专利名称：阴道加德纳菌的选择性培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种阴道加德纳菌的选择性培养基及其制备方法。
背景技术：
阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis, GV)是女性细菌性阴 道炎(Bacterial Vaginosis, BV)最常见病原体，性接触传播疾病的 病原菌之一，自1955年由Gardner与Dukes从非特异性阴道炎患者 的标本中分离出该菌株以来，国内外不断有该菌引起的泌尿生殖系统 感染的报道。目前，由于阴道加德纳菌营养要求较高，首次分离需要 提供C02或无氧环境，给实验室常规分离带来困难，为此，国内开展 阴道加德纳菌培养的医院并不多，不利于阴道病的治疗。
培养基组分是人为提供给微生物的最重要的培养环境，是影响微 生物生长繁殖和代谢产物合成的重要因素。
目前所用的培养基国外(1)阴道琼脂培养基BBL公司的哥 伦比亚基础培养基中，加入1%蛋白胨，高压灭菌后加入5%人血。(2) 鉴别培养基Difco公司戈司曼培养基中，加际蛋白胨，高压灭菌后加 入萘啶酸30mg/L，多粘菌素B 20mg/L，新霉素40 mg/L。
国内(1)分离培养基牛肉汤100ml，蛋白胨lg， NaC10.5g， 吐温80 0.02ml ，琼脂1.2g，混合溶解调pH 7. 3， 12rC20min灭 菌。冷至50'C时，加入新鲜人血5 ml。 (2)改良人血哥伦比亚选择 性培养基取哥伦比亚琼脂19. 5 g，多蛋胨2. 5 g， 10 g/L胶木浸
膏溶于450ml蒸馏水，加热溶解调整pH为7. 0 7. 4.高压灭菌，冷却 至5(TC左右加入无菌人血30ml 、组合抑菌剂一瓶(含庆大霉素2. 0 mg、 二性霉素B 1.0 mg、萘啶酮酸15.0 mg)混匀倾注平板。
国外(1)阴道琼脂培养基和国内(1)分离培养基共同的缺点是 没有加细菌和霉菌的抑菌剂，由于阴道分泌物中有大量的杂菌，且生 长较快，培养过程中与加德纳菌争夺营养，致使加德纳菌生长不佳而 不易分离。
国外(2)鉴别培养基和国内(2)改良人血哥伦比亚选择性培养基， 虽培养基配方有所改进，但由于庆大霉素、萘啶酮酸对阴道加德纳菌 有抑制作用；庆大霉素对阴道加德纳菌的敏感率为80. 4%。本发明过 程中65株加德纳菌药敏试验结果庆大霉素敏感率为32. 3%，喹诺酮类 如环丙沙星敏感率为38. 5%。因此不利于加德纳菌的生长。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种阴道加德纳菌 的选择性培养基及其制备方法，具有能有效的将加德纳菌从革兰阳性 的葡萄球菌、链球菌、革兰阳性杆菌及各种霉菌中分离出来，从而快 速对加德纳菌进行检测，该培养基具备营养丰富、价格低廉、配制方 便的优点。
为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案， 一种阴道加德纳菌的选择性培养基，配制1000ml培养基的配方
如下
营养肉汤粉15-20g; 哥伦比亚琼脂35-44g; 吐温80 0. 2-0. 4ml
革兰染色l液(结晶紫液)0.05-0.075ml;
5氟胞嘧啶0. 02-0. 03g;
人血 50-80ml;
血浆 30-50ml;
蒸馏水加至1000ml 。
所述的配制1000ml培养基的优选配方如下
营养肉汤粉18g; 哥伦比亚琼脂39g; 吐温 80 0.3ml
革兰染色1液(结晶紫液)0. 05-0. 075ml; 5氟胞嘧啶0.03g; 人血50ml; 血浆50ml;
蒸馏水加至1000ml 。
所述的阴道加德纳菌的选择性培养基的制备方法，包括以下步
(1) 将营养肉汤，哥伦比亚琼脂，吐温80，革兰染色1液(结 晶紫液)，蒸馏水加的一起搅拌，并在12rC高压灭菌20min。
(2) 冷却到45 5(TC，然后加入5氟胞嘧啶，人血，血桨摇匀，
将培养基倒入平板中，冷却后倒置放于4 8"C冰霜中备用，保存时 间不能超过3周。
使用时，只需要将阴道分泌物涂布于该培养养基上，置含5% 1(FoC02环境35。C 37。C培养24 48小时，加德纳菌形成菌落为0. 5 0.8mm，淡紫色,光滑凸起，半透明，产生^溶血。
本发明的有益效果是本发明利用加德纳菌对结晶紫液和5氟胞 嘧啶的抵抗，以及在人血平板上产生^溶血环和在5% 10%<:02环境生 长，可有效的将其从革兰阳性的葡萄球菌、链球菌、革兰阳性杆菌及 各种霉菌中分离出来，从而快速对加德纳菌进行检测，克服现有培养 基所加入的抗菌素不利于加德纳菌生长，而不利于加德纳菌从阴道分 泌物中分离出来，以及加二性霉素B，多粘菌素B价格较高等缺点， 本发明是一种既有利于加德纳菌生长又能抑制其他细菌和霉菌生长 的选择性培养基，该培养基具备营养丰富、价格低廉、配制方便的优 占。
具体实施例方式
实施例1
培养基组成营养肉汤粉15g;哥伦比亚琼脂39 g;吐温80
0.3ml;革兰染色l液(结晶紫液)0.05ml;蒸馏水920ml; 5氟胞嘧 啶0.03g;人血50ml;血浆30ml (人、羊、兔均可)。将营养肉汤；
哥伦比亚琼脂；吐温80 ;革兰染色1液(结晶紫液)；蒸馏水加在
一起搅拌混匀，并在12rC高压灭菌20min。冷却到45 50。C，然后 加入5氟胞嘧啶，人血，血浆，摇匀，将培养基倒入平板中，冷却后 倒置放于4 8'C冰霜中备用；保存时间不能超过3周。
将含有加德纳菌、葡萄球菌、白色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌 的阴道分泌物涂布于上述制备的培养基上，置含5% 10%0)2环境35 。C 37。C培养24 48小时，加德纳菌生长良好，为0. 5 0. 8mm，淡 紫色，光滑凸起，半透明，产生^溶血的菌落。葡萄球菌生长不良，白 色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌不生长。
实施例2
培养基组成营养肉汤18 g;哥伦比亚琼脂44 g;吐温80 0. 3ml; 革兰染色1液(结晶紫液)O. 0625ml;蒸馏水910ml;5氟胞嘧啶0. 02g; 人血50ml;血浆40ml (人、羊、兔均可)。将营养肉汤；哥伦比亚琼 脂；吐温80 ;革兰染色1液(结晶紫液)；蒸馏水加在一起搅拌混
匀，并在12rC高压灭菌20min。冷却到45 50。C，然后加入5氟胞 嘧啶，人血，血浆，摇匀，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放于4 8"C冰霜中备用；保存时间不能超过3周。
将含有加德纳菌、葡萄球菌、白色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌 的阴道分泌物涂布于上述制备的培养基上，置含5% 10%0)2环境35 37"培养24 48小时，加德纳菌生长良好，为0.5 0.8mm，淡紫色， 光滑凸起，半透明，产生^溶血的菌落，葡萄球菌、白色含珠菌、革兰 阳性球菌、霉菌不生长。
实施例3
培养基组成营养肉汤18g;哥伦比亚琼脂39 g;吐温80 0. 3ml 革兰染色1液(结晶紫液)0. 05ml;蒸馏水900ml; 5氟胞嘧啶0. 03g;
人血50 ml;血浆50ml (人、羊、兔均可)。将营养肉汤；哥伦比亚 琼脂；吐温80 ;革兰染色1液(结晶紫液)；蒸馏水加在一起搅拌 混匀，并在12rC高压灭菌20min。冷却到45 50。C，然后加入5氟 胞嘧啶，人血，血浆，摇匀，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放于 4 8'C冰霜中备用；保存时间不能超过3周。
将含有加德纳菌、葡萄球菌、白色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌 的阴道分泌物涂布于上述制备的培养基上，置含5% 10%0)2环境 35 37。C培养24 48小时，加德纳菌生长良好，为0. 5 0. 8mm，淡 紫色，光滑凸起，半透明，产生》溶血的菌落，葡萄球菌、白色含珠菌、 革兰阳性球菌、霉菌不生长。
实施例4
培养基组成营养肉汤粉16.5g;哥伦比亚琼脂40 g;吐温80
0.2ml;革兰染色l液(结晶紫液)0.06ml;蒸馏水890ml; 5氟胞嘧 啶0.028g;人血80ral;血浆30ml (人、羊、兔均可)。将营养肉汤；
哥伦比亚琼脂；吐温80 ;革兰染色1液(结晶紫液)；蒸馏水加在
一起搅拌混匀，并在12rC高压灭菌20min。冷却到45 50。C，然后 加入5氟胞嘧啶，人血，血浆，摇匀，将培养基倒入平板中，冷却后 倒置放于4 8'C冰霜中备用；保存时间不能超过3周。
将含有加德纳菌、葡萄球菌、白色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌 的阴道分泌物涂布于上述制备的培养基上，置含5% 10%0)2环境35 37。C培养24 48小时，加德纳菌生长良好，为0.5 0.8mm，淡紫色， 光滑凸起，半透明，产生-溶血的菌落，未见其他杂菌生长。 实施例5
培养基组成营养肉汤粉17.2g;哥伦比亚琼脂39g;吐温80
0.3ml;革兰染色l液(结晶紫液)0.075ml;蒸馏水885ml; 5氟胞 嘧啶0.03g;人血72 ml;血浆43ml (人、羊、兔均可)。将营养肉 汤；哥伦比亚琼脂；吐温80 ;革兰染色1液(结晶紫液)；蒸馏水 加在一起搅拌混匀，并在12rC高压灭菌20min。冷却到45 50。C， 然后加入5氟胞嘧啶，人血，血桨，摇匀，将培养基倒入平板中，冷 却后倒置放于4 8。C冰霜中备用；保存时间不能超过3周。
将含有加德纳菌、葡萄球菌、白色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌 的阴道分泌物涂布于上述制备的培养基上，置含5% 10%0)2环境35 。C 37t:培养24 48小时，加德纳菌生长良好，为0. 5 0. 8mm，淡 紫色，光滑凸起，半透明，产生"溶血的菌落，未见其他杂菌生长。
实施例6
培养基组成营养肉汤20g;哥伦比亚琼脂39 g;吐温80 0. 3ml 革兰染色1液(结晶紫液)0. 05ml;蒸馏水905ml; 5氟胞嘧啶0. 02g; 人血65 ml;血浆30ml (人、羊、兔均可)。将营养肉汤；哥伦比亚 琼脂；吐温80 ;革兰染色1液(结晶紫液)；蒸馏水加在一起搅拌 混匀，并在12rC高压灭菌20min。冷却到45 50。C，然后加入5氟 胞嘧啶，人血，血浆，摇匀，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放于 4 8。C冰霜中备用；保存时间不能超过3周。
将含有加德纳菌、葡萄球菌、白色含珠菌、革兰阳性球菌、霉菌的阴道分泌物涂布于上述制备的培养基上，置含5% 10%0)2环境35 37。C培养24 48小时，加德纳菌生长良好，为0.5 0.8mm，淡紫色， 光滑凸起，半透明，产生"溶血的菌落，未见其他杂菌生长。
权利要求
1、一种阴道加德纳菌的选择性培养基，其特征在于配制1000ml培养基的配方如下营养肉汤粉 15-20g；哥伦比亚琼脂 35-44g；吐温80 0.2-0.4ml；革兰染色1液(结晶紫液) 0.05-0.075ml；5氟胞嘧啶 0.02-0.03g；人血 50-80ml；血浆 30-50ml；蒸馏水 加至1000ml。
2、 如权利要求1所述的阴道加德纳菌的选择性培养基，其特征 在于配制lOOOml培养基的配方如下营养肉汤18g; 哥伦比亚琼脂39g; 吐温80 0. 3ml革兰染色l液(结晶紫液)0.05ml; 5氟胞嘧啶0.03g; 人血50ml; 血浆50ml;蒸馏水加至1000ml。
3、 一种如权利要求1所述的阴道加德纳菌的选择性培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将营养肉汤，哥伦比亚琼脂，吐温80，革兰染色1液(结晶紫液)，蒸馏水加的一起搅拌，并在12rC高压灭菌20min;(2)冷却到45 50。C，然后加入5氟胞嘧啶，人血，血浆摇匀， 将培养基倒入平板中，冷却后倒置放于4 8"冰霜中备用，保存时 间不能超过3周。
全文摘要
本发明公开了一种阴道加德纳菌的选择性培养基，配制1000ml培养基的配方如下营养肉汤粉15-20g；哥伦比亚琼脂35-44g；吐温80 0.2-0.4；革兰染色1液(结晶紫液)0.05-0.075ml；5氟胞嘧啶0.02-0.03g；人血50-80ml；血浆30-50ml；蒸馏水加至1000ml；以及其制备方法。具有能有效的将加德纳菌从革兰阳性的葡萄球菌、链球菌、革兰阳性杆菌及各种霉菌中分离出来，从而快速对加德纳菌进行检测，该培养基具备营养丰富、价格低廉、配制方便的优点。
文档编号C12N1/20GK101173236SQ20071015702
公开日2008年5月7日 申请日期2007年11月22日 优先权日2007年11月22日
发明者吕旭军, 吴先华, 夏景洋, 遐 朱, 茅利明, 静 陈, 陈建江 申请人:中国医科大学绍兴华宇医院