专利名称：无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产植物甾醇酯的方法。
背景技术：
植物甾醇是一种具有生理功能的天然产物。许多文献报道甾醇起到预防心血管疾病 的作用，因为它能有效降低有害低密度胆固醇(LDL)的水平，但游离甾醇在水和油中的 溶解度小限制了它的应用，植物甾醇在应用中存在以下问题1)结晶形式使其在人体 内的溶解性和生物可利用性比较差；2)不溶于水，在油中的溶解度也很小，给应用于 食品工业带来困难。由于植物甾醇酯具有良好的脂溶性，所以将植物甾醇与脂肪酸酯化 后转化成油溶性的植物甾醇酯，能够解决在食品工业中应用的限制。另外由于油酸等脂 肪酸本身就具有很好的生理功能，所以脂肪酸的甾醇酯则可兼具两者的功效，降低血清 胆固醇和甘油三酯效果更佳，能更好地发挥植物甾醇的生理功能。
目前植物甾醇酯一般采用化学法合成和酶法催化合成两种方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制作工序简单、成本低的无溶剂系统中固定化全细胞酶 催化生产植物甾醇酯的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产 植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步骤
1) 固定化全细胞酶的制备
(1) 将葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)按常规方法配制成(10)2 (10)4孢子悬浮液，得葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉2.0%，菜籽油0.3 0.6%， 磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钠0.4%，水95.2 95.5%;选取 全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合，得摇瓶培养 基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成3 5mm泡沫颗粒，备用；
(4) 按100ml摇瓶培养基中加1 3ml葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)孢子悬浮液， 100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3 0.5g，将葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)和聚 氨酯在摇瓶培养基中，26 30℃条件下培养40 60h;取出长满葡枝根霉(Rfuzopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶，备用；
2) 酯化将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置 于水浴恒温振荡器中在温度40 60℃、转速100 300r/min的条件下进行酯化反应，反应时间46 50h，得酯化后的反应产物；其中，油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量 比为3 7: 1;固定化全细胞酶为下述(1)油酸、月见草油或食用大豆油，(2)甾醇， 二种质量之和的1.0 1.7%;
3)离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，离心后的上层液为植物甾醇酯 产品；离心后的固体物冷冻干燥，得固定化全细胞酶，可重复使用。
步骤3)所述的离心分离的条件是2000 4000rpm，离心10 20min。
步骤3)所述的冷冻干燥的条件是-10 0°C， lmbar，干燥时间3 5小时。
本发明与化学合成法相比，无溶剂全细胞酶催化合成有2个优点1)反应选择性高， 反应过程中副产物少；2)反应条件温和，整个生产过程在常温下进行，可以有效避免多 元不饱和脂肪酸的氧化。本发明与有机相脂肪酶合成法相比，无溶剂全细胞酶催化合成 有2个优点1)采用全细胞，免除了脂肪酶的分离、提取、纯化和固定化等复杂工序， 是克服目前脂肪酶生产、应用成本高的有效途径之一；2)无溶剂体系可以在生产过程中， 不需要任何有机溶剂。这不仅可以在生产工艺中免除了有机溶剂脱除，是一种绿色环保 的工艺路线。有利于今后的产品开发；而且不会产生不利于消费者身体健康的残余有机 溶剂。
产生脂肪酶的生物全细胞作为催化剂(简称固定化全细胞酶)，即将产脂肪酶的微生 物细胞固定在聚氨酯泡沫颗粒中，进行发酵培养后，收集聚氨酯泡沫颗粒，经过简单处 理后即可作为一种生物催化剂，催化脂肪酸、油脂和植物甾醇转化生成植物甾醇酯。
本发明的有益效果是
1) 制作简单本发明制作工序简单，不需要复杂设备；将供试菌株进行发酵培养后，收集固定菌体进行干燥。
2) 降低成本以固定化全细胞酶催化剂的形式利用脂肪酶，既省去了脂肪酶的分 离提取、纯化和固定等工序，也避免在此过程中的酶损失，节省了大量设备投资、运行 费用，适用于工业化生产。
3) 技术先进固定化全细胞酶催化剂代替脂肪酶用于转酯催化剂；本发明采用大 分子载体，固定后的葡枝根霉细胞容易收集而且具有脂肪酶活性。
4) 多次使用采用固定化全细胞酶催化剂回收率高，可重复使用。
5) 环保无溶剂，具有很强的环保概念，且可以解决化学方法难以解决的问题。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内 容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，它包括如下步骤
1)固定化全细胞酶的制备
(1)将市售的葡枝根霉Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成102孢子悬浮液，
4
得葡枝根霉(i /^o; w"to/o"z:/^)孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，过30 目)2.0%，菜籽油(市售)0.3%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢 钠0.4%，水95.5%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢 钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成3mm泡沫颗粒，备用；
(4) 按100ml摇瓶培养基中加lml葡枝根霉(及Wzo;nwWo/om;/^)孢子悬浮液，100ml 摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3g，将葡枝根霉(及/^o/7^Wo/omy^)和聚氨酯在摇瓶 培养基中，26'C条件下培养40h;取出长满葡枝根霉(i /^o/7";^to/om;/^)的聚氨酯泡沫 颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶(催化剂)，备用；
2) 酯化将油酸中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器中在温 度40'C、转速100r/min的条件下进行酯化反应，反应时间46h，得酯化后的反应产物； 其中，油酸与甾醇的质量比为3: 1;固定化全细胞酶为下述(1)油酸，(2)甾醇， 二种质量之和的1.0%;
3) 离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，4000rpm， 20min，离心后的上 层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，-l(TC， lmbar，干燥时间5小时，得 固定化全细胞酶，可重复使用。植物甾醇酯产品经气相色谱测定甾醇的酯化率为62.2%。
实施例2:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，它包括如下步骤
1) 固定化全细胞酶的制备
(1) 将市售的葡枝根霉(朋加;^加/o"!;/bO按常规方法配制成103孢子悬浮液， 得葡枝根霉(朋/zo戶sWo/omy^)孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，过40 目)2.0%，菜籽油(市售)0.5%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢 钠0.4%，水95.3%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢 钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成4mm泡沫颗粒，备用；
(4) 按100ml摇瓶培养基中加3ml葡枝根霉(i^/zo;nw Wo/omy^)孢子悬浮液，100ml 摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.4g，将葡枝根霉(i WzopwWo/omy^)和聚氨酯在摇瓶 培养基中，28'C条件下培养48h;取出长满葡枝根霉(及/^印"sWo/om/w)的聚氨酯泡沫 颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶(催化剂)，备用；
2) 酯化将油酸中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器中在温 度5(TC、转速200r/min的条件下进行酯化反应，反应时间48h，得酯化后的反应产物； 其中，油酸与甾醇的质量比为5: 1;固定化全细胞酶为下述(1)油酸，(2)甾醇，二 种质量之和的1.5%;
3) 离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，2000rpm，离心10min，离心后的上层液为植物甾醇酯产品，离心后的固体物冷冻干燥，0°C， lmbar，干燥时间5小时, 得固定化全细胞酶，可重复使用。
实施例3:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，它包括如下步骤
1) 固定化全细胞酶的制备-
(1) 将市售的葡枝根霉(rhizopus stolonifer)按常规方法配制成103孢子悬浮液， 得葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，过30
50目)2.0%，菜籽油(市售)0.5%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.3%，磷酸二 氢钠0.4%，水95.3%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二 氢钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成4mm泡沫颗粒，备用；
(4) 按100ml摇瓶培养基中加2ml葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，100ml 摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.4g，将葡枝根霉(rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶 培养基中，28'C条件下培养48h;取出长满葡枝根霉(rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫 颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶(催化剂)，备用；
2) 酯化将月见草油中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器中 在温度50'C、转速200r/min (转/分钟)的条件下进行酯化反应，反应时间48h，得酯化
后的反应产物；其中，月见草油与甾醇的质量比为5: 1;固定化全细胞酶为下述(1) 月见草油，(2)甾醇，二种质量之和的1.5%;
3) 离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，3000rpm，离心15min，离心后 的上层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，0'C， lmbar，干燥时间3小时， 得固定化全细胞酶，可重复使用。植物甾醇酯产品经气相色谱测定甾醇的酯化率为55.5%。
实施例4:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，它包括如下步骤 1)固定化全细胞酶的制备
(1) 将市售的葡枝根霉(rhizopus stolonifer)按常规方法配制成104孢子悬浮液， 得葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，过50 目)2.0%，菜籽油(市售)0.6%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢 钠0.4%，水95.2%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢 钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成5mm泡沫颗粒，备用；
(4) 按100ml摇瓶培养基中加3ml葡枝根霉(rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，100ml 摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.5g，将葡枝根霉(rhizopus stolonifer)。和聚氨酯在摇瓶 培养基中，30'C条件下培养60h;取出长满葡枝根霉(rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡
沫颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶(催化剂)，备用；
2) 酯化将月见草油中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器中 在温度6(TC、转速300r/min的条件下进行酯化反应，反应时间50h，得酯化后的反应产物；其中，月见草油与甾醇的质量比为7: 1;固定化全细胞酶为下述(1)月见草油， (2)甾醇，二种质量之和的1.7%;
3) 离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，4000rpm，离心20min，离心后 的上层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，0°C， lmbar，干燥时间4小时， 得固定化全细胞酶，可重复使用。
实施例5:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下 步骤
1) 固定化全细胞酶的制备
(1) 将市售的葡枝根霉(朋/zo戸s加/omy^)按常规方法配制成104孢子悬浮液， 得葡枝根霉(及Wzo/ ^Wo/om;/^)孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，过50目)2.0%，菜籽油(市售)0.6%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢 钠0.4%,水95.2%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢 钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成5mm泡沫颗粒，备用；
(4) 按100ml摇瓶培养基中加3ml葡枝根霉(i /n'zo戸;y Wo/om/er)孢子悬浮液，100ml 摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.5g，将葡枝根霉(朋加pMWo/om;/^)和聚氨酯在摇瓶 培养基中，3(TC条件下培养60h;取出长满葡枝根霉(i Wzo;7M Wo/om/er)的聚氨酯泡 沫颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶(催化剂)，备用；
2) 酯化将食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器 中在温度60"C、转速300r/min的条件下进行酯化反应，反应时间50h，得酯化后的反应产物；其中，食用大豆油与甾醇的质量比为7: 1;固定化全细胞酶为下述(1)食用大豆油，(2)甾醇，二种质量之和的1.7%;
3) 离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，4000rpm，离心20min，离心后 的上层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，-l(TC， lmbar，干燥时间5小时， 得固定化全细胞酶，可重复使用。植物甾醇酯产品经气相色谱测定甾醇的酯化率为39.0%。
实施例6:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，它包括如下步骤
1)固定化全细胞酶的制备
(1) 将市售的葡枝根霉(i Wzo/7M Wo/om/")按常规方法配制成103孢子悬浮液， 得葡枝根霉(及/^叩^ Wo/om/e。孢子悬浮液，备用；
(2) 摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉(烘干后粉碎，过40目)2.0%，菜籽油(市售)0.4%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢 钠0.4%，水95.4%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢 钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；
(3) 将聚氨酯剪切成4mm泡沫颗粒，备用;
(4) 按100ml摇瓶培养基中加2ml葡枝根霉(Rhizopus slolonifer)孢子悬浮液，100ml 摇瓶培养基中加聚氨酯泡沬颗粒0.4g，将葡枝根霉(Rhizopus slolonifer)和聚氨酯在摇瓶 培养基中，28t:条件下培养48h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus slolonifer)的聚氨酯泡沫 颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶(催化剂)，备用；
2) 酯化将食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器 中在温度48'C、转速200r/min的条件下进行酯化反应，反应时间48h，得酯化后的反应
产物；其中，食用大豆油与甾醇的质量比为5: 1;固定化全细胞酶为下述(1)食用大 豆油，(2)甾醇，二种质量之和的1.5%;
3) 离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，3000rpm，离心15min，离心后 的上层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，0°C， lmbar，干燥时间5小时， 得固定化全细胞酶，可重复使用。
权利要求
1.无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步骤1)固定化全细胞酶的制备(1)将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成102～104孢子悬浮液，得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，备用；(2)摇瓶培养基配制按各组份所占质量百分比全脂豆粉2.0％，菜籽油0.3～0.6％，磷酸氢二钾1.2％，硫酸铵0.3％，硫酸镁0.3％，磷酸二氢钠0.4％，水95.2～95.5％；选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；(3)将聚氨酯剪切成3～5mm泡沫颗粒，备用；(4)按100ml摇瓶培养基中加1～3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3～0.5g，将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中，26～30℃条件下培养40～60h；取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶，备用；2)酯化将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶，置于水浴恒温振荡器中在温度40～60℃、转速100～300r/min的条件下进行酯化反应，反应时间46～50h，得酯化后的反应产物；其中，油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量比为3～7∶1；固定化全细胞酶为下述(1)油酸、月见草油或食用大豆油，(2)甾醇，二种质量之和的1.0～1.7％；3)离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，离心后的上层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，得固定化全细胞酶催化剂。
2. 根据权利要求1所述的无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法， 其特征在于步骤3)所述的离心分离的条件是2000 4000rpm，离心10 20min。
3. 根据权利要求1所述的无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法， 其特征在于步骤3)所述的冷冻干燥的条件是-10 0°C， lmbar，干燥时间3 5小时。
全文摘要
本发明涉及一种生产植物甾醇酯的方法。无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步骤1)固定化全细胞酶的制备；2)酯化将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶，置于水浴恒温振荡器中在温度40～60℃、转速100～300r/min的条件下进行酯化反应，反应时间46～50h，得酯化后的反应产物；其中，油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量比为3～7∶1；固定化全细胞酶为下述(1)油酸、月见草油或食用大豆油，(2)甾醇，二种质量之和的1.0～1.7％；3)离心分离、干燥将酯化后的反应产物离心分离，离心后的上层液为植物甾醇酯产品。本发明工艺制作简单、成本低、多次使用、环保并可适于工业化生产。
文档编号C12P33/00GK101200754SQ20071016865
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月7日 优先权日2007年12月7日
发明者刘昌盛, 张银波, 江木兰, 胡小加, 董绪燕, 洪 陈, 芳 魏, 黄凤洪 申请人:中国农业科学院油料作物研究所