换膜吸附剂洗脱VSV和回收VSV产物；通过切向流动过滤(TFF)使用750kDa截留分子量中空纤维膜纯化回收的VSV和回收保留物中的VSV，并且通过0.2pm过滤器过滤VSV保留物和回收过滤溶液'i'的VSV。在韦思公司(Wyeth)完成作为"致性组"的一个IOL和两个6L组且在赫诺根公司(Henogen)完成作为技术转移组的两个IOL组。实验条件总结于表31中。表31.用于VSVINN4CT9-gagl组的方法条件方法方法条件通过离心回收产物分批式离心机6236Xg，30min，20-24°C通过过滤回收产物赛多利斯赛多朗300用于6L规模，500用于10L规模；流动速率200ml/min用于6L规模和300ml/min用于10L规模妙丁Q色谱法颇尔妙丁Q10ml容器，流动速率200ml/min;颇尔妙丁Q60ml容器，流动速率600ml/minTFF超滤/透滤通用电气医疗公Kl(GEHealthcare)，MWCO:750kDa,五次缓冲液交换；CR:420cm2，CFR:500-550ml/min，TMP=1.0-2.0psi;TTR:1200cm2,CFR:1800ml/min,TMP=2.0psi最终过滤赛多利斯赛多朗150;流动速率100ml/min10ml(默斯坦tm)MustanQ容器用于三个一致性组(CR)和一个技术转移组(TTR)。60ml妙丁Q容器仅用于一个TTR。流动速率对于10ml容器为200ml/min且对于60ml容器为600ml/min。420cm2TFF膜用于一致性组，而1200cn^用于TTR。根据膜面积线性地调节交叉流动速率。实验结果总结于表32和33中。总方法产率对于所有执行的组来说是一致的。在不同组之间步骤回收率的变化是由效能测定(表33)的变化引起的。在所有组中观察到蛋白质和DNA杂质的一致移除(表32)。对于所述方法的典型SDS-PAGE分析附有这个评估(未图示)。已通过这种纯化方法产生高质量病毒产物。表32.VSVNjN4CTVgagl—致性组的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>1，2:CR#l-3的平均值和STDEV;N/D:未测定。因此，已成功地发展用于VSVNjN4CT,-gagl的纯化方法且发展的纯化条件按比例扩大到IOL规模(以细胞培养物体积计)，仍然维持相同方法性能。通过在6到IOL规模下(以细胞培养物体积计)三个一致性组和两个技术转移组验证所述方法。通过这种发展的方法在可接受的方法产率和杂质清除率下产生高质量病毒产物。本说明书通篇所引用的所有专利和公开案以引用的方式并入本文中。权利要求1.一种从感染水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)的哺乳动物细胞培养的细胞培养液纯化VSV的方法，所述方法包含(a)通过低速离心使所述细胞培养液澄清和回收上清液中的VSV；(b)通过0.2μm到0.45μm过滤器过滤步骤(a)的所述上清液和回收过滤溶液中的VSV；(b)将步骤(b)的所述VSV过滤溶液装载到用第一pH值缓冲盐溶液平衡的阴离子交换膜吸附剂上，用第二pH值缓冲盐溶液从所述阴离子交换膜吸附剂洗脱VSV，和回收洗脱VSV的洗脱份；(d)通过切向流动过滤(tangentialflowfiltration，TFF)使用具有介于300kDa与1,000kDa之间的截留分子量的膜来纯化步骤(c)中所回收的VSV和回收保留物(retentate)中的所述VSV，和(e)通过0.2μm到0.22μm过滤器过滤来自步骤(d)的VSV保留物和回收过滤溶液中的VSV。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中所回收的所述VSV至少90.0%到约99.0%不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是选自人类胚肾(HEK)细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾(AGMK)细胞和AGMK维拉维拉细胞(维拉cell)。4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述低速离心是介于4,400Xg至lj8,000Xg之间。5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)中的所述第一pH值缓冲盐溶液或所述第二pH值缓冲盐溶液的特征独立地是选自由下列组成的群组的特征中的一种或多种(a)含有独立地选自NaCl或KC1的盐；(b)含有具有100mM到400mM的离子强度的盐；(c)含有具有介于6.0到8.5之间的pKa的缓冲液；(d)具有6.5到8.0的pH值；(e)包含选自由磷酸盐缓冲液、N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙垸磺酸(HEPES)缓冲液或三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)组成的群组的缓冲液；和(f)包含浓度为1.5%到5%的蔗糖。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二pH值缓冲盐溶液中的所述盐是NaCl且其中所述VSV是通过以单步骤添加所述第二pH值缓冲盐溶液来从所述膜吸附剂洗脱，其中所述NaCl的单步骤洗脱浓度是介于500mM到750mM之问。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二pH值缓冲盐溶液具有洗脱流动速率10容器体积/分钟(capsulevolume/minute;CV/分钟)至U30CV/分钟。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二pH值缓冲盐溶液中的所述盐是NaCl，且其屮在10CV/分钟到30CV/分钟的洗脱流动速率下所述第二pH值缓冲盐溶液屮的NaCl的离子强度从1mM线性增加到750mM。9.根据权利要求到8中任一权利要求所述的方法，其中所述TFF膜的特征是选自由卜'列组成的群组的特征中的一种或多种(a)300kDa截留分子量;(b)750kDa截留分子量；和(c)中空纤维膜模块。10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中所述TFF包含将从步骤(c)回收的VSV浓縮至少5倍，随后缓冲液交换至少一次或至少五次。11.根据权利要求10所述的方法，其中用于所述缓冲液交换的缓冲液的特征是选自由下列组成的群组的特征「t'的-种或多种(a)磷酸盐缓冲液，(b)HEPES缓冲液，(c)TRIS缓冲液；(d)具有5mM到15mM的浓度和7.2到7.5的pH值的缓冲液；禾口(e)还包含100mM到200mMNaCl和3.5%到4.5%蔗糖的缓冲液。12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的方法，其中方法步骤(a)到(e)是在15'C和25'C或介于15'C到25'C之间的温度下执行。13.根据权利要求1-12中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)中使所述细胞培养液澄清是通过1.0到4.5nm深度过滤模块进行，其中步骤(a)中省略低速离心。14.根据权利要求1-13中任一权利要求所述的方法，其中将所述纯化的VSV调配到医药组合物中。15.—种根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法所纯化的VSV。16.根据权利要求15所述的VSV，其具有至少一种选自由下列组成的群组的特征(a)选自由下列组成的群组的血清型VSV印地安那州(Indiana)血清型、VSV新泽西州(NewJersey)血清型、VSV圣胡安(SanJuan)血清型、VSV伊斯法罕(Isfahan)血清型、VSV格拉斯哥(Glasgow)血清型和VSV金迪普拉(Chandipura)血清型；(b)包含至少一个或至少两个减弱VSV的致病性的突变的基因组序列；(c)(b)的基因组序列，其中所述减毒突变是选自由热敏性(temperature-sensitive,ts)突变、点突变、基因改组突变、G-茎(G-stem)突变、非细胞病变M基冈突变、双义RNA突变、截断G基冈突变、G基冈插入突变和基因缺失突变组成的群组；和d)其中所述VSV基因组序列包含选自由下列基因组成的群组的外来RNA开放阅读框架(openreadingframe,ORF)序歹U:选tl由g(3g、e"v、poZ、v(/"、"e/、ta"vpr、rev或vpM组成的群组的HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)基因、水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zostervirus)基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、A型肝炎病毒基因、B型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒基因、诺沃克病毒(Norwalkvirus)基因、外衣病毒基因、a病毒(alphavirus)基因、风疹病毒基因、狂犬病病毒基因、马尔堡病毒(Marburgvirus)基因、埃博拉病毒(Ebolavirus)基因、乳头瘤病毒基因、多形瘤病毒基因、偏肺病毒基因、冠状病毒基因、霍乱弧菌(W6r/o"o/erae)基因、肺炎链球菌(5Y，tococcKs戶e薩om.ae)基因、化脓性链球菌dep加occmpyoge"")基因、幽门螺杆菌(淑!'cobacferpy/o"')基因、无乳链球菌(r，ococcMSagatoc"'ae)基因、脑膜炎双球菌(脂雄"'afnem'w'"'d!、)基因、淋病奈瑟菌(/Ve/潔"'agonorr/zeae)基因、白喉杆菌(Cory"e/a"en:aA'p/^/ze〃'tw)基肉、破伤风梭菌(C7o"n'c/mmfefam')基因、百日咳杆菌(Sord"e〃a基因、嗜血杆菌(f/aemop/u7w)基因、衣原体(CWamyAa)基因、大肠杆菌(&c/^n'c/n'acoh')基因、编码细胞因子的基因、编码T辅助表位的基因、编码CTL表位的基因、编码佐剂的基因和编码辅因子的基因。17.—种医药组合物，其包含于医药学上可接受的载剂中的根据权利要求15或16所述的VSV。18.—种免疫原性组合物，其包含于医药学上可接受的载剂中的根据权利要求15或16所述的VSV。全文摘要本发明描述从哺乳动物细胞培养物获得具有改良纯度的水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)的新颖纯化方法。更特定来说，在某些实施例中，描述一种从感染VSV的哺乳动物细胞培养的细胞培养液纯化VSV的方法，所述方法包含通过低速离心使所述细胞培养液澄清和回收上清液中的所述VSV；通过0.2μm到0.45μm过滤器过滤所述上清液和回收过滤溶液中的VSV；将VSV过滤的溶液装载到用第一pH值缓冲盐溶液平衡的阴离子交换膜吸附剂上，用第二pH值缓冲盐溶液从所述阴离子交换膜吸附剂洗脱VSV和回收洗脱VSV的洗脱份；通过切向流动过滤(tangentialflowfiltration，TFF)使用具有介于300kDa与1,000kDa之间的截留分子量的TFF膜纯化回收的VSV和回收保留物中的VSV，并且通过0.2μm到0.22μm过滤器过滤VSV保留物和回收过滤溶液中的VSV。文档编号C12N7/02GK101426905SQ200780014090公开日2009年5月6日申请日期2007年4月19日优先权日2006年4月20日发明者克里斯滕·埃利萨·塞弗森,云康,阿马杜·阿弗雷伊·瓦塔拉,马克·威廉·卡特勒申请人:惠氏公司