专利名称：：一种利用pcr-rflp技术快速鉴定斑潜蝇近似种的方法
技术领域：
：本发明涉及昆虫种类鉴定
技术领域：
，尤其涉及一种利用PCR-RFLP技术鉴定三叶斑潜蝇及其近似种的分子方法。
背景技术：
：斑潜蝇属(liriomyza)中，大约有100多种可为害或取食栽培作物和观赏作物，其中有20多种具有重要的经济意义。从世界范围看，危害最大的斑潜蝇有3禾中美洲斑潜虫黾(L.sativaeBlanchard)、南美斑潜虫黾(L.huidorensisBlanchard)禾口三口十斑潜虫蝇.(LtrifoiiBurgess)，目前这3禾中斑潜虫虽均已成功入侵我国，给我国的农业生产带来了巨大的经济损失；其中三叶斑潜蝇现在在我国已确定为检疫性有害生物，随着地区间农产品的频繁调运，其分布范围和危害程度更有扩大、加重的趋势。由于三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇及南美斑潜蝇在生态位上有重叠，几种斑潜蝇经常混合发生；在为害产品调运途中主要以蛹和幼虫的虫态存在，而待幼虫发育为成虫再进行形态鉴定需要2周以上时间；同时，它们的成虫体型微小，外部形态特征非常相似，在形态鉴定上难以准确把握，容易混淆，这给检疫、测报和防治等工作带来了困难，因此在检疫工作中迫切需要一种快速准确的鉴定方法。20世纪80年代以后，生化技术开始应用于斑潜蝇的分类鉴定，Zehender(1993)用淀粉凝胶技术进行了三叶草斑潜蝇、番茄斑潜蝇和南美斑潜蝇的鉴定；Collin(1996)利用醋酸纤维电泳区分了不同地区的南美斑潜蝇与三叶草斑潜蝇种群。随着科技的发展，电子显微镜也开始应用到斑潜蝇的分类研究中马瑞燕(1999)应用电子显微镜对美洲斑潜蝇及南美斑潜蝇的外部形态特征进行了观察，但这些技术鉴定周期较长，且操作复杂不利于斑潜蝇的快速检测。近年来，以PCR为基础的DNA测序技术的兴起和广泛应用，因此以DNA为基础，以分子生物学为实验手段，研究昆虫分类鉴定、类群遗传结构、系统发育和分子进化的昆虫分子系统学得到了很大发展，分子标记技术广泛应用于近似物种的鉴定。目前被广泛应用于昆虫的分类鉴定和系统发育研究中的标记基因有线粒体DNA(MitochondrialDNA，mtDNA)、核糖体DNA(RibosomalDNA，rDNA)和核蛋白编码基因(Nuclearproteincodinggenes)等，其中mtDNA禾口rDNA中多个标记基因在昆虫的分子系统研究中应用最广。由于mtDNA小、相对快的进化速率和母本的遗传特性使得它很适合于种群历史和亲缘关系相近的分类单元间进化的研究。mtDNA细胞色素氧化酶n(con)基因是昆虫分子系统进化应用较多的标记基因之一，其中包含进化速率较慢的保守片段和进化较快的可变区，既可用于系统进化研究，又可用于种类区分或者种下阶元的比较研究，适合于种内和近缘种间的系统关系研究。因此，COII基因越来越多地应用于昆虫的鉴定中，例如斑潜蝇近缘种的鉴定及系统发育研究。PCR-RFLP标记技术即聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)结合限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术。由于PCR-RFLP技术对样品纯度的要求不高，适用于个体分析，且快速而简便，因此在物种多态性检测、品种分类、物种鉴定、细菌病毒检测等方面得到广泛应用。在斑潜蝇鉴定方面，[1]AntonioM,AndreaL，BarbaraMetal.Polymerasechainrection-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaystodistinguishliriomyzahuidobresis(Diptera:Agromyzidae)fromassociatedspeciesonlettucecroppingsystemsinItaly.AnnalsoftheentomologicalsocietyofAmerica.2006，99(4):1268_1272.曾利用/V〃II跟6)7aBI内切酶进行南美斑潜蝇鉴定，但这两种内切酶只能够进行南美斑潜蝇的鉴定而不能用于三叶斑潜蝇同美洲斑潜蝇的区分，并且价格昂贵，一个样品需要$5。[2]SchefferS丄LewisML.Twonucleargenesconfirmmitochondrialevidenceofcrypticspecieswithinh'rio历j"za力i/j.c/a&re/5^'51.AnnalsoftheentomologicalsocietyofAmerica.2001，94(5):1177-1182.和[3]L.F.F.Kox，H,E.vandenBeldetal.Identificationofeconomicallyimportant2irj'o/zjzaspeciesbyPCR—RFLPanalysis.Bulletin0EPP/EPP02005，35:79_85.也分别利用了相关内切酶进行不同种斑潜蝇的鉴定，但他们选择的内切酶或是比较昂贵不常用，如5^el、^&pl等；或是不能进行多种斑潜蝇的准确区分，如历'"fl、fcoRV等，并且他们所检测的样本绝大部分来自国外，由于昆虫有地理种群差异的现象，所以他们所选择的内切酶是否适合于我国国内近似种斑潜蝇的鉴定还有待进一步验证。
发明内容本发明目的是针对三叶斑潜蝇与其外部形态极易混淆的近似种——美洲斑潜蝇与南美斑潜蝇进行区分鉴定时，采用的PCR-RFLP标记技术中所存在的，选用的内切酶或价格昂贵或不能清晰辨别这三种近似种斑潜蝇的缺陷；提出一种以合适的目的序列为鉴定依据，通过测序明确国内这三种常见近似种斑潜蝇相应序列间的差异，进而选择一种廉价、稳定的内切酶进行分析鉴定，以达到快速、准确、低成本鉴定区分三叶斑潜蝇及其近似种的方法。本发明目的通过以下技术方案得以实现。斑潜蝇DNA分子鉴定的COII(线粒体DNA细胞色素氧化酶II)特异性片断，其序列为SEQN0:1，SEQN0:2，SEQN0:3所示。一种利用PCR-RFLP技术快速鉴定斑潜蝇近似种的方法，该方法按如下步骤进行(1)分别提取三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇样品总DNA;(2)参照Liu(1992)设计的昆虫COII通用引物，进行PCR(聚合酶链式反应)扩增长度为805bp的DNA片段(图1)，引物序列为上游引物5'—ATTTCTAATATGGCAGATTAGTGCA—3'下游引物5'—ATATGGTTTAAGAGACCAGTACTT—3';(3)通过克隆、转化、测序三种近似种斑潜蝇分别获得COn序列，如SEQN0:1，SEQN0:2，SEQN0:3所示;(4)通过相关的分子生物学软件对歩骤(3)所得三种COII序列进行拼接、分析后，选择"rsl作为限制性内切酶；(5)利用DraI内切酶对纯化后的PCR产物进行酶切、电泳；通过酶切图谱进行三种近似种斑潜蝇的区分；(6)通过对不同虫态、不同寄主、不同地理种群的斑潜蝇及近似种豌豆彩潜蝇进行验证实验，以证实此内切酶的准确、稳定；其中，所述PCR反应条件如下体系50p1，反应液组成为10XTaqBuffer5ul，MgCl2(25mmol/L)4ul，dNTP(10mol/L)4ul，模版DNA(60ng/ul)lul，上下游引物(10umol/L)各2.5lU，TaqDNA聚合酶(TaKaRa)(5U/ul)0.25p1，灭菌ddH2030.75ul;反应程序为94"预变性5min;94'C变性30s，5(TC退火30s，72。C延伸60s;35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存;WddH20代替模板作空白对照。本发明的有益效果是①利用进行三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇跟南美斑潜蝇的C0II酶切鉴定，可准确区分国内这三种近似种斑潜蝇(图2)。②进行了三种斑潜蝇成虫、蛹、幼虫的酶切鉴定，得到的酶切电泳条带一致，因此利用内切酶进行分析不会受到昆虫虫态的干扰(图2)。③利用"rsl进行鉴定不会受到同三种斑潜蝇形态较为相似、在寄主上同斑潜蝇有重叠现象的豌豆彩潜蝇的影响，确保此内切酶的准确与稳定(图3)。④通过对不同地区、不同寄主三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇酶切分析，表明同种之间不同个体可保持很高的稳定性(图4)。⑤本方法鉴定快速仅需1个工作日即可；同时成本较低，进行一个样本的检测仅需4元左右。综上所述，本发明通过进行国内三种近似种斑潜蝇的C0II序列测定，进而选择稳定、准确、廉价的/ral内切酶进行鉴定，并且通过不同地理种群和不同虫态的斑潜蝇进行验证，明确本发明具有准确、稳定、快速、廉价等特点，可在检疫、测报、防治等相关部门应用，以实现对此三种近似种斑潜蝇的快速检测。图1三种斑潜蝇分别进行C0II基因PCR反应得到的805bpDNA序列其中Ls美洲斑潜蝇；Lt三叶斑潜蝇；Lh南美斑潜蝇图2三种斑潜蝇成虫、蛹和幼虫经Z^al内切酶酶切分析结果图；其中Ls美洲斑潜蝇；Lt三叶斑潜蝇；Lh南美斑潜蝇图3不同地区的三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇及南美斑潜蝇经ral内切酶酶切分析结果图4不同地区的豌豆彩潜蝇经"ral内切酶酶切分析结果图。注UM为未被酶切的COIIPCR产物，长805bp，M为100bpDNAladder(TaKaRa)具体实施方案以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。对所涉虫源、试剂等的说明试验中所用的3种斑潜蝇成虫为本实验室保持的实验种群，饲养所用的寄主植物均为菜豆(品种天马地豆)。其中三叶斑潜蝇于2007年4月采自浙江慈溪，经中国检验检疫科学院陈乃中研究员鉴定确认；美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇分别由中国农科院植保所刘万学副研究员和内蒙古农业大学庞保平教授惠赠。Tris:AMRESCOSDS:AMRESC0蛋白酶K:AMRESC0Tris饱和酚北京鼎国实施例1:(利用对三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇与南美斑潜蝇的C0II酶切鉴定)按以下步骤进行一、DNA提取和相关序列的获得取三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇成虫标本各1头，并分别按以下步骤提取DNA:取标本1头置于盛无菌水的1.5ml离心管中浸泡1h;取出标本，于100ul提取液(Tris:10mM，EDTA:lmM，SDS:1%，PH=8.0)中研磨，力口入2.5ul蛋白酶K(20mg/ml)于56。C水浴消化2h;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液抽提，取上清液加入2倍体积无水乙醇，沉淀DNA;最后用无菌水溶解DNA;-2(TC保存，作为PCR反应的模板。PCR反应条件如下体系50ul，反应液组成为IOXT叫Buffer5ul，MgCl2(25腿ol/L)4u1，dNTP(10腿ol/L)4u1，模版DNA(60ng/u1)1u1，参照LiuH.,BeckenbachAT.EvolutionofthemitochondrialcytochromeoxidaseIIgeneamong10ordersofinsects.MolecularPhylogeneticsandEvolution.1992,1:41-52.设计的，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的昆虫COII上、下游引物(10iimol/L)各2.5ixl，TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.25nl(TaKaRa)，灭菌ddH2030.75ul;反应程序为94。C预变性5min;94。C变性30s，50。C退火30s，72。C延伸60s;35个循环；最后72'C延伸10min，4。C保存。以ddH20代替模板作空白对照。PCR产物在1.0%琼脂糖电泳lh，溴化乙啶(EB)染色，凝胶成像系统拍照，lkbpDNAladder作分子量标记(图l)。具体步骤如下PCR扩增产物利用凝胶回收试剂盒(U-GENE，回收纯化；本实验用PromegapGEM⑧-TeasyVector试剂盒完成连接反应，用菌种DH5"制备感受态细胞，根据蓝白斑筛选阳性克隆，用筛选出的阳性克隆菌液抽提质粒，用^boRI酶切确定是否含有目的片段。最终将含有目的片段的克隆菌液送上海英骏(irwitrogen)生物技术有限公司进行序列测定。为了确保序列的准确性，本研究对样品进行克隆测序，每条DNA各取三个对应的重组质粒测序，每个重组质粒进行正反双向测序，最终的序列由三个质粒的序列综合而定，以保证序列的准确性。经以上步骤，分别取得SEQN0:1(三叶斑潜蝇C0II序列);SEQN0:2(美洲斑潜蝇C0II序列);SEQN0:3(南美斑潜蝇C0II序列)三种序列。二、内切酶选择及酶切分析序列的编辑、统计数据分析等通过DNASTAR公司的LaserGene软件完成；序列的拼接通过SeqMan软件完成；同源序列的搜索工作在GenBank数据库中利用BLAST程序完成；限制性内切酶的査找通过DNAman软件完成。纯化后3种斑潜蝇的扩增产物C0II在20iil酶切体系下，反应液组成为灭菌去离子水10ul，10Xbuffer2W，纯化后PCR产物7W，(lOUAil)lnl;37。C进行"ral(TaKaRa)酶切2h，10Xloadingbuffer终止反应，取酶切产物5uL，用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳完毕溴化乙啶(EB)染色，凝胶成像系统拍照，100bpDNAladder作分子量标记(图l)。从电泳图中电泳条带位置可明显区分三种斑潜蝇美洲斑潜蝇仅为一条805bp电泳条带；三叶斑潜蝇的C0II基因可被酶切为92bp，270bp，443bp三条带；南美斑潜蝇COII基因可被酶切为194bp，249bp，362bp三条带。三种斑潜蝇成虫通过克隆、转化、测序分别获得的COII序列图，如SEQNO:1，SEQNO:2，SEQN0:3所示，附后。实施例2:(利用内切酶对三种斑潜蝇不同虫态同种性的验证)三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇蛹与幼虫的DNA提取和相关序列的获得与实施例l成虫的做法相同；酶切鉴定，得到的酶切电泳条带与实施例1成虫相一致，因此，利用"_rsl内切酶进行区分分析不会受到昆虫虫态的干扰(图2)。实施例3:(利用"ral内切酶对豌豆彩潜蝇与三种斑潜蝇不同种的验证)由于同三种斑潜蝇形态较为相似的豌豆彩潜蝇在寄主上又同斑潜蝇有重叠现象，因此需要将豌豆彩潜蝇作为验证种进行验证；豌豆彩潜蝇经"ral酶切后(与实施例l相同)，其电泳条带明显不同于三种斑潜蝇酶切电泳条带，说明利用DraI内切酶进行鉴定不会受到混杂的豌豆彩潜蝇影响(图3)。实施例4:(三种斑潜蝇各自不同地区、寄主虫源同种性的验证)采用实施例1的方法同时对不同地区、不同寄主的三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇进行验证实验(表1)，得出同种之间不同个体可保持很高的稳定性，以此也表明采用"ral内切酶对本鉴定虫种进行酶切鉴定的准确性与稳定性(图4)。通过实施例1、2、3与4说明，利用DraI进行三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇跟南美斑潜蝇的COII酶切鉴定，可准确、快速地区分国内的三种近似种斑潜蝇。表1不同地区、不同寄主的三种斑潜蝇及彩潜蝇的验证结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表〈110〉中国计量学院〈120〉一种利用PCR-RFLP技术快速鉴定斑潜蝇近似种的方法<160〉3〈210〉1〈211〉805〈212>DNA<213〉来源于三叶斑王潜潜蝇(Liriomyzatrifolii(Burgess))<400〉1<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage13</sequence>ccgggtcgattaaatcaaaccaatttttttatcaatcgacctggtttattttalggac3a660tgttctgaaaUtgtggtgctttatgccaattgtgattgaaagagttcct720ttatcaaatgaatcataaat3atcatt3ggtggctg腿g780ca^gtactggtctcttaaaccatat805〈210〉3<211〉805〈212〉DNA〈213〉来、源于南美萝王潜虫黾(ZY,i(9/7/zs力〃/(3W7re/7sis(Blanchsrd))<400>3atttctaatatggcagattagtgcaatggatttaagctcctatttaactt60ttattagaataa^tgtcaacatgagctaatctaaatcttcttccccttta120atagaacaattaattttttttcatgatcatgctttaataattttagttataattacagta180ttagtcggtttactttattt111aataaatttacaaaccgactattatta240cacggacaaaaatctgaactattttacctgctattattcttttatttatt300gcttttccctctcttcgattgctttatttattagatgagatt朋tgaaccttcaattact360ttaaaggctattggtcaccastgatactg3agttatgaatattctgattttaataataat420atagaatttgaaaatgatgaatttcgatts■ttag已tgtagataatcgaacataaatactcaaattcgaattttagttaca540gctgc卿tgtattacactcttgaacagttcctgctctaggggtaaaggttgatgctacg600ccaggccgtttaaatcaaactaatttctttatt犯tcgaccaggattattttatggacag660tgttcagaaatttgtggggctttataccaaaagagttcct720tctgatatttcatcaaaaataattctaactaatcattagatgactgaaag780caagtactggtctcttaaaccatat80权利要求1、三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇DNA分子鉴定的COII特异性片断，其序列为SEQNO1，SEQNO2，SEQNO3所示。2、一种利用PCR-RFLP技术快速鉴定斑潜蝇近似种的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行(1)分别提取三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇样品总DNA;(2)昆虫COII基因通用引物，进行PCR扩增长度为805bp的DNA片段，引物序列为上游引物5'—ATTTCTAATATGGCAGATTAGTGCA—3'下游引物5'_ATATGGTTTAAGAGACCAGTACTT—3';(3)通过克隆、转化、测序分别获得COII序列，如SEQNO:1，SEQNO:2，SEQNO:3所示；(4)通过相关的分子生物学软件对步骤(3)所得三种COII序列进行拼接、分析后，选择"ral作为限制性内切酶；(5)利用DraI内切酶对纯化后的PCR产物进行酶切、电泳，通过酶切图谱进行三种近似种斑潜蝇的区分；(6)通过对不同虫态、不同寄主、不同地理种群的斑潜蝇及近似种豌豆彩潜蝇进行验证实验，以证实此内切酶的准确、稳定；其中，所述PCR反应条件如下体系50pl，反应液组成为10xTaqBuffer5pl，25mmol/L的MgCl24pl,10mmol/L的dNTP4^1,60ng/pl的模版DNAlpl,10pmol/L的上、下游引物各2.5^1，5U/pl的TaqDNA聚合酶0.25^1,灭菌ddH2030.75|il;反应程序为94。C预变性5min;94。C变性30s，50。C退火30s，72。C延伸60s;35个循环，最后72"延伸10min，4。C保存；以ddH20代替模板作空白对照。全文摘要本发明公开了一种利用PCR-RFLP技术快速鉴定斑潜蝇近似种的方法，属于昆虫种类鉴定
技术领域：
。该方法包括(1)三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇样品DNA的提取；(2)按昆虫COII基因通用引物进行COII基因的PCR反应，得到805bp的DNA序列；(3)通过克隆、转化、测序分别获得COII序列；(4)限制性内切酶DraI的选择；(5)通过酶切图谱进行三种近似种斑潜蝇的区分。本发明具有准确、稳定、快速、廉价等特点，可在检疫、测报、防治等有关部门应用，以实现对此三种近似种斑潜蝇的快速检测。文档编号C12Q1/68GK101200764SQ20071015706公开日2008年6月18日申请日期2007年11月28日优先权日2007年11月28日发明者俞晓平,商晗武,崔旭红,赵永旭申请人:中国计量学院