专利名称：一种产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法
技术领域：
本发明涉及微生物育种方法，具体说涉及建立一种基于基因组改组技术进 行原生质体多亲本融合的方法。
背景技术：
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近年来，脂肪酶(lipase EC 3丄1.3)在工业应用方面取得了很大进展。碱性 脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪作 用等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛 的应用，并已成为世界酶制剂市场上重要的品种。但是与其它的水解酶，如蛋 白酶和淀粉酶相比，碱性脂肪酶出发菌在工业应用中还存在着酶热稳定性较差 的问题,影响了生产收率、产品的运输、以及进一步应用和开发。因此选育出具 有良好的热稳定性的碱性脂肪酶产生菌株是国际上研究热点。
2002年，美国加州Maxgen公司的Cardayr6等人提出了 Genome Shuffling技 术(国内翻译成"基因组改组")的概念，它把传统微生物诱变育种技术与细胞 融合技术结合，在微生物菌株诱变的基础上，通过细胞融合，使多个亲本杂交， 产生新的复合子代。其具体操作过程是通过对出发菌株进行诱变，然后在模拟 DNA重组的条件下对原生质体进行多亲本递推式多次融合(recursive protoplast): 最后筛选出具有多重正向进化标记的目标菌株。此技术的育种效果十分显著， 已有成功应用的报道。Cardayr6等人成功地运用Genome Shuffling技术，在短时 间内实现了快速提高泰乐菌素产生菌(&^ptom_ycw的产量的目标。Cardayr6等人仅花费一年时间就取得了相当于他人此前20年工作的成果;Ranjan Patnaik等应用基因组改组技术对一株乳酸杆菌的耐酸性进行改造，同样获得了 成功；MingHua Dai等应用基因组改组技术改良了 5^H'wgo6/wm c/2/orap/2e"o//c"w ATCC 39723,大大提高了降解杀虫剂中五氯苯酚的性能。上述工作，基本上集 中于原核微生物，在相关文献检索中尚未发现运用基因组改组技术改善真核微 生物代谢产物的性能，如酶的热稳定性等。
2007年，施碧红等首次将基因组改组技术用于研究真核微生物育种，取得提 高扩展青霉碱性脂肪酶产量的初步效果，改组得到的扩展青霉碱性脂肪酶与原 出发菌株相比产量有较大的提高。
发明内容
本发明的目的是以真核微生物为出发菌株，通过建立一种原生质体多亲本 融合方法，达到改善真核微生物代谢产物的性能，对扩展青霉碱性脂肪酶进行 改造，提高其产物碱性脂肪酶的热稳定性。
为实现本发明的目的采用的技术方案是以人工诱变的真核细胞菌和经筛 选具有一定优势性状的野生型真核细胞菌为出发菌株，采用细胞原生质体多亲 本融合方法，经培养斜面孢子、菌株诱变、基因组改组、筛选、递推式多次融 合，获得具有较好性状优势的菌株。具体通过以下步骤实现-
第一步培养诱变用斜面孢子
将菌株接种于斜面培养基中， 一段时间后，选取产孢子丰满的菌种斜面， 加水制备悬浮孢子，孢子量在5X 107/mL以上。
第二步菌株诱变
取5mL孢子悬液转移至培养皿中，于15W紫外线灯下照射20 35s。再从中
取2mL移至避光的试管中，加入终浓度为100iig/mL的NTG，于25 28。C水浴 中保温30min后，加入100mL无菌水中止诱变。将孢子悬液涂布于琼脂发酵培 养基平板上，25'C培养约45 70h，肉眼可见微小的菌落。用打孔器将菌落和培 养基一同取出(即琼脂块)，排列在灭菌培养皿中，培养至菌落占据琼脂块后， 将琼脂块移至橄榄油乳化液鉴定板上，28t:保温l—3d，观察透明圈大小，选取 透明圈较大的5株菌，接种至斜面培养，进一步摇瓶培养，测定酶活。
第三步基因组改组
原生质体的制备
将诱变后获得的5株优良菌株和1株野生型菌株,接种于斜面培养基，在 25 26'C的温度下培养2—3d后，选取产孢子丰满的菌种斜面，加水制备悬浮 孢子，孢子量在5X107mL以上。
在9cm培养皿中倒入菌丝生长培养基，冷却后覆盖灭菌玻璃纸，将以上孢 子悬液涂布其上.诱变多代后获得的优良菌株f 25 26。C培养19 20h，野生 型菌株于35-36。C培养15 16h。
用镊子将附有幼龄菌丝的玻璃纸揭下,反置于(将菌丝刮下也可)盛有DTT 溶液的培养皿中(4mL/皿)室温预处理半小时(DTT溶液以高渗溶液配制，终浓 度为0.01mol/L。 DTT购自上海丽珠东风生物工程有限公司)，离心。
将菌丝转移到盛有纤维素酶和蜗牛酶复合液的培养皿(4mL酶液/皿)中， 25°C处理3 3. 5个小时。从1. 5个小时起每隔0. 5个小时用玻片和血球计数板 计数并观察原生质体的形成。
用3层灭菌擦镜纸铺在直径7cm的漏斗中，过滤酶解处理后的原生质体和孢 子混合液，将滤液转移至2mL离心管，1000rpm离心lQ分钟，弃上清液。用高渗溶液洗涤沉淀并离心(1000 rpm， IO分钟)3次。原生质体供以下融合试验. 原生质体融合
用高渗溶液配制的30% PEG溶液加入到原生质体沉淀中，吹匀，将6株原 生质体集中到一个皿内，进行融合，融合10min,以高渗溶液稀释PEG处理后的 原生质体融合液，取一定的稀释液分离到事先制备好的双层高渗再生培养基上. 于3(TC培养约60-70 h，菌落上长出一定量孢子，供以下初筛.
第四步筛选
初筛
琼脂块培养法制备固体营养培养基平板,用灭菌的打孔器制作成许多单个
小琼脂块，排放在灭菌培养皿内，将以上分离在双层平板上单菌落的孢子用灭
菌牙签接种到这些小琼脂块上，于30'C培养箱中培养，让其充分生长和产酶， 然后依次将长满菌的小琼脂块移到橄榄油乳化液鉴定板上，35i:保温培养 15-20h,观察各菌落周围透明圈的大小，将透明圈大的菌落移接到斜面培养基 中。
复筛
1.先向60孔板上小管中加入发酵培养基，再将菌种接种于其中，3CTC， 250rpm摇床发酵50h。用灿烂绿滴入35'C保温发酵液中，含脂肪酶者显绿色， 显色越深酶活越高。同时将发酵液加入到橄榄油乳化液鉴定板(透明圈法)上， 35°。保温培养15-20h,观察透明圈的大小，将透明圈大的进行摇瓶法复筛。
2.将上述摇管法得到的菌株由斜面接种到30mL发酵培养基(250mL锥形 瓶)中，30°C， 230 rpm摇床发酵50h，下摇瓶，过滤，取发酵液。用如前所述 的灿烂绿和透明圈法鉴定，进一步用NaOH滴定法测定产酶情况。从中筛选到5株碱性脂肪酶热稳定性有一定提高的菌株。
第五步递推式多次融合
将第四步得到的热稳定性较高的菌株重复第三步和第四步的方法处理，得
到所产碱性脂肪酶热稳定性提高了 7。c的优良菌株B-888。 B-888所产碱性脂肪 酶在35。C下的酶活与亲本尸e/^ci7h'i/历e;^朋s咖FS8486所产碱性脂肪酶在28 "C下的酶活相当，但酶热稳定性提高7"C.
本发明所用的作为出发菌株的真核微生物和经筛选具有一定优势性状的野 生型真核微生物分别为碱性脂肪酶产生菌扩展青霉(尸e/7^i7.Z2'鹏^p朋s咖J FS8486 (酶热稳定性较低，最适作用温度28"C)和野生型Asper^7'"iAS ra历arh' FS-132菌株(酶热稳定性较高，最适作用温度45°C)。 二者均为福建师范大学 微生物工程研究所菌种室保藏菌种。
本发明所用的纤维素酶和蜗牛酶复合液酶液配方为0. 6%纤维素酶+0. 6%蜗 牛酶，以高渗溶液配制。纤维素酶和蜗牛酶均购自上海丽珠东风生物工程有限 公司。
本发明所用的高渗溶液配制的30% PEG溶液中PEG 6000购自中国医药集团 上海化学试剂公司。
本发明所用的培养基分别是
斜面培养基(%):蔗糖3， NaN03 0. 2， KC1 0.05，麸皮1.0，琼脂2.0， pH自然；
菌丝生长培养基同斜面培养基； 等渗再生培养基同斜面培养基；
高渗再生培养基以高渗溶液(0.6M NaCl + 0.3% CaCl2)代替自来水配制菌种斜面培养基，采用双层琼脂培养基；
发酵培养基(%):黄豆饼粉4.0，玉米淀粉0.8， NaN03 0.4， Na2HP04 0. 3。
图1: B-888分类学脂肪酸组成特征GC图谱。
图2:扩展青霉尸e/7J'c^"咖exp朋幼历FS8486分类学脂肪酸组成特征GC图谱。
图3:溜曲霉^s/ er^z77iAs 7^3w7 FS-132分类学脂肪酸组成特征GC图谱。
图4: B-888斜面培养基中正面菌落形态。
图5: B-888斜面培养基中反面菌落形态。
具体实施例方式
为了对本发明有分明确的理解。现结合实施例对本发明作进一步说明
第一步培养菌种初级诱变
将扩展青霉尸Penicillium expansum FS8486接种于菌种斜面培养基中，在 25。C下培养一段时间后，选取产孢子丰满的菌种斜面，加入适量的无菌水，制 备悬浮孢子，使孢子量在5X 107mL以上。
第二步菌株诱变
取5mL孢子悬液转移至灭菌培养皿中，于15W紫外线灯下照射30s。再从中 取2mL移至避光的试管中，加入NTG，终浓度为100ug/mL，于25'C水浴中保温 30min后，加入100mL无菌水中止。将处理后孢子悬液稀释，取一定稀释度，涂 布于发酵培养基平板上。25-C培养约30h，肉眼可见微小菌落。用打孔器将菌落 和培养基一同取出(即琼脂块)，排列在灭菌培养皿中，培养至菌落占据琼脂块
表面后，将琼脂块移至橄榄油乳化液鉴定板上，28'C保温2d，观察透明圈大小， 选取产生较大透明圈的菌落S3、 S4、 S6、 S7、 S8，接种至斜面中。
第三步基因组改组
制作由菌种诱变得到的尸e/7icj7h'咖expa/ s鹏变株S3、 S4、 S6、 S7、 S8 的斜面，25°。下培养一段时间；同时制作野生型溜曲霉Asperw'WM 7a鹏rh' FS-132的斜面，35'C下培养一段时间。待孢子生长丰满后，加入适量的无菌水， 制备悬浮孢子，使孢子量在5X 107mL以上。
第四步筛选
倒新鲜菌丝生长培养基于数个9cm培养皿中，上覆灭菌玻璃纸，将孢子悬 液(一定的稀释度)分别涂布其上，扩展青霉在25°。培养20h，溜曲霉35'C培 养16 h (每皿得到约80mg湿菌丝量)。
用灭菌的镊子将附有幼龄菌丝的玻璃纸揭下反置于或将菌丝刮下盛有DTT 溶液的培养皿中(4mL/皿)室温预处理0.5 h。
将6株菌种的菌丝混合后转移到盛有酶液的培养皿(4mL酶液/皿)中，室 温处理3 h。从1. 5 h起每隔0. 5 h用玻片和血球计数板计数并观察原生质体的 形成。
用3层灭菌擦镜纸套在直径7cm的漏斗中过滤酶解处理后的孢子液，将滤 液转移至2mL (或1.5mL)离心管，1000转离心10分钟，弃上清液。用高渗溶 液洗涤沉淀并离心(1000转，IO分钟)3次。
倒入含2%琼脂的高渗再生培养基10mL于培养基下层，将含0.8%琼脂的高 渗再生培养基置于5(TC的水浴中保温，保证其温度为50°C。
用PEG和微量移液器将离心管中的每株原生质体沉淀洗至灭菌培养皿。洗涤 时就开始计时，共10min后以9mL高渗液稀释PEG处理的原生质体液，稀释1(T 107mL共7个梯度。
先向已凝固的含2%琼脂的下层培养基上加入0. lmL稀释液(滴加10—3—1(T 共5个稀释度的稀释液，每个稀释度至少倒10皿)，再向每皿倒入6mL含0. 8% 琼脂的上层培养基，迅速在台面上摇开，使上层培养基和稀释液混匀。将培养 皿正置3(TC培养。
筛选
将发酵培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个小琼脂块，排放在灭菌培养 皿内，将基因组改组后培养皿上形成的菌落用灭菌牙签接种到这些小琼脂块上， 于3(TC培养箱中培养，让其充分生长和产酶，然后依次将长满菌的小琼脂块放 到橄榄油乳化液鉴定板上，35。C保温15-20h，观察各菌落周围水解透明圈的大 小，将透明圈大的菌落移接到斜面培养基中。
先向60孔板上小试管中加入发酵培养基，再将上述琼脂块法初筛得到的菌 种接种于其中，30°C， 250rpm摇床发酵60h。用灿烂绿法滴入发酵液，含脂肪 酶者显绿色，显色越深者酶活越高。同时用橄榄油乳化液鉴定板(透明圈法) 测定产酶酶活情况。将产生透明圈大的菌株接种至斜面培养基。
将上述摇管法得到的菌种由斜面接种到30mL发酵培养基(250mL锥形瓶) 中，30°C， 200/500 rpm摇床发酵50h，下摇瓶，过滤菌丝，取发酵液。用如前 所述的灿烂绿和透明圈法鉴定，测定产酶酶活情况。
通过以上筛选得到as9、 as22、 as29、 as50、 as73共5株菌株。
第五步递推式多次融合
将as9、 as22、 as29、 as50、 as73共5株菌株重复上述的"基因组改 组"和"筛选"步骤，得到B-888。
权利要求
1一种产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，包含有培养斜面孢子、菌株诱变、筛选的方法，其特征是以人工诱变的真核细胞菌和经筛选具有一定优势性状的野生型真核细胞菌为出发菌株，经过原生体制备和原生体融合为主的基因组改组、递推式多次融合，获得具有较好性状优势的菌株。
2、 根据权利要求1所述的产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，其特 征是所述的基因组改组中原生质体的制备时-1) 将优良菌株和野生型菌株，分别在25 26。C的温度下培养2—3d后，选 取产孢子丰满的菌种加水制备悬浮孢子；2) 将以上孢子悬液涂布于培养皿中，于25 26。C培养19 20h;将以上孢 子悬液涂布于培养基上，优良菌株于25 26"培养19 20h,野生型菌株于 35-36。C培养15 16h;3) 将幼龄菌丝置于盛有4mL/皿DTT溶液的培养皿中，室温预处理0. 5h，离心。4) 将菌丝转移到盛有复合酶液的量培养皿中，处理3 3.5 h;5) 过滤原生质体和孢子混合液，离心，弃上清液，用高渗溶液洗涤并再离 心3次；6) 将诱变多代后获得的优良菌株和野生型菌株，在25 26。C的温度下培养 2—3d后，选取产孢子丰满的菌种斜面，加水制备悬浮孢子，孢子量在5X107mL 以上。
3、 根据权利要求1所述的产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，其特 征是原生质体融合时1)将高渗溶液加入到制备好的原生质体沉淀中，吹匀；2) 取6株原生质体集中到一个皿内，进行融合，融合10min，以高渗溶液稀释；3) 取一定的稀释液分离到事先制备好的双层高渗再生培养基上.于3(TC培 养60 70 h，菌落上长出一定量孢子，供初筛。
4、 根据权利要求1所述的脂肪酶原生质体多亲本融合的方法，其特征是所 述的DTT溶液是用高渗溶液进行配制，终浓度为0. 01mol/L。
5、 根据权利要求1所述的产脂肪酶真菌原生质体多亲本融合的方法，其特 征是所述的递推式多次融合是指在第一次基因组改组、筛选的基础上的再次改 组与筛选。
全文摘要
本发明涉及微生物育种方法，具体说涉及建立一种基于基因组改组技术进行真核微生物原生质体多亲本融合的方法。为实现本发明的目的采用的技术方案是以人工诱变的真核微生物扩展青霉和经筛选具有一定优势性状的野生型溜曲霉为出发菌株，采用细胞原生质体多亲本融合方法，经培养斜面孢子、菌株诱变、基因组改组、筛选、递推式多次融合，获得具有较好性状优势的菌株。采用本发明建立的细胞原生质体多亲本融合方法，对高产碱性脂肪酶产生菌扩展青霉(Penicillium expansum)FS8486进行改造，获得1株产酶量与Penicillium expansum FS8486相近，但酶热稳定性提高7℃的优良菌株。
文档编号C12N15/04GK101195820SQ20071014401
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者何云霞, 吴松刚, 施巧琴, 施碧红, 峻 林 申请人:福建师范大学