专利名称：：一种苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法
技术领域：
：本发明属酶的发酵领域，特别是涉及一种苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法。
背景技术：
：苎麻，昔时称"中国草"，苎麻织物具有吸湿散热快，通风透气，易洗快干，穿着凉爽，强力高，能抑菌防腐、膨胀率大、导电小等特点，因此苎麻纺织品历来为名贵纺织品之一。苎麻与其同类纤维的相似之处，都是茎纤维。但在其它方面，既有不同之处，又有许多缺点，在苎麻利用过程中造成很多困难譬如别的麻只要用水沤茎，就可以使韧皮纤维与中央木质部分离，而苎麻则不能，苎麻茎的单宁物质有很强的防腐性，可抑制沤麻细菌的繁殖。因此苎麻纤维的剥制必须依靠机械或很强的化学药剂才能完成。脱胶是苎麻纺织的重点，提高苎麻纤维可纺性和染色效果的关键在于脱胶质量。为了将苎麻资源优势变为产品优势，必须提高麻的加工精度，开创好的脱胶加工工艺。目前苎麻脱胶常用的方法是碱液煮练的化学方法。使用强酸和强碱的高温高压或常温常压煮练,会使精干麻刚性大，抱合力差,织物手感粗硬,服用刺痒；还造成大量化工原料和能源的消耗，生产成本高，环境污染严重等自身不可避免的问题，所以亟待建立一种经济、安全、高效的生物脱胶方法。国内外生物脱胶方面的研究主要是利用微生物或酶处理苎麻纤维，如中国农科院采用果胶酶产生菌进行脱胶；山东大学用果胶酶进行脱胶；武汉大学用嗜碱芽孢杆菌产生的果胶酶进行脱胶，日本用果胶酶和纤维素酶混合进行脱胶，美国有研究者用含真菌果胶酶的弱酸性溶液脱胶。但是这些技术方法都存在酶类单一，酶活性不高，生产成本高，效率低；工艺条件未被优化，生产周期长等不足，使得生物脱胶的探索仅局限在实验室或停留在中试阶段，未能产业化。由于苎麻胶质复合体结构复杂，因此需要纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶等脱胶酶系协同作用才可达到效果，而且这几种酶均具有一定的可诱导性。但目前的研究仅以果胶质和半纤维素(木聚糖)为主攻对象，没有充分考虑到纤维素在胶质中的作用。
发明内容本发明的目的是提供一种苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，该方法针对苎麻胶质中各种成分，以苎麻为原料对菌种进行诱导产酶，获得可降解苎麻中多组分的复合酶并以多酶协同作用以达到最优的脱胶效果。本发明中里氏木霉木聚糖酶等半纤维素酶的产量较高，且能产生纤维素酶和果胶酶，可以通过调节产酶培养基中的碳氮比进而调控纤维素酶和木聚糖酶的活力比例，达到苎麻脱胶酶的最适配比，同时通过严格控制脱胶时间以减小纤维素酶对苎麻纤维的过度影响。本方法成本低廉，操作简便，易于工业化生产。本发明的一种苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，包括如下步骤(1)里氏木霉苎麻脱胶酶系的诱导制备将里氏木霉种子培养基在25~30°C，120-250r/min条件下培养40~48小时，以4~10%接种量转接至含1~5%苎麻粉的发酵培养基产酶，培养过程中可以通过添加苎麻粉进一步诱导产酶，在2530'C，120250r/min条件下培养67天，过滤，离心得粗酶液；所述的里氏木霉种子是里氏木霉RutC30(7Wcto&mare"e/RutC30)，购自美国ATCC，编号ATCC56765，其种子培养基为1%葡萄糖，0.1~1%蛋白胨，0.05%拧檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN;所述的里氏木霉产酶培养基为0.1~1%葡萄糖，0.1~1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN，添加1~5%苎麻粉，pH5.0;所述的培养产酶过程是间歇分批式的、分批补料式的或连续培养式。(2)测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力①纤维素酶活力测定(a)粗酶液中还原糖的测定0.2mL粗酶液+0.8mL蒸馏水+1.5mL3，5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min，冷却后加4mL蒸馏水，550nm处测得ODj;(b)粗酶液与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应后总还原糖的测定0.2mL粗酶液+0.8mL1%CMC-Na溶液(用50mM，pH4.8的醋酸缓冲液配制)，50'C水浴10min后加入1.5mLDNS，沸水浴5min;冷却后加4mL蒸馏水，550nm处测得0D2;(c)A0D二0D2—0D^l个酶活力单位(1U)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生lpmol还原糖(以葡萄糖计)的酶量，酶活(U/mL)=扁遷0><""，式中，K为标180x10准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为ng的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间(min)。②木聚糖酶活力测定(a)粗酶液中残糖含量测定0.5mL适当稀释粗酶液+1mL水+3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL，550nm处测得ODi;(b)粗酶液与木聚糖反应后总还原糖测定0.5mL经适当稀释的粗酶液(对所有样品稀释度恒定)+1mLl。/。木聚糖溶液(100mM，pH4.8的柠檬酸缓冲溶液配置)，5(TC水浴30min，力n3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL，550nm处测得OD2;(c)AOD二OD2—ODi，一个木聚糖酶活力单位(1U)定义为每分钟生成1pmol,木糖所需的酶量，酶活(U/mL)=雄x難由W，式中，K为标准曲线斜率，N为稀释倍150x30数，1000为mg转化为网的系数，150为木糖的分子量，30为反应时间(min)。③果胶酶活力测定(a)底物空白1mL0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)+6mL0.5%聚半乳糖醛酸(由100mM，pH5.0的柠檬酸缓冲液配制)；(b)酶液空白1mL酶液+6mL0.1M柠檬酸缓冲液；(c)反应液lmL酶液+6mL0.5。/。聚半乳糖醛酸；(d)37。C水浴60min，冰水中冷却中止反应，分别吸取100pL到新试管中(置于冰上)；加入2mLColorReagentA(40g无水Na2C03溶于600mL去离子水，加入16g甘氨酸，搅拌至溶解后再加入0.45gCuSCV5H20溶解后定溶于1L)禾a2mLColorReagentB(1.2g新铜试剂-HCl溶解于lL去离子水中，贮存于棕色试剂瓶中4""C保存)，倒置混匀；沸水浴13min，冷却后加2mL水，倒置混匀；450nm处测定吸光值(水做空白)。底物空白、酶液空白和反应液的吸光值分别为ODi，OD2和OD3。(e)AOD-OD3—OD2—OD!，一个果胶酶活力单位(1U)定义为每分钟生成1pmolD-半乳糖醛酸所需的酶量，酶活(U/mL)=廳x画x"W，式中，K为标准曲线斜率，212x60N为稀释倍数，1000为mg转化为吗的系数，212为D-半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间(min)。(3)用发酵获得的粗酶液处理苎麻用200mL自来水将3g原麻煮沸30min，再用粗酶液处理(浴比1:20~28，温度30~50。C，转速40~80rpm，时间20~24h)，处理后用100mL水洗3~5次后在6080'C条件下烘约2h，得到处理后的精干麻。本发明中纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的活力测定的反应原理纤维素酶和木聚糖酶分别能够将各自的底物羧甲基纤维素钠和木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。由于反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中酶活力成正比，因此，可以通过分光比色测定反应液颜色的强度，从而计算反应液中相应酶的活力。果胶酶活力的测定原理与上同，只是果胶酶的底物为聚半乳糖醛酸，显色剂为ColorReagentA和ColorReag6ntBo本发明中通过在培养过程中添加麻粉来诱导里氏木霉合成纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，通过调整改变培养基的碳氮比来优化诱导合成的粗酶液中纤维素酶和木聚糖酶等半纤维素酶的活力比例。本发明的有益效果本发明利用方便易得且价格低廉的麻为原料诱导里氏木霉生产苎麻脱胶复合酶系。通过对发酵原料及其各成分配比的控制，生产出适合于苎麻脱胶的混合酶，并用生产的酶处理苎麻，为纺织工业中苎麻生物脱胶工艺改良提供新的思路和途径。利用诱导的粗酶液处理苎麻，比常规的碱处理反应条件温和；纤维离散度较高；对环境友好。本方法可得到较高的酶活，更适合麻脱胶的复合酶体系，而且安全环保，操作简单，可控性强。图1是实施例1-3中纤维素酶活力测定结果；图2是实施例1-3中木聚糖酶活力测定结果图3是实施例1-3中果胶酶活力测定结果。其中，图l-3中，(參)代表实施例l，(▲)代表实施例2，(■)代表实施例3。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.苎麻化学组分测定试验采用中华人民共和国国家标准GB5889-86中的苎麻化学成分定量分析方法，对本试验所用苎麻原麻进行分析。所得结果如表1所示，与文献报道的结果较为相符。表1苎麻化学成分定量分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.里氏木霉的种子培养(1)里氏木霉种子培养基1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN;(2)以里氏木霉(7>e"e/)RutC30为生产菌株，在pH5.0，3(TC，200r/min条件下培养48h。3.里氏木霉发酵产酶(1)里氏木霉产酶培养基0.1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN，添加2%苎麻粉，pH5.0;(2)以10%接种量，未加苎麻粉的培养为对照，在3(TC，160r/min条件下培养7d诱导产酶；(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是苎麻脱胶复合酶液。4.纤维素酶活力测定(1)粗酶液中还原糖的测定0.2mL粗酶液+0.8mL蒸馏水+1.5mLDNS，沸水浴5min，冷却后加4mL蒸馏水，550nm处测得0D1;(2)粗酶液与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应后总还原糖的测定0.2mL粗酶液+0.8mL1%CMC-Na溶液，50。C水浴10min后加入L5mLDNS，沸水浴5min;冷却后加4mL蒸馏水，550nm处测得OD2;(3)厶0D-0D2—0D!，l个酶活力单位(1U)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生lnmol还原糖(以葡萄糖计)的酶量。(u/mL)=扁x難x"iV180x10式中K为标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为吗的系数，180为葡萄糖的分子量，IO为反应时间(分钟)。5.木聚糖酶活力测定(1)粗酶液中残糖含量测定0.5mL适当稀释粗酶液+lmL水+3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL，550nm处测得ODi;(2)粗酶液与木聚糖反应后总还原糖测定0.5mL适当稀释粗酶液+1mLP/。木聚糖溶液，5(TC水浴30min，力卩3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL，550nm处测得OD2;(3)AOD=OD2—ODp—个木聚糖酶活力单位(1U)定义为每分钟生成1nmol木糖所需的酶量。酶活(U/mL)=-150x30式中K为标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为吗的系数，150为木糖的分子量，30为反应时间(miti)。6.果胶酶活力测定(1)底物空白lmL0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)+611^0.5%聚半乳糖醛酸；(2)酶液空白lmL酶液+6mL缓冲液；(3)反应液6mL0.5M聚半乳糖醛酸+lmL酶液；(4)37匸水浴60min，冰水中冷却中止反应，分别吸取100到新试管中(置于冰上)；加入2mLColorReagentA(40g无水Na2C03溶于600mL去离子水，加入16g甘氨酸，搅拌至溶解后再加入0.45gCuS045H20溶解后定溶于1L)和2mLColorReagentB(1.2g新铜试剂-HCl溶解于lL去离子水中，贮存于棕色试剂瓶中4'C保存)，倒置混匀；沸水浴13min，冷却后加2mL水，倒置混匀；450nm处测定吸光值(水做空白)。底物空白、酶液空白和反应液的吸光值分别为OD^OD2和OD3。(5)AOD=OD3—OD2—ODi，一个果胶酶活力单位(1U)定义为每分钟生成1萨01D-半乳糖醛酸所需的酶量。駄、工/TT,T、A(9Dx層0xii:xiV酶活(U/mL)=-212x60式中K为标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为吗的系数，212为D-半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间(min)。7.粗酶液处理苎麻用200mL自来水将3g原麻煮沸30min，然后在浴比1:24，温度40'C，转速50rpm的条件下用自制粗酶处理24h，反应结束后用100mL水洗5次，在8(TC条件下烘约2h，得到精干麻。实施例21.里氏木霉的种子培养(1)里氏木霉种子培养基1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN;(2)以里氏木霉RutC30为生产菌种，在pH5.0，30°C，200r/min条件下培养48h。2.里氏木霉发酵产酶(1)里氏木霉产酶培养基0.5%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN，添加2%苎麻粉，pH5.0;(2)以10%接种量，未加苎麻粉的培养为对照，在3(TC，160r/min条件下培养7d诱导产酶；(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是苎麻脱胶复合酶液。3.纤维素酶活力测定，详见实施例l。4.木聚糖酶活力测定，详见实施例l。5.果胶酶活力测定，详见实施例l。6.粗酶液处理苎麻，详见实施例l。实施例31.里氏木霉的种子培养(1)里氏木霉种子培养基1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN;(2)以里氏木霉RutC30为生产菌种，在pH5.0，30'C，200r/min条件下培养48h。2.里氏木霉发酵产酶(1)里氏木霉产酶培养基1%葡萄糖，0.1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN，pH5.0;(2)以10°/。接种量，在30。C，130r/min条件下培养7h诱导产酶；(3)过滤或离心收集的发酵液清液就是苎麻脱胶复合酶液。3.纤维素酶活力测定，详见实施例l。4.木聚糖酶活力测定，详见实施例l。5.果胶酶活力测定，详见实施例l。6.粗酶液处理苎麻，详见实施例l。通过比较实施例1至实施例3的酶活测定结果可知(见图l、图2、图3),里氏木霉可通过在培养基中添加苎麻粉诱导产生苎麻脱胶复合酶系，用诱导产生的酶液处理苎麻，可以得到离散度较好的麻纤维；而未加苎麻粉诱导的粗酶液处理效果远不如诱导产生的酶液。此外，发酵培养基中的碳氮比也会影响到纤维素酶和木聚糖酶的产量，生产中可以根据需要调整碳氮比例以达到最佳的脱胶酶系。实施例2中的碳氮比例较实施例1提高了5倍，前者中纤维素酶活最大为3.2U/mL，木聚糖酶活最大为2.5U/mL，而后者中纤维素酶活最大为0.8U/mL，木聚糖酶活最大为35U/mL。权利要求1.一种苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，包括下列步骤(1)里氏木霉苎麻脱胶酶的诱导制备将里氏木霉种子培养基在25～30℃，120～250r/min条件下培养40～48小时，以4～10％接种量转接至含1～5％苎麻粉的发酵培养基产酶，在25～30℃，120～250r/min条件下培养6～7天，过滤，离心得粗酶液；(2)测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力；(3)用发酵获得的粗酶液处理苎麻用水将原麻煮沸后，用步骤(1)中的酶液处理20～24小时，其中浴比1∶20～28，温度30～50℃，转速40～80r/min，处理后用水洗涤，60～80℃烘干，得处理后的精干麻。2.根据权利要求1所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述的里氏木霉种子是里氏木霉RutC30，其种子培养基为1%葡萄糖，0.1~1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN。3.根据权利要求1所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵培养基为-0.1~1%葡萄糖，0.1~1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel，smediumN，添加15%苎麻粉，pH5.0。4.根据权利要求1所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述的纤维素酶活力测定步骤(a)粗酶液中还原糖的测定0.2mL粗酶液+0.8mL蒸馏水+1.5mL3,5-二硝基水杨酸DNS，沸水浴5min，冷却后加4mL蒸馏水，550nm处测得ODu(b)粗酶液与羧甲基纤维素钠CMC-Na反应后总还原糖的测定0.2mL粗酶液+0.8mL以50mM，pH4.8的醋酸缓冲液配制的1%CMC-Na溶液，50。C水浴10min后加入1.5mLDNS，沸水浴5min;冷却后加4mL蒸馏水，550nm处测得0D2;(c)A0D二0D2—0Dj1个酶活力单位定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1tmiol葡萄糖还原糖的酶量，酶活U/m卜磨x，"xiV，式中，K为标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg180x10转化为吗的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间min。5.根据权利要求1所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述的木聚糖酶活力测定步骤-(a)粗酶液中残糖含量测定0.5mL稀释粗酶液+1mL水+3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL,550nm处测得OD"(b)粗酶液与木聚糖反应后总还原糖测定0.5mL经稀释的粗酶液+以100mM，pH4.8的柠檬酸缓冲溶液配制的1mL"/。木聚糖溶液，5(TC水浴30min，力[]3mLDNS，沸水浴5min，冷却后加水定容至25mL，550nm处测得0D2;(c)A0D-0D2—0Dj一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1pmol木糖所需的酶量，酶活U/mL=，x画"xiV，式中，K为标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为ng的150x30系数，150为木糖的分子量，30为反应时间min。6.根据权利要求1所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述的果胶酶活力测定步骤(a)底物空白1mL0.1MpH5.0柠檬酸缓冲液+以100mM，pH5.0的柠檬酸缓冲液配制的6mL0.5%聚半乳糖醛酸；(b)酶液空白1mL酶液+6mLO.lM柠檬酸缓冲液；(c)反应液lmL酶液+6mL0.5y。聚半乳糖醛酸；(d)37'C水浴60min，冰水中冷却中止反应，分别吸取100到试管中，置于冰上；加入2mLColorReagentA和2mLColorReagentB，倒置混匀，沸水浴13min，冷却后加2mL水，倒置混匀，450nm处测定吸光值，并以水为空白，底物空白、酶液空白和反应液的吸光值分别为ODi，OD2和OD3。(e)厶OD-OD3-OD2-OD1一个果胶酶活力单位定义为每分钟生成1^1111010-半乳糖醛酸所需的酶量，酶活<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>，式中，K为标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为吗的212x60。系数，212为D-半乳糖醛酸的分子量，60为反应时间min。7.根据权利要求6所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述的ColorReagentA是以40g无水Na2C03溶于600mL去离子水，加入16g甘氨酸，搅拌至溶解后再加入0.45gCuS04'5H20溶解后定溶于1L所配制的溶液，ColorReagentB是以1.2g新铜试剂-HCl溶解于1L去离子水中所配制的溶液。8.根据权利要求1所述的苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，其特征在于，所述的培养产酶过程是间歇分批式的、分批补料式的或连续培养式。全文摘要本发明涉及一种苎麻脱胶复合酶的发酵诱导制备方法，步骤包括(1)里氏木霉苎麻脱胶酶系的诱导制备；(2)测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力；(3)用发酵获得的粗酶液处理苎麻。本发明可得到较高的酶活，更适合麻脱胶的复合酶体系，而且成本低廉，操作简便，易于工业化生产。文档编号C12N9/24GK101186907SQ20071017193公开日2008年5月28日申请日期2007年12月7日优先权日2007年12月7日发明者枫洪,坤钟申请人:东华大学