专利名称：用于在器官、组织和细胞中非侵入性和定量地监控通过离体和体内基因靶向诱导的治疗 ...的利记博彩app
用于在器官、组织和细胞中非侵入性和 定量地监控通过离体和体内基因靶向诱导的 治疗和诊断性转基因表达的方法
001相关申请
002本申请涉及2006年3月21日提交的美国临时专利申请， 系列号60/743620，将其以引用方式并入本文中，且优先权按照35U. S, C. §119对其要求优先权。
003发明背景004发明领域
005本发明涉及非侵入性地监控离体和体内递送的治疗性和诊 断性转基因的表达以用于治疗在所有器官，组织和细胞中的任何疾病 的领域。
006现有技术说明
007基因治疗在各种先天或后天人类疾病的治疗中开创了一个 新的时代。但是，它的临床应用受到药物代谢动力学和药物效应动力 学信息的缺乏的限制。需要一个基本技术，使得能够在靶器官或组织 中确定转基因表达的动力学和分布。迄今为止，主要利用从尸体检查 或活组织检查获得的固定的组织测量转基因的表达或对其成像。还不 能获得用于在靶器官或组织中非侵入性和定量地测量转基因表达水平 和分布的临床上可应用的技术。
008近来，通过直接的心肌注射已实现将一个或两个腺病毒介 导的正电子成像术(positron emission tomography, PET)报告基因 的转移至大鼠心脏，最近，通过直接的心肌注射已实现将和VEGF基因 连锁的报告基因转入大鼠心脏。已展示在大鼠和猪心肌中围绕注射点 的很小的范围里，报告基因的病灶性分布的Micro-PET图象。但是，产生可检测的PET信号所需要的病毒的高效价通常在心肌中诱导显著 的炎症，并阻止了报告基因的长期表达。虽然PET报告基因成像的原 理很有前景，但是仍然需要为临床应用开发安全和可应用的方法，以 将报告子-治疗性基因递送到整个心脏中，并定量地对治疗性基因的表 达成像。在过去的十年里，我们从失败的临床实验中学到的教训使我 们意识到，迫切需要一种新的、更安全的基因递送策略，以及对基因 治疗的药物代谢动力学和药物效应动力学更好的理解。
009用于评估转基因表达的临床上可应用的方法是验证现有的 和新的基因转移策略、开发和验证任何临床可应用的新载体以及在耙 器官中阐释转基因表达成功的关键。但是，这样的临床上的方法以前 还不存在。在实验设置中，通过原位杂交技术或使用可以用各种方法 检测的报告基因实现基因表达的评估。对于体内或离体基因转移研究 来说，该评估仍需要在尸体检查分析中进行或者需要侵入性方法用于 组织采样。
010最近利用光学成像设备，用于体内研究的绿色荧光蛋白和 萤火虫荧光素酶的成像的进步，使得利用光学技术以在啮齿类动物中 实时分析报告基因的表达成为可能。该方法方便而且快速。生物发光 成像比荧光相对更加灵敏。但是光传输的效率受到了限制，依赖于组 织类型和组织散射。对于用于生物发光，生物发光信号的净减少量为 每厘米组织层厚减少10倍，而如果用于荧光信号，减少量还要进一步 翻倍。可见光的减弱限制了该方法在任何比啮齿类动物大的动物中的 使用。这些方法没有一个可以用于人类。
011本发明例举的实施方案的一个目的是建立一个设想和临床 上可使用的方法学，用于长期非侵入性、定量和重复地监控任何治疗 性基因的表达的量级，持续时间和分布，所述治疗性基因通过使用任 何已知的转染方法，例如病毒，脂质体，电穿孔，超声等等，离体或 体内粑向到各种组织和器官中。
012发明简述
013本发明例举的实施方案包括2个部分1)用于在各种组织和器官中，使用报告子-治疗性连锁的基因 -探针和正电子成像术、
Y照相机或单光子发射计算断层照相法，长期非侵入性、定量和重复
地监控离体靶治疗性基因表达的技术；和2)用于在各种细胞，组织
和器官中，使用报告子-治疗性连锁的基因-探针和正电子成像术、Y照相机或单光子发射计算断层照相法，长期非侵入性、定量和重复地监控体内靶治疗性转基因表达的技术。本发明的设备和方法可以用于针对诊断性和治疗性基因转移，监控任何器官、组织或细胞基因治疗。可以使用一个或多个报告基因，其可以与治疗性基因相同或不同。例举的实施方案不仅用于脂质体介导的基因转移，也用于任何其他基因转移方法。基因可以在质粒上，在细胞中或者在棵DNA中。
014构思是定量地对报告基因表达成像，所述报告基因在同一个质粒栽体上与治疗性基因结合，以推断靶组织或器官中治疗性基因表达的水平，位置和持续时间。这一策略需要报告基因和治疗性基因在广泛的转基因表达水平范围内成比例且持续的共表达。闪烁报告基因-探针成像的原理是将放射性药品用于与报告基因产物的基因表达相互作用的闪烁成像。在其他方法中，正电子成像术PET由于它的更高的空间分辨率和更高的灵敏度，因而是优选的闪烁成像形式。报告基因或者编码一种将放射性标记的底物转变为代谢产物(其在表达报
告基因的细胞中反过来被专一地捕获)的酶，或者编码选择性结合放射性标记的配体的受体，或者编码导致选择性摄取放射性标记核素的跨膜载体(carrier )。
015本发明的例举的实施方案中包括了 4个主要的部分。第一个部分是基于具有平衡的报告子/治疗性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因载体的设计。疱疹病毒胸苷激酶(HSVl-tk )是最普遍的酶报告基因，但是它也使内源性胸苷磷酸化。已发现HSVl-tk活性位置(HSVl-sr39tk )的诱变导致比野生型HSVl-tk能更有效利用无环鸟苷衍生物且更低效利用内源性胸苷的酶。存在着几种策略，这些策略已被证实能达到治疗性转基因和成像报告基因的表达的连锁。用病毒栽体对它们全部进行测试，因为裸质粒/DNA的转染效率太低。我们最先在单一质粒中使用两个相同的巨细胞病毒(CMV )启动子驱动一个报告基因和一个治疗性基因的表达。我们的数据显示在心肌中平衡的报告子-治疗性基因和治疗性-治疗性基因的表达。我们的结果表明在一个载体中2个相同的启动子驱动2个基因不会互相影响。
016近来，我们也开发了一种载体，它具有1个报告基因和2个治疗性基因，可以用于监控组合的基因治疗。另一方面，我们也开发了几种不同的方式，以在报告子和治疗性基因表达不平衡时优化载体设计。因此，这个技术可以应用于在各种器官疾病中使用各种治疗性转基因的受控基因治疗。
017虽然自身免疫是质粒毒性所主要关心的，但迄今为止没有令人信服的与DNA疫苗关联的自身免疫的证据。因此质粒DNA可以诱导细胞和体液免疫反应。当DNA单独使用时，这些反应的量级一般是温和的。灵长类动物的研究和人体试验初步的结果表明可以通过将DNA和佐剂结合，或通过用重组病毒栽体或蛋白激发，或通过佐剂作用和激发作用诱导更有效特异的免疫反应。
018DNA是复杂的高分子，其免疫学性质随碱基顺序而变化。如用合成寡核苷酸所示，有效的免疫刺激由称为CpG基序或免疫刺激序列(ISS)的6碱基基序引起。这些序列集中于未甲基化的CpG二核苷酸，且在细菌DNA中比在哺乳动物DNA中更经常出现。同样地，CpG基序可能作为危险的信号起作用，以刺激B淋巴细胞激活和细胞因子产生。为了减少和消除可能的(但尚未证实的)质粒DNA的免疫原性，可以采取4种策略l)避免使用病毒载体；2)使用脂质体封装以减少免疫反应，令人感兴趣地，和脂质体复合的DNA也可减少阳离子脂质体的细胞毒性，如我们在以上部分描述的；3)通过在乾器官和组织中定位基因递送避免异位基因转染；4)构建无CpG质粒的栽体。在我们的研究中提出的离体和体内基因转移的方法已遵照前3个要求。最近，我们构建了一个无CpG的、具有由2个相同的无CpG人延长因子1 oc( EF-1 oc )启动子驱动的HSVl-sr39tk和人IL-10基因的质粒载体，pCpGf-EFlHSVlsr39tk-EFlhIL-lO。 *019与CMV载体(最有效但也最有免疫原性的启动子)不同，人EF-lct具有少得多的免疫原性，因为它几乎不含CpG。 EF-la启动子由Invivogene， San Diego， CA制造，在体内呈现强活性并产生持续稳定的表达。我们目前正在兔同系移植物移植模型中利用我们的脂质体介导的离体冠状动脉内基因转移方法验证这一栽体。我们已经在兔心脏移植模型中在6个兔心脏同系移植物中利用我们的脂质体介导的离体冠状动脉内基因转移方法验证了这一栽体。我们的初始数据已经表明，用这一新的载体诱导的转基因表达比用具有2个CMV启动子的常规质粒显著更高。观察到平衡的报告子和治疗性基因的表达。在这些兔子中，没有发现心脏副作用和免疫原性。
020本发明例举的实施方案的第二个主要的部分是，报告探针对宿主细胞代谢和功能没有影响，但针对和用于成像的同位素的结合效应具有高特异性。
021已研究2个主要的底物种类，用放射性碘标记的尿嘧啶衍生物(例如，I-标记的2，氟-2，-脱氧-l-p-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘-尿嘧啶(FIAU) )，和用放射性"F-氟标记的无环鸟苷衍生物(例如，9- (4-rF]-氟-3-羟甲基丁基)鸟嘌呤(FHBG)和8-["F]潘昔洛韦(fluropenciclorivr) ( FPCV ))，作为报告探针，用于对HSVl-tk报告基因表达的成像。我们发现FHBG比FPCV是用于在体内对野生型HSV1-tk和HSVl-sr39tk PET报告基因成像的更有效的探针。
022本发明例举的实施方案的第三个主要的部分是，在大型动物和人的各种器官和组织中临床上可应用的离体和体内报告子和治疗性连锁的基因递送系统。
02 3大部分报告基因成像研究是在体外或者通过将基因注射入肿瘤的体内。迄今，可获得很少的关于心脏中非侵入性的转基因表达成像的信息。在所有的先前的研究中，报告基因直接被注射到心肌中。这些研究仅集中在定量地对注射位点的局部报告基因表达的成像。
024我们已开发了在大型动物的整个心脏中的离体和体内基因递送策略。我们事先开发了兔异位功能性心脏移植物/急性心脏排斥模型，其是迄今为止可获得的唯一的功能性心脏移植动物模型，且已用 于证实各种基因转移技术和治疗性基因。我们事先开发的离体冠状动
脉内递送和脂质体介导的IL-10基因治疗方法是最详细表征的非病毒 基因治疗模型，其可再现地诱导了定位的免疫抑制且延长了心肌同种 异体移植物的生存。我们最近开发的IL-4和IL-IO联合基因治疗方法 是唯一成功的基因治疗方法，其能在大型动物中促进同种异体移植物 的耐受性，而不需要常规免疫抑制试剂。我们已经开发了非病毒的报 告子-治疗性连锁的离体基因转移技术，用于在整个心脏中，用 microPET非侵入性和定量地监控心脏转基因表达。我们将兔心脏移植 物/IL-10基因治疗模型作为工具，通过系统地检验报告子-治疗性连 锁基因转移功效和与组织分析结果相比的PET定量精确性，验证该技 术的可行性。更重要地，利用这一模型，我们验证并证实了 PET报告 子-治疗性连锁基因转移并没有局部和全身副作用，且报告基因并不削 弱共转染的治疗性基因的治疗功效。这些问题在临床应用中是至关重 要的，但是它在之前的任何报告基因的研究中从没有被提出过。因此， 在我们进一步改善定量方法的同时，近来我们针对microPET对在兔体 内转染基因的表达的成像，开发了冠状窦退行性报告子-治疗性基因递 送技术。最近，我们已展示了在犬类心脏中利用常规PET扫描器监控 体内经由皮肤的冠状窦退行性递送的报告子-治疗性连锁的转基因表 达的可行性。
025本发明例举的实施方案的第四个主要的部分是在靶器官和 组织中用于监控治疗性转基因表达的临床可应用的定量方法。
OM到目前为止，从未能够定量分析报告基因表达，且从未检 验其在心脏中与报告探针积累的相关性。虽然已经做出尝试，将具有 报告子-VEGF连锁的基因的腺病毒栽体注射入大鼠心肌，但从未检验 基因表达水平。尚未建立利用体内定量方法在培养的H9c2细胞中评估 报告蛋白和VEGF蛋白表达的相关性。迄今为止，在动物实验中，用于 microPET成像的信号的定量仍是通过在给定组织位点中积累的示踪 物的量(用注射量和被检验组织的质量标准化，。/。ID/g)来测量。因此，动物必须被处死。收集心脏组织并称重。在体内，心脏质量只能基于 总体重来假定。
027在本发明的例举的实施方案中，我们开发并验证了连续 [18F] -FHBG积累的PET成像的方法用于定量报告基因的表达，[18F] -FDG 积累用于活心肌的代谢成像。我们比较了示踪物积累的量(通过 [18F] -FHBG的。/。ID/g相对％10- [18F] -FHBG /，- [18F] -FDG的比例评估) 与转基因和蛋白的表达水平(通过离体定量RT-PCR和蛋白质印迹分析 评估)之间的相关性。HSVl-sr39tk基因和蛋白表达与y。ID-rF]-FHBG /%ID- [18F] -FDG的比例的相关性比其与[18F] -FHBG的。/。ID/g的相关性显 著更紧密(分别是？=0. 95相对r2=0. 92， P<0. 05，和r2=0. 94相对 r2-0. 91， P<0. 05) 。 IL-10基因和蛋白水平与°/。ID-[18F]-FHBG /%ID- [1SF] -FDG的比例的相关性也比其与[18F] -FHBG的。/。ID/g的相关性 显著更强(分别是？=0. 97相对r2=0. 88, P<0. 05，和r2-0. 95相对 r2-0. 91, P<0. 05 )。
028因此，应理解的是，本发明的例举的实施方案通过使用报 告子-治疗性连锁的基因/探针和正电子成像术、y照相机或单光子发 射计算断层照相法，在各种组织和器官中长期非侵入性、定量和重复 地监控离体靶向的治疗性转基因的表达而被最好地实践。
02 9本发明例举的实施方案还被通过使用报告子-治疗性连锁
的基因/探针和正电子成像术、y照相机或单光子发射计算断层照相 法，在各种组织和器官中长期非侵入性、定量和重复地监控体内把向 的治疗性转基因的表达而被最好地实践。
030我们已经证实了报告子-治疗性连锁的基因转移在兔和狗 的心脏中的离体基因疗法中的效率、功效和副作用。已在兔中检验了 毒性。
0 31我们还检测了报告子-治疗性连锁的基因转移在兔和狗的 心脏中的体内基因疗法中的效率、功效和副作用。该技术用于在其他 器官(如关节、肺、肝、肾)中的基因疗法的验证是预期的。
032在一个实施方案中，对报告基因表达定量成像的步骤包含对2个或更多报告基因表达定量成像的步骤，其中报告基因与2个或 更多转染的基因-探针连锁，以推断转染的基因表达在靶向的组织、器 官或细胞中的水平、位置或持续时间。
033在另一个实施方案中，对报告基因表达定量成像的步骤包 含对报告子-治疗性连锁的转基因栽体的表达定量成像的步骤，所述转 基因栽体的表达通过质粒中带有定位在报告基因和治疗性或诊断性基 因之间的双向启动子的平衡的报告子/治疗性或平衡的报告子/诊断性 的转基因表达诱导。
034在又一个实施方案中，对报告基因表达定量成像的步骤包 含对平衡的报告子治疗性转基因的表达定量成像的步驟，或对成比例 的报告子和治疗性或诊断性转基因的表达定量成像的步骤。
035在一个例举的实施方案中，对报告基因表达定量成像的步 骤包含对靶向的器官、组织或细胞中转基因或异位转基因表达定量 PET成像的步骤。
036在另 一个例举的实施方案中，对报告基因表达定量成像的 步骤包含通过同时测量代谢探针的表达和治疗性或诊断性转基因的表 达以及比率化测量值对器官、组织或细胞的强烈转染密度的比率定量 成像的步骤。
037虽然已经或将要为了语法通顺和功能说明对仪器和方法进 行描述，但是应清楚地理解，除非特别根据35 USC 112被明确地表达， 否则权利要求不应理解为通过"方法"或"步骤"限制的结构以任何 方式必要地被限制，而是根据司法上的等同原则与由权利要求书提供 的定义的含义和等价物的全部范围一致，并且在权利要求根据35 USC 112被明确地表达的情况下，根据35 USC 112与全部的法定等价物一 致。通过借助下列附图(其中相同的元件引用相同的数字)，可以使 本发明更直观。
038附图简述
039
图1A是展示质粒载体结构的图表，在所述载体中启动子、 报告基因和治疗性基因是连锁的。040图1B是展示基因转染效率的柱状图。
041图1C是展示来自sr39tk和hlL-10转基因在各种器官和 心脏区域中表达的RT-PCR分析的结果的图。
042图1D是展示针对报告子和治疗性基因的转基因/GAPDH表 达比率的剂量依赖性的柱状图。
043图1E是展示针对连锁的基因栽体和"空"脂质体载体的 转基因/GAPDH表达比率相对于手术后天数的时间依赖性的图。
044图2A是展示报告子和治疗性基因的蛋白表达相对于手术 后天数的时间依赖性的图。
045图2B是展示鉴定报告子和治疗性基因共定位的免疫荧光 染色的显微照片。
046图2C展示了心脏中各个位置的报告子和治疗性基因蛋白 质印迹分析的结果，在上面展示了心脏中相同位置的报告子和治疗性 基因的蛋白表达的柱状图。
047图2D是治疗性基因相对于报告基因的蛋白表达的图，展 示了二者之间的相关性。
048图3A是一系列的在不同手术后天数拍摄的兔心脏的 microPET图象。
049图3B是15只兔的心肌y。ID的时间依赖性的图。
050图3C是一系列的来自兔颈部和胸部的microPET图象，展 示了与报告子-治疗性连锁的转基因/ [18F] FHBG探针(仅在颈部的基因 转染的移植供体心脏中，而不在胸部的兔天然心脏中)相比较的代谢 探针(在颈部的供体心脏和胸部的兔天然心脏两者中)的积累。
051图4A是一系列的整个心脏的断层分析PET图象，比较了 [188F]FHBG图象(表明了均匀分布的报告子-治疗性基因表达)和 ["F]FDG图象(展示了有活力的心肌)。
052图4B是展示心肌组织中["F]FHBG积累(％ID/g)和离体 移植心脏的Y计数以及TK蛋白表达水平的蛋白质印迹量化之间的相 关性的图。
1053图4C是展示供体兔心脏中IL-10基因表达和 [18F]FHBG/[18F]FDG比率以及["F]FHBG积累(%ID/g )之间的相关性 的图。
054图5A是展示针对各种组合(脂质体与空和报告子-治疗性 基因连锁的载体复合)的心脏同种异体移植物的平均存活(天数)的 柱状图。
055图5B是与图5A的柱状图数据点相应的组织学显微照片。056图5C是图5A和5B的同种异体移植物的排斥评分的图。057图5D是展示心脏同种异体移植物中通过脂质体
pCMVh IL-10基因治疗和通过报告子-治疗性连锁的基因治疗减少的
CD3+淋巴细胞渗透的比较的柱状图。
058图5E是展示针对用不同载体组合处理的各种心脏同种异
体移植物的左心室收缩压与对照(同种异体移植物)和同系移植物中
的左心室收缩压相比)的柱状图。
0"图5F是展示图5E的同种异体移植物中心律不齐的事件的
数目的柱状图。
060本发明及其各个实施方案可以通过借助下列优选的实施方 案的详细描述更好的理解，所述优选实施方案是作为权利要求中定义 的本发明的例举的实施例而提出的。应清楚地理解，通过权利要求定 义的本发明可以比下面描述的例举的实施方案更广泛。
061优选实施方案详述
062例举的实施方案是临床可应用的方法，其可用于在大型动 物的整个心脏中利用PET成像非侵入地监控报告子和治疗性连锁的基 因表达。已在兔颈部异位功能心脏移植模型中验证了报告子和治疗性 连锁的基因转移的功效和心脏副作用。在移植前，与载体(包含单纯 疱疹病毒1型突变体胸苷激酶(HSVl-sr39tk)作为报告基因和重组人 免疫抑制细胞因子，白介素-10 (hIL-lO)作为治疗性基因)复合的阳 离子脂质体冠状动脉内离体递送入心脏同种异体移植物。在同种异体 移植物中观察到，HSVl-sr39tk和hlL-10转基因和蛋白长期的过表达与心肌PET报告探针9- (4-["F]-氟-3-羟甲基丁基)鸟嘌呤 ([18F]FHBG)的积累相关。HSVl-sr39tk基因的表达与hlL-10基因表 达和总心肌的「F]FHBG积累(量化为静脉内注射的[18F]FHBG的剂量 的百分比)有显著相互关系。在整个心脏中看到[18F] FHBG积累的均匀 分布，类似于["F]氟脱氧葡萄糖(PET葡萄糖代谢探针)的分布。在 用报告子-治疗性连锁的基因和仅用治疗性基因处理的同种异体移植 物中，免疫抑制治疗功效保持相同。没有发现心脏副作用。我们的结 果第一次表明PET报告子-治疗性连锁的基因成像可应用于在整个心 脏中非侵入性地监控离体冠状动脉内递送的治疗性转基因的表达。
063例举的实施方案关注于临床可应用的方法，用于离体将非 病毒介导的PET报告子-治疗性连锁的转基因冠状动脉内递送至大型 动物的真个心脏中。报告子-治疗性基因/探针的PET成像的精确性用 于非侵入性和定量地监控治疗性转基因表达的分布和动力学，并利用 兔异位功能心脏移植模型检验心脏副作用和验证报告子/免疫抑制的 治疗性基因疗法的功效。
064在考虑例举的实施方案的方法学的结果和验证之前，考虑
作为例举的实施方案进行的方法。必须清楚地理解，在例举的方法学 中可以作出许多不同的改变而不脱离本发明的范围。
065首先述及脂质体-基因复合物的制备。如图1A中图解说明 的，我们构建了质粒载体10，其包含突变体单纯疱渗病毒l型胸苷激 酶基因(HSVl-sr39tk)(作为PET报告基因12 )和人重组白介素10 基因(作为治疗性基因14)，它们通过2个相同的CMV启动子16驱 动。由GIBCO BRL提供在阳离子脂质基本骨架的2，3-二氧-丙铵类
(propaniminium)中的阳离子脂质体GAP: DLRIE,其还包括(+) 一N- (2-羟乙基)-N，N- 二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-l-溴丙铵
(propaniminium bromide ) (DLRIE) 、 N-[l-(2， 3-二油酰氧)丙 基]-N，N，N-三甲基铵、1，2-双(油酰氧)-3-(三甲基铵基)丙烷和2，3-二油酰氧-N- [2- (精胺甲酰胺基(sperminecarboxa迈ido ))乙基]-N, N-二甲基-1-丙铵。pCMVHSVl-sr39tk 、pCMV-hIL-lO 或pCMV-HSVl-sr39tk-CMV-hIL-10 cDNA (50 jag)的最佳浓度是通过20 分钟温和涡旋与脂质体(50 jig)复合。
066如下使用异位功能颈部心脏移植模型和离体冠状动脉内基 因递送。从地理学上不相关的卖主购买重3. 5kg的新西兰白色供体兔 (Charles River Laboratories, St. Constant, QC， Canada)和重4kg 的受体兔(Myrtle's Rabbitry， Thompson Station, TN， USA)。之前 已描述该不匹配急性排斥反应模型的病理学特征。简而言之，在全身 麻醉下，通过经由大动脉套管灌输威斯康星州大学溶液(University of Wisconsin solution) ( 48C， 20 ml/kg， 120 ml/h)使供体兔心 脏停止跳动。在20分钟内，通过离体冠状动脉内灌输施用在10迈l 正常盐溶液中的脂质体-基因复合物。使供体大动脉和肺动脉分别与受 体近端的右颈动脉和普通的颈静脉吻合，使左和右心房分别与受体的 远端右颈动脉和普通的肺动脉吻合。
067在IL-10基因疗法组中手术后第2、 4、 6、 8、 12、 20和 28天以及在对照组中手术后第2、 4、 6和8天进行Micro-PET扫描。 往受体兔静脉内注射1 mCi的["F]FHBG PET报告探针。静置lh以使 得示踪物摄取和清除之后，用micro-PET-P4 (PrimateP4; Concorde Microsystems, Inc., Knoxville， TN， USA)在颈部和胸部上对兔成 像45分钟。Micro-PET图象数据通过过滤的反投影重建并且重新定位 至短，垂直和水平长轴切片。利用从扫描圆柱模型(cylindrical phantom)获得的校准常数，将从前面偏一边的壁上的关注的区域 (short axis cut)得到的计数/象素/分钟转化为计数/ml/分钟。 将所关注的区域(ROI)计数/ml/分钟转化为计数/g/分钟(假定组织 密度为lg/ml )并除以注射剂量，以获得源自ROI图象的[18F]FHBG的 百分比注射剂量每克的心脏(％ID/g)。在每个关注的区域中，对总心 肌TF]FHBG剂量作背景活性校正，针对12个切片求和，并表达为。"D - (在l2个关注的区域(ROI)左心室(LV)中的总活性(MBq) -在 l2个ROI BG中的总活性(MBq) ) /注射剂量(MBq ) x 100。在扫描 [18F]FHBG的前一天，将2-["F]氟-2-脱氧-d-葡萄糖(1 mCi )注射入兔的耳静脉。进行["F]FDG扫描1小时。在["F]FDG注射后，利用与 用于[1SF] FHBG的相同的方法进行心肌代谢PET成像60分钟。
068如下在移植的心脏中进行18F放射性的Y计数。在 micro-PET扫描后，在y孑匕计数器(Cobra II Auto-Gamma， Packard) 中针对"F放射性对移植的心脏计数。["F]FHBG的总心积累表达为y。ID。
069如下进行用于评价基因转移效率的原位杂交。为了确定基 因转移效率，合成HSVl-sr39tk和hlL-lG mRNA的反义和有义洋地黄 毒苷标记的核糖核酸探针(Boehringer Mannheim )并且如之前描述的， 将其用于石蜡切片上的原位杂交。基因转移效率被确定为染上蓝色的 阳性细胞在总心肌细胞中(在每个切片的10倍镜的显微视野(放大率 为x 400 )中计数)的百分比。转基因不仅在心肌细胞中表达，而且也 在内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达。仅把那些没有血管的观察视野 用于分析。随后用苏木精和伊红(H&E)染色的切片用于辨别心肌细胞 和其他细胞。
070如下进行比较反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析。使 用之前描述的引物和方法，进行比较反转录聚合酶链式反应以检测 HSV1-sr39tk和hIL-10在心脏同种异体移植物中的转基因表达。构建 了 3个竟争性模板(CT)，每一个分别针对HSVl-sr39tk， hlL-10和看 家基因GAPDH。每一个CT的扩增产物在大小上与原始的70-170 bp的 cDM产物不同。为了控制单独的RT-PCR反应(从中提取样本cDNA模 板)的效率，首先使用相同的扩增技术以测量看家基因GAPDH的表达。 对来自每一个单独RT-PCR反应产物的相当于50 ng总RM的 HSVl-sr39tk和hIL-lO cDNA样本进行适当的稀释，以包含CT cDNA 的相等浓度，并且根据样本中GAPDH的表达对其进行标准化。对于每 一个具体的基因，5 ju 1的标准化的RT-PCR产物与固定量的基因特异 性CT DNA —起共扩增。通过比较它们各自样本的测试基因cDNA/CT DNA 的比率乘以在比较模板RT-PCR中针对具体基因使用的CT DNA固定量， 确定各种样本中测试基因cDNA的相对量。另外，所有的样本根据各自 的GAPDH cDNA/CT DNA比率进行标准化。该标准化控制了在所有样本中加栽的cDNA的量。PCR样本在2%的琼脂糖胶上跑胶。用Eagle Sight 3. 0软件(Stratagene， La Jolla， CA， USA)测量溴化乙锭发光的强 度，以获得数字图象釆集，处理和分析。该软件提供了凝胶图象的相 对密度的分析，其代表了象素的二维阵列。用NIH Image 1.54进一步 分析和量化凝胶图象。
071如下进行蛋白质印迹分析。将蛋白(lOOA-jag)进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳。印迹与1: IOOO稀释的鼠抗人IL-10单克隆抗体 (eBioscience， San Diego, CA， USA )或与1: 1000稀释的兔抗胸苷 激酶抗体(来自M. E. Black, University of Washington, Seattle, WA， USA)温育，然后与山羊抗鼠或大鼠抗兔IgG二抗温育(Jackson Laboratories, West Grove, PA， USA)。
072如下进行用于评价蛋白表达的分布的双免疫荧光染色。在 10%山羊血清中封闭石蜡切片2个小时。切片用1:100稀释的鼠抗人 IL-10单克隆抗体(eBioscience )和1: 100稀释的兔抗胸苷激酶抗体 温育过夜。然后切片用山羊抗鼠IgG-FITC结合的二抗和大鼠抗兔 IgG-RPE结合的二抗(Southern Biotechnology, 1: 100 )孵育90分 钟。
073如下进行组织学分析和心脏同种异体移植物的排斥评分。 在LV组织的连续切片上进行标准的H&E染色用于组织学评价。基于由 心肺移植国际协会(International Society for Heart and Lung Transplantation )建立的在心脏排斥的诊断中的命名法的标准，确定 心脏同种异体移植物的排斥评分。
074如下进行用于检验渗透细胞的免疫组化染色。连续切片用 生物素化的抗兔CD3—抗(Spring Valley Laboratories, Woodbine, MD， USA)温育1小时。用AutoProbe III试剂盒(Biomed Corp. ， Foster City, CA, USA)和H&E复染检测抗体-生物素缀合物。
075如下进行基因转移和心脏同种异体移植物功能的致心律失 常效应的评估。为了检测基因转移的致心律失常效应，在心脏同种异 体移植物移植后24小时，在心脏同系移植物和同种异体移植物上连续
20记录ECG l小时。为了评价心脏功能，来自对照和处理组的移植物在 ECG记录后立即进行经心房的导管插入，以量化左和右心室压。用 B10pac MP100系统(BI0pac， Inc., Santa Barbara, CA， USA)确定 最高收缩压。
076所有的数据表示为平均值+标准差。进行配对或未配对 Student t检验以比较2组的差异。P<0. 05认为有显著性。
077已经说明了所使用的方法的详情，转而考虑所述方法的结 果。首先，考虑离体冠状动脉内递送和脂质体介导的报告子-治疗性连 锁的基因转移的效率。心脏同种异体移植物中的脂质体介导的离体报 告子-治疗性连锁的基因转移的效率(通过原位杂交评价)是适当的(分 别是15. 5和15. 4%)。报告基因的基因转移效率和治疗性基因的基因 转移效率一样。当或者报告子或者治疗性基因单独转移时，它也是类 似的(分别是15. 3和15. 7%，如在图1B的柱状图中所示)。在图1B 中在供体心脏(在手术后第8天，用单独的报告基因pCMVsr39tk(n-8)， 单独的治疗性基因pCMVhIL-10 (n-8)或报告子-治疗性连锁的基因转 染(pCMVsr39tk -CMVhIL-lO， n - 8))之间比较基因转染的效率。 转基因不仅在心肌细胞中表达，还在内皮细胞和血管平滑肌细胞中以 稍微更高的基因转移效率表达(分别是18. 8和17. 1%)。
078在整个心脏中报告子和治疗性基因表达的分布和共定位
(通过RT-PCR和RNA印迹分析)揭示了 PET报告基因和hlL-10二者 都仅在心脏同种异体移植物中表达，而不在受体的心脏，脑，肺，肝， 肾和骨骼肌中表达，如在图1C的柱状图中所示。冠状动脉内基因递送 导致共定位和均匀分布的报告子和治疗性基因在整个心脏中过表达
(图1C)。图1C的顶部展示了来自在心脏同种异体移植物的LV (道 1和2)和受体心脏，肺，脑，肝，肾和骨骼肌(道3-8)中的sr39tk 和hIL-10转基因表达的定量RT-PCR分析的代表性数据。图1C的底部 展示了在心脏同种异体移植物的左心室(LV)，室间隔(IVS)，右心 室(RV)，左心房(LA)和右心房(RA)中均匀分布的过表达的报告 子和治疗性转基因的定量RT-PCR分析。079考虑报告子和治疗性转基因表达的量级和时间进程。在靶 向的器官中转基因表达是剂量依赖性的，如在图1D的柱状图中所示。 sr39tk和hlL-10转基因cDNA在心脏同种异体移植物中的表达的剂量 依赖性在图1D中用柱状图总结。在手术后(p.o.d.)第8天收集心脏 组织样本。定量的sr39tk和hlL-IO转基因表达水平图示为与看家基 因GAPDH表达的比率"P〈0. 05)。我们观察到在全剂量范围里报告子 和治疗性转基因表达的平行增加(除了最高剂量之外)。早在手术后 第2天就可以在供体心脏中观察到HSVl-sr39tk和hlL-10转基因表达 的显著增加，并在手术后第8天达到顶峰，而后緩慢下降，如在图1E 的时间曲线图中所示。在图1E中通过RT-PCR评估sr39tk和hIL-lO 基因在用报告子-治疗性连锁的基因或"空"脂质体处理的同种异体移 植物中表达的时间依赖性。为了确定转基因和蛋白表达的时间进程， 在Lipsr39TKhlL-10处理組中，在p. o. d.第0天(n - 5)、第2天(n - 5)、第4天(n - 5)、第6天(n - 8)、第8天(n -15)、第12 天(n = 5)、笫18天(n = 5)或第28天(n - 5)天处死动物，并收 集左心室组织用于分析。在用空脂质体处理的对照组中，大部分同种 异体移植物只能存活8天；因此在p, o. d.第O天(n- 5)、第2天(n =5)、第4天(n = 5)、第6天(n - 8)或第8天(n -15)处死动物 并收集左心室組织。在心脏同种异体移植物中，由报告子-治疗性连锁 的基因诱导的报告子基因表达的量级和时间进程与治疗性转基因表达 的量级和时间进程相似，还与分开转移的这2个基因表达的量级和时 间进程相同。
080考虑报告子和治疗性基因产物的平衡表达的动力学。蛋白 质印迹分析表明，HSVl-sr39tk和hIL-lO两者的蛋白表达的时间进程 与基因表达的时间进程相同，如在图2A中所示，图2A描述了 TK和 IL-IO蛋白在心脏同种异体移植物中过表达的时间依赖性。最重要的 是，IL-10蛋白表达在同种异体移植物中表达的量级和时间进程与 HSVl-sr39tk的量级和时间进程一致。
081考虑报告子和治疗性基因产物的分布和共定位。双免疫荧光染色揭示了 ， HSVl-sr39tk和hIL-IO蛋白在心肌中表达的均匀分布 和共定位，如在图2B中所示，图2B展示了免疫荧光染色的结果以鉴 定TK和IL-10蛋白在心脏同种异体移植物中表达的共定位。蛋白质印 迹分析表明在供体心脏的左心房(LA)，右心房(RA)，右心室(RV)， 室间隔(IVS)和左心室(LV)中HSVl-sr39tk和IL-IO两者蛋白水平 相似，如在图2C中所示，图2C中蛋白质印迹分析的代表性结果表明 过表达的TK和IL-IO在LV,RV,IVS,LA和RA中均匀分布。通过ELISA 检验，与具有用"空"脂质体(作为对照)处理的同种异体移植物的 受体兔相比，在受体的脑，肺，脾，肝，肾和骨骼肌中，在所有时间 相位，HSVl-sr39tk和IL-1G浓度没有显著变化。
082图2D中展示了报告子和治疗性基因和蛋白表达之间的相 关性。在心脏同种异体移植物中报告子基因表达与治疗性基因表达有 显著相互关系(r = 0.94， P < 0.001，数据未展示)。另外，在靶向 心肌中HSVl-sr39tk蛋白表达也与IL-10蛋白表达非常紧密相关(图 2D)，图2D中明确证明了在用报告子-治疗性连锁的基因转染的心脏 同种异体移植物中TK和IL-10蛋白水平之间的相关性。
083图示地表明了报告子-治疗性连锁的基因在整个心脏中表 达的Micro-PET成像。此处，我们已首次能够展示9- (4-[18F]-氟-3-羟甲基丁基)鸟嘌呤(["F]FHBG)在整个心脏(用报告子-治疗性连锁 的基因pCMV-HSVl-sr39tk-CMVhlL-10转染)中的均匀分布，如在图 3A的图象中所描述。展示了 ["F]FHBG在兔心脏同种异体移植物心肌中 积累的Micro-PET成像。植入受体兔(用脂质体-pCMVsr39tk-CMVhIL-lO离体冠状动脉内递送)颈部的供体兔心脏同种异体移植物 的代表性横断面图象。在p.o.d.第4天，观察到明显的示踪物积累。 在p. o. d.第8天，观察到[18F] FHBG在LV心肌中的均匀分布。在p. o. d. 第1S和"天观察到rF]FHBG活性的下降，同时由于急性同种异体移 植物排斥反应出现了 LV增厚。与此相反，在p.o.d.第8天，在用空 脂质体或脂质体-pCMVhIL-lO处理的同种异体移植物中没有观察到 「F]FHBG积累。可以早在p. o. d.第2天，在pCMV-HSV1-sr39tk-CMVhlL-10处理的心脏同种异体移植物中观察到积累的 [18F]FHBG的PET成像，并在p. o. d.第8天到达峰值，在p.o. d.的12 天维持高水平并緩慢下降，如图2A和2B所示。图3B的图展示了从 15只兔子中连续扫描的micro-PET图象计算出的心肌[18F] FHBG积累 %ID的时间进程。报告探针活性的清晰信号持续至超出p. o. d. 28天。 通过长期、重复和非侵入性的PET成像观察到的[18F] FHBG活性的动力 学与在组织样本的转基因和蛋白测量(如在图1E中所观察到的)中观 察到的类似。我们在空脂质体或pCMVhlL-10处理的同种异体移植物中 没有看到["F]FHBG活性。我们仅在颈部的靶向的供体心脏中观察到 tf]FHBG活性，而没有在受体天然心脏或其他器官，如肺，脑，骨骼 肌或肝中观察到rF]FHBG活性，如在图3C中所示，图3C是与代谢探 针(「F]FDG)积累比较的报告子-治疗性连锁的转基因/rF]FHBG探 针积累的定位的micro-PET成像。与此相反，在图3C中，我们在供体 心脏以及受体心脏和肢骨骼肌和颈部中观察到显著的2-[188F]氟-2-脱氧-d-葡萄糖(TF]FDG)活性。
084我们在供体心脏中看到的tf]FHBG的均匀分布与图4A中 由「F]FDG展示的分布类似，图4A是整个心脏micro-PET图象的断层 分析视图。图4A中，["F]FHBG图象示范了在整个心脏中均匀分布的 报告子-治疗性基因表达，[18F]FDG图象展示了有活力的心肌。比色刻 度尺表达为。/JD/g。虽然脂质体的基因转移效率比腺病毒的基因转移效 率低5倍，但是用这个先进的高分辨率PET系统仍可以在短，垂直和 水平轴图象中的RV和LV壁和IVS中清楚地看到["F]FHBG活性的扩散 分布。
085考虑治疗性转基因表达的量化。在来自用 pCMV-HSVl-sr39tk-pCMVhlL-10处理的同种异体移植物的LV中18F放 射性的传统Y计数比来自用pCMVhIL-10或空脂质体处理的同种异体 移植物的"F放射性的传统y计数高17 F - 4倍。离体移植心脏的18F y 计数活性与ROI衍生的micro-PET ["F]FHBG活性高度相关，如在图 4B中所示，图4B展示了心肌组织中["F]FHBG积累(％ID/g)和离体移植心脏的Y计数或蛋白质印迹量化的TK蛋白表达水平之间的相关 性。量化为静脉内注射的[18F]FHBG剂量(°/JD/g)百分比的总心肌 TF]FHBG积累显著与心肌中的HSVl-sr39tk mRNA水平(r2 = 0. 83， P < 0.001,数据未显示)和图4B中的HSVl-sr39TK蛋白水平相关。在 用pCMV-HSVl-sr39tk-pCMVhIL-10处理的同种异体移植物中或仅用 pCMVHSVl-sr39tk处理的同种异体移植物中HSV1-srt39tk蛋白水平和 FHBG。/。ID/g之间的相关性保持相同。最重要的是，hlL-10基因和蛋白 表达水平也与rF]FHBG积累高度相关(分别是r2 = 0.88， P < 0.001 和r2 - 0. 91， P < 0. 001 )(图4C)，图4C展示了供体心脏中IL-IO 基因表达和["F]FHBG/["F]FDG比率或["F]FHBG积累(％摄取剂量 (ID/g))之间的相关性。可以通过在活组织中测量转染的报告基因 或分子(如「F]FHBG)的射线照片密度和测量葡萄糖标记分子(如 [18F] FDG )的射线照片密度完成定量成像。这两个射线照片密度的比率 提供了每单位体积，每单位质量或每任何其他单位化量度标准的器官， 组织和细胞摄取的转染物质的量的定量方法。在体内实例中，不存在 其他实用的方法以获得精确度量的体积或质量或器官，组织或细胞， 因为不同的个体之间或甚至单一个体身体内部的不同位置之间器官， 組织和细胞的体积和质量大小变化很大。对在活组织中摄取的葡萄糖 进行标记，然后计算它与摄取的转染物质的比率，提供了精确的对转 染密度定量测量或作图的方法。
086迄今为止，micro-PET成像信号的量化仍是通过在给定的 组织位置中积累的示踪物的量(用注射量和所检验組织的质量标准化， MID/g)来测量。在体内，心脏质量只能基于总体重来推断。此处我们 验证了 rF]FHBG积累(用于定量报告基因表达)和「F]FDG积累(用 于活心肌的代谢成像)的连续PET成像方法。我们比较了示踪物积累 的量(通过「F]FHBG的。/。ID/g相对^ID ["F〗FHBG/ %ID ["F]FDG的比 率评估)与转基因和蛋白表达水平(通过离体定量RT-PCR和蛋白质印 迹分析评估)之间的相关性。HSVl-sr39tk基因和蛋白表达与。/ilD ["F]FHBG〃oID TF]FDG的比率的相关性显著比它与[18F] FHBG的。/。ID/g
25的相关性更紧密(分别是r2 = 0.95相对r2 - 0.92， P < 0.05，和 r2 - 0. 94相对r2 - 0.91， P < 0. 05 ) 。 IL-10基因和蛋白表达与WID
「F]FHBG/ %ID [18F]FDG的比率的相关性也显著比它与[18F]FHBG的 。/。ID/g的相关性更强(分别是r2 = 0. 97相对r2 - 0.88， P < 0.05， 和r2 = 0. 95相对r2 = 0. 91， P < 0. 05，在图4C中)。
087考虑报告子-治疗性连锁的基因转移的治疗功效和副作用。 在p. o.d.第2， 34， 6， 8， 12， 20和28天监控的2小时期间，报告 子-治疗性连锁的基因转移不影响同系移植物(在近交的新西兰兔的第 三代上进行心脏移植)中的RV和LV收缩压或者心率。没有发现明显 的致心律失常效应。我们还检验了报告子-治疗性连锁的转基因是否会 削弱免疫抑制基因治疗的功效。在图5A的柱状图中，心脏同种异体移 植物的存活从用空脂质体或pCMV-HSVl-sr39tk处理的同种异体移植 物中的7 ± 1天增加到用pCMV-HSVl-sr39tkpCMVhlL-10或 pCMVhlL-10处理的同种异体移植物中的28 ± 7天。图5A-5F展示了 心脏同种异体移植物中报告子-治疗性连锁的基因转染对心脏功能和 基因治疗功效的影响。图5A是心脏同种异体移植物(用空脂质体(Lip; n-15)，脂质体-pCMVsr39、k (Lip-TK; n=15)，月一质体-pCMVhIL-lO
(Lip-IL-10; n=15 )或脂质体-PCMVsr39tk-CMVhIL-10 ( Lip-TK-IL-10; n=l5)处理)中平均存活的比较的柱状图。在图5B的显微照 片中，在用与报告基因连锁或不连锁的治疗性基因处理的同种异体移 植物中，排斥反应评分也相同程度的改善，图5B是p.o.d.第8天在 心脏同种异体移植物(用空脂质体(Lip),脂质体-pCMVsr39tk
(Lip-TK )，脂质体-pCMVhIL-10 ( Lip-IL 10 )或脂质体 -pCMVsr39tk-CMVhlL-10 (Lip-TK- IL 10)处理)的左心室组织中的 代表性组织学检查所见(H&E染色)。我们在用报告子-治疗性连锁的 基因或单独用治疗性基因处理的同种异体移植物中发现相同程度的淋 巴细胞渗透减少(图5C的图)，图5C是心脏同种异体移植物(受空 脂质体(Up; n=15)，脂质体-pCMVsr39tk (Lip-TK; n=15 ),脂质 体-pCMVhIL-lO( Lip-IL-10; n=15 )或脂质体-pCMVsr39tk-CMVhIL-10(Lip-TK- IL-10; n=15)影响)中的排斥反应评分的比较的柱状图。 在图5D的柱状图中，我们发现LV收缩压在治疗性基因处理的和报告 子-治疗性连锁的基因处理的心脏同种异体移植物中改善至相同程度， 图5D是心脏同种异体移植物中CD3+淋巴细胞渗透(被脂质体 -pCMVhIL-10基因治疗和报告子-治疗性连锁的基因治疗减少)的比较 的柱状图。在图5E的柱状图中，我们在报告子-治疗性基因转移组中 没有观察到致心律失常效应，图5E是心脏同种异体移植物(用空脂质 体(Lip; n-15)，仅脂质体-治疗性基因(Lip-IL-10; n=15 )或报告 子-治疗性连锁的基因治疗(Lip-TK- IL-10; n=15 )处理)中的LV 收缩压与心脏同系移植物中(n=15， 'P < 0.05)和没有任何处理的同 种异体移植物中(n-15, "P < 0.05)的LV收缩压的比较的柱状图。 收缩压在p.o.d.第4天记录。图5F心律失常事件的柱状图，其包括 在重新灌注后24小时时心脏同种异体移植物(用空脂质体(Lip; n=15),仅脂质体-治疗性基因(Lip-ILIO; n=15 )或报告子-治疗性 连锁的基因治疗(Lip-TK- IL 10; n-15 )处理)，心脏同系移植物(n-15 ) 和没有任何处理的同种异体移植物(n=15)中的室上性心动过速，心 '房震颤和纤维性颤动以及室性心动过速和纤维性颤动。连续记录ECG 1 小时。值表达为总事件的百分比。
088鉴于上述结果，可以认识到，我们的结果首次证明PET 报告基因成像可应用于非侵入性地监控和定量冠状动脉内递送的治疗 性转基因在整个心脏中的表达。对于该方法，构建一个能够实现平衡 且紧密相关的双基因表达的载体是重要的。虽然之前使用内部核糖体 进入位点(IRES)的双顺反子方法展示了由腺病毒携带的2个PET报 告基因良好的相关性，但是IRES下游的转基因表达通常被削弱了 。双 向转录载体利用了在其中治疗性和报告基因每一个均由包含四环素响 应元件的巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的载体；但是需要融合蛋白以 共表达。在本研究中，包含由2个相同启动子驱动的报告子和治疗性 基因的栽体能够在靶向的心肌中诱导平衡且共定位的报告子和治疗性 转基因的表达。全面的评价证实在一个质粒中报告子和治疗性基因的连锁不改变任一个基因的转移效率且对于间接的治疗性基因表达的成
像是可行的。相反，当我们使用2个不同的启动子时，由CMV启动子 驱动的报告基因的表达水平比由SV40启动子驱动的治疗性基因更高 (未发表的观察资料)。
089除了报告基因表达和报告探针活性之间的强相关性之外， 报告子和治疗性基因和蛋白表达之间的紧密相关性为间接监控治疗性 基因表达(通过用PET报告探针对连锁的报告基因成像)奠定了基础。 在之前的研究中，病毒效价与2个共转染的报告探针的积累的相关性 很差，这据认为是由于可变的腺病毒运输。脂质体介导的基因转移在 靶向的器官中诱导了稳定并且均匀的转基因表达，这可能也在转基因/ 蛋白表达和报告探针的积累之间的优秀的相关性中起了一定的作用。
090利用整个心脏PET报告探针积累图像，心脏灌注的PET 成像不再需要定位心脏的位置。但是，["F]FDG的积累代表着具有更 好的转录和翻译功能的活肌细胞。["8F]FHBG/ TF]FDG的比率代表着 转染的细胞占总活肌细胞的比例，可用于真正的基因转移效率的定量。 心肌中，T8F]FHBG/ ["F]FDG比率与报告子和治疗性基因和蛋白表达 的优秀的相关性暗示了优于用体重标准化的标准摄取值(°/JD/g )的优 点。
091对于PET成像，报告子转基因的图象低信号(由于与腺病 毒相比低5倍的脂质体的基因转移效率)是主要的负担。本研究中使 用的Micro-PET-P4系统，其针对兔和灵长类PET扫描而设计，不仅具 有与之前的micro-PET系统相比大约4倍的轴向观察视野，还具有高 4倍的灵敏度，这补救了脂质体的低效率。另一方面，在本研究中冠 状动脉内基因递送诱导了报告子和治疗性基因的扩散分布。这是与心 肌内注射的由腺病毒携带的报告基因(在所有之前的研究中，其集中 在针侧周围并且在非常小的区域内产生高信号)相比通常低信号的另 一个原因。然而，在整个心脏中均匀分布的转基因/蛋白表达和 ["F]FHBG积累极大地促进了治疗性基因表达的非侵入性和定量的PET 成^f象的临床应用。092脂质体介导的报告子-治疗性连锁的基因转移消除了病毒 诱导的自身免疫反应，使我们能够验证长期PET报告基因/探针成像的 可能性。报告基因产物的免疫原性已经成为一个关键，但是因为病毒 栽体或质粒-cDNA本身的使用，它从未被证实。我们展示了，脂质体 介导的报告子-治疗性连锁的基因转染具有与单独的治疗性基因转染 相同的量级和动力学。在这2组中，CD3+渗透保持相同。所有这些发 现表明，腺病毒，而非报告基因产物，才是导致自身免疫反应和瞬时 报告基因表达的原因。我们的结果也表明，报告基因及其产物在心脏 同系移植物和同种异体移植物中并没有显著的副作用。转移成对的报 告子和治疗性基因不削弱兔异位功能心脏同种异体移植物移植模型中 IL-1(H秀导的免疫抑制的治疗功效。
093作为主要的免疫抑制细胞因子和抗炎症试剂，IL-10具有 治疗同种异体移植物排斥的潜能。但是，移植后全身性施用IL-10不 展示任何益处，这主要是因为显著的多向性效应，尤其是它对B细胞 和激活的CD8+T细胞的免疫刺激效应。之前在啮齿类动物和兔中的研 究表明，重組IL-10基因在移植的心脏中的定位表达可能有助于预防 和治疗移植中的主要问题，例如急性排斥反应和加速的同种异体移植 物冠状动脉粥样硬化。由于临时离体保存的技术需要，获得的器官使 它们本身易于进行遗传工程操作。在心脏移植物的收获和植入之间的 这段时间提供了用于治疗性基因离体冠状动脉内递送的唯一机会，以 从生物学上修饰移植物并为局部或器官特异的免疫抑制做好准备，尤 其在避免全身性副作用和需要常规的全身性免疫抑制的时候。之前的 研究已表明离体冠状动脉内基因递送的基因转移效率比体内冠状动脉 内基因递送的基因转移效率高3至5倍。体内基因递送中巨大的全身 性分散是造成低的局部治疗性基因表达，高的异位基因转染和在临床 试验中缺乏成功的原因。虽然脂质体介导的离体冠状动脉内基因递送 的效率仍然相对低，但是可溶性IL-10在整个心脏中均匀分布。在同 种异体移植物中过表达的IL-10的功效比在腺病毒介导的离体基因转 移中观察到的更高并且作用时间也持续得更久得多。特别地，在器官获得期间20分钟的离体冠状动脉内基因递送的方法在临床上是可应 用的。本申请报道的非侵入性报告子-治疗性连锁的转基因PET成像系 统可在进一步证实免疫抑制细胞因子或其他治疗性基因疗法在大型动 物的心脏移植中的药物代谢动力学和药物效应动力学的过程中起到关 键作用。
094总之，非侵入性定量报告子-治疗性基因表达和活心肌细 胞完善了用于潜在地表征人基因治疗的药物代谢动力学的真正非侵入 性转基因量化系统。更重要地，这个离体冠状动脉内非病毒载体介导 的定位PET报告子-治疗性基因靶向方法的安全特性提供了用于临床 应用的显著优点。
095那些具有本领域常规技术的人可以做出改变和修改而不脱 离本发明的实质和范围。因此，必须理解，所陈述的例举的实施方案 仅是为了举例，不应被认为是把本发明限制为由以下发明及其各种实 施方案所限定的。
096因此，必须理解，所陈述的例举的实施方案仅是为了举例， 不应被认为是把本发明限制为由以下权利要求所限定的。例如，虽然 在下文在确定的组合中陈述权利要求的元素，但是必须清楚地理解， 本发明包括其他更少，更多或不同元素的组合，其在上文中被公开(即 使在这些组合中最初没有被主张) 2个元素在主张的组合中结合的 教导应进一步理解为还允许一种如下的主张的组合，即其中2个元素 不是互相结合，而是可以单独使用或在其他组合中结合。本发明任何 被公开的元素的删除被明确地预期为在本发明的范围之内。
097本说明书中用于描述本发明及其各种实施方案的言语将理 解为不仅在它们通常定义含义的意义上，还包括根据本说明书中特定 定义，超过通常定义含义范围的材料和行动。因此，如果一个元素在 本说明书的上下文中可以被理解为包括多于1个含义，那么它在权利 要求中的使用必须理解为属于由本说明书和词语本身支持的所有可能 的含义。
O98因此，以下权利要求的言语或元素的定义在本说明书中被
30定义为不仅包括字面上陈述的元素的組合，还包括所有等价的结构， 材料或行动，用于以基本相同的方式进行基本相同的功能以荻得基本
相同的结果。因此在这个意义上，预期在下述权利要求中可以用2个 或更多的元素的等价替代物代替任一个元素，或者在权利要求中一个 元素可以替代2个或更多的元素。虽然在上文元素可以被描述为在确 定的组合中起作用，甚至最初可以同样被主张，但是应清楚地理解来 自一个主张的组合的一个或更多元素可以在一些情况中从组合中切除 并且主张的组合可以被指向亚组合或亚组合的变种。
099从主张的主题的非实质变化(如具有本领域常规技术的人 所见)，不管现在已知的还是将要设计的，都被清楚地预期为相当于 在本发明的范围之内。因此，现在或即将为具有本领域常规技术的人 员所知的显而易见的替代物被定义为在定义的元素的范围之内。
100因此权利要求应理解为包括上述特别例举和描述的那些事 物、概念上的等价物、可以显而易见替代的那些事物和本质上纳入本 发明的本质想法的那些事物。
权利要求
1、在用于非侵入性地监控离体和/或体内递送的转基因表达的方法中的改进，包含对报告基因表达定量成像以推断转染的基因在靶向的组织，器官或细胞中表达的水平，位置和持续时间，其中所述报告基因与所述转染的基因连锁。
2、 根据权利要求1的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 使报告基因与转染的基因在质粒栽体上，在细胞中或在DNA上连锁， 其中所述报告基因与所述转染的基因连锁。
3、 根据权利要求1的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对与治疗性基因连锁的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因与 所述转染的基因连锁。
4、 根据权利要求1的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对与诊断性基因连锁的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因与 所述转染的基因连锁。
5、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对与用作治疗性基因的相同基因连锁的报告基因表达定量成像，其中 所述报告基因与所述转染的基因连锁。
6、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对与用作治疗性基因的不同基因连锁的报告基因表达定量成像，其中 所述报告基因与所述转染的基因连锁。
7、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对多于一个报告基因的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因与 所述转染的基因连锁。
8、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 使用放射性药物对与报告基因的基因表达相互作用的闪烁成像，其中 所述报告基因与所述转染的基因连锁。
9、 根据权利要求1的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 通过正电子成像术、Y照相机或单光子发射计算断层照相法进行定量成像，其中所述报告基因与所述转染的基因连锁。
10、 根据权利要求1的改进，进一步包含提供具有平衡的报告子/治疗性转基因表达的报告子-治疗性基因连锁的转基因栽体。
11、 根据权利要求10的改进，其中提供具有平衡的报告子/治疗性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因载体包含在单一质粒中提供疱渗病毒胸苷激酶(HSn-tk )和2个相同巨细胞病毒(CMV )启动子以及一个报告基因和一个治疗性基因。
12、 根据权利要求10的改进，其中提供具有平衡的报告子/治疗 性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因载体包含在单一质粒中 提供2个或多个相同或不同的启动子以及一个报告基因和2个或多个 治疗性基因。
13、 根据权利要求l的改进，进一步包含用脂质体封装，以减少 免疫反应和增加报告子和治疗性连锁的基因转移的效率。
14、 根据权利要求10的改进，其中提供具有平衡的报告子/治疗 性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因载体包含提供2个相同 的EF-1 oc启动子以及一个报告基因和2个或更多的治疗性基因。
15、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 将FHBG用于野生型HSVl-tk和HSVl-sr39tk PET报告基因的体内成像。
16、 根据权利要求1的改进，进一步包含提供具有平衡的报告子/ 治疗性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因载体并且其中提供 具有平衡的报告子/治疗性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因 载体包含提供与载体复合的阳离子脂质体，所述载体包含单纯疱渗病 毒1型突变体胸苷激酶(HSVl-sr39tk)作为报告基因和重组人免疫抑 制细胞因子白介素-10 (hIL-10)作为治疗性基因。
17、 根据权利要求16的改进，进一步包含包括PET报告探针9-(4-rF]-氟-3-羟甲基丁基)鸟嘌呤(["F]FHBG)和报告基因。
18、 转基因組合物，用于非侵入性地监控离体和/或体内递送的转 基因的表达，其包含一个报告基因；包含于报告基因且能够用正电子成像术、Y照相机或单光子发射计算断层照相法成像的基因探针；和至少一个与所述寺艮告基因连锁的转染的基因。
19、 根据权利要求18的组合物，其中与转染的基因连锁的报告基 因在质粒载体上，在细胞中或在DNA上。
20、 根据权利要求18的组合物，其中对报告基因表达定量成像包 含对与治疗性基因连锁的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因 与所述转染的基因连锁。
21、 根据权利要求18的组合物，其中对报告基因表达定量成像包 含对与诊断性基因连锁的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因 与所述转染的基因连锁。
22、 根据权利要求18的组合物，其中对报告基因表达定量成像包 含对与用作治疗性基因相同的基因连锁的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因与所述转染的基因连锁。
23、 根据权利要求l的组合物，其中对报告基因表达定量成像包 含对与用作治疗性基因不同的基因连锁的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因与所述转染的基因连锁。
24、 根据权利要求18的组合物，其中对报告基因表达定量成像包 含对多于一个报告基因的报告基因表达定量成像，其中所述报告基因 与所述转染的基因连锁。
25、 根据权利要求18的组合物，其中基因探针包含放射性药物， 用于对与报告基因的基因表达相互作用的闪烁成像。
26、 根据权利要求18的组合物，进一步包含具有平衡的报告子/ 治疗性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因栽体。
27、 根据权利要求19的组合物，其中报告子-治疗性连锁的转基 因载体包含在单一质粒中的疱渗病毒胸苷激酶(HSVl-tk)和2个相同 的巨细胞病毒(CMV)启动子。
28、 根据权利要求19的组合物，其中报告子-治疗性连锁的转基 因载体包含2个相同或不同的启动子和其中所述组合物进一步包含在单一质粒中的2个或多个治疗性基因。
29、 根据权利要求18的组合物，进一步包含脂质体封装，以减少 免疫反应和增加报告子和治疗性连锁的基因转移的效率。
30、 根据权利要求19的组合物，其中报告子-治疗性连锁的转基 因载体进一步包含提供2个相同EF-1 oc启动子以及一个报告基因和2 个或更多治疗性基因。
31、 根据权利要求18的组合物，进一步包含具有平衡的报告子/ 治疗性转基因表达的阳离子脂质体复合的报告子-治疗性连锁的转基 因载体，所述转基因载体包含单纯疱渗病毒1型突变体胸苷激酶(HSVl-sr39tk)作为报告基因和重组人免疫抑制细胞因子白介素-IO (hIL-10)作为治疗性基因。
32、 根据权利要求18的组合物，进一步包含与载体复合的阳离子 脂质体和包括关于所述报告基因的PET报告探针9- (4-["F]-氟-3-羟 甲基丁基)鸟嘌呤(["F]FHBG)。
33、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对2个或更多报告基因表达定量成像，以推断转染的基因表达在乾向 的组织，器官或细胞中的水平，位置或持续时间，其中报告基因与2 个或多个转染的基因探针连锁。
34、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对报告子-治疗性连锁的转基因栽体的表达定量成像，所述转基因载体 的表达通过在质粒中具有定位于报告基因和治疗性或诊断性基因之间 的双向启动子的平衡的报告子/治疗性转基因或平衡的报告子/诊断性 转基因表达诱导。
35、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对平衡的报告子治疗性转基因的表达定量成像，或对成比例的报告子 和治疗性或诊断性转基因的表达定量成像。
36、 根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 对靶向的器官，组织或细胞中的转基因或异位转基因表达定量PET成 像。
37、根据权利要求l的改进，其中对报告基因表达定量成像包含 通过同时测量代谢探针的表达和治疗性或诊断性转基因的表达以及比 率化测量值对器官、组织或细胞的强烈转染密度的比率定量成像。
全文摘要
用于非侵入性监控用于治疗疾病的、离体和体内递送的治疗性转基因表达的方法中的组合物，包括对在质粒载体上与治疗性基因结合的报告基因表达定量成像的步骤，以推断在靶向的组织或器官中治疗性基因表达的水平、位置或持续时间。使用用于对与报告基因相互作用的基因表达闪烁成像的放射性药物对报告基因成像，即正电子成像术、γ照相机或单光子发射计算断层照相法。用脂质体封装的、具有平衡的报告子/治疗性转基因表达的报告子-治疗性连锁的转基因载体递送基因。转基因组合物包括与治疗性基因或由脂质体封装的报告子-治疗性连锁的转基因载体并入和递送的基因连锁的报告基因。
文档编号C12Q1/68GK101460631SQ200780010158
公开日2009年6月17日 申请日期2007年3月20日 优先权日2006年3月21日
发明者L·森, S·S·甘姆伯黑尔 申请人:加利福尼亚大学董事会