专利名称：重组人源过氧化氢酶的制备方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种制备人源过氧化氢酶的方法。具体而言，本发明提供了一种采用 基因工程技术克隆人源过氧化氢酶基因，构建其表达质粒，转化细胞获得高产量人源 过氧化氢酶的方法。 技术背景-过氧化氢酶是一类在自然界需氧生物体内分布很广泛的酶，能高效的催化过氧化 氢生成分子氧和水。机体细胞呼吸过程中部分氧会被还原为HA， &02易被细胞内还原 剂还原为体内最强的一种氧化剂 0H自由基，体内也可通过Fenton反应和 HarbeWeiss反应产生。在病理情况下，HA累积，会造成过多 0H，产生严重的氧化 损伤，过氧化氢酶能消除由机体代谢过程中产生的H202，阻断，0H的累积，达到防止 氧化损伤的作用。自由基病理学的研究，发现了活性氧与许多人类疾病日益密切的联系，因此研究 如何清除活性氧成为一个热点。从机体自身的角度讲，主要有机体抗氧化酶、脂溶性 抗氧化剂、水溶性小分子抗氧化剂、蛋白抗氧化剂等组成了机体抗抗氧化防御系统。 作为抗氧化酶体系之一的过氧化氢酶受到更大关注。近年来，国外有关治疗性应用过氧化氢酶的研究报道逐步增加。例如AshokG叩ta 等人报道了过氧化氢酶能有效地减少肿瘤发生的细胞模型。有人用脂质体包埋的S0D 和CAT通过静脉注射的方式，使暴露于100%氧气中的小鼠存活率明显上升。Roscoe L. Warner等人用免疫复合物诱导急性肺损伤的大鼠模型，注射牛肝过氧化氢酶，可以 明显地减少炎症反应中嗜中性白血球及减轻肺泡的损伤。另外Joachim Ruh等人用非 类固醇类消炎剂吲哚美辛诱导炎性肠胃道疾病的大鼠模型，静脉注射过氧化氢酶，可 以很明显的减轻炎症区域的充血情况和减少了小动脉的血管直径，起到抗炎作用等。 在国内有人用CAT和SOD联合用药，对眼前段碱烧伤的治疗作了一定的探索。国外Holly等研究者曾测定长寿命的转基因鼠(the armes dwarf mouse-single point mutation in Prophet of pit-l gene)禾口同胞鼠体内各器官内Catalase表达
水平，结果转基因鼠在不同生长时间、在肝脏、肾、心脏内Catalase含量明显高于对 照鼠。国内也有通过调节过氧化氢酶水平，达到抗衰老目的相关报道。这些实验报道 给我们启示了过氧化氢酶可延缓机体衰老，可能有临床使用的可能性。但是，目前的研究试验所采用的基本上都为牛肝过氧化氢酶，或者是采用基因工 程表达的微生物来源的过氧化氢酶，尚未发现用人源过氧化氢酶通过外源性给药的方 式进行临床用途的试验的报道。为了解决基因同源性，避免外源蛋白引起的免疫反应 问题，必须采用人源过氧化氢酶和解决人源过氧化氢酶来源的问题，目前有研究拟从人组织中提取获得过氧化氢酶，但是由于来源受到限制以及疾病 源污染的问题，不能符合临床上的广泛用途。目前也尚见人源的过氧化氢酶在细菌， 酵母，昆虫等表达系统表达制备的报道。发明内容本发明的目的在于提供一种制备重组人源过氧化氢酶的方法。 本发明利用基因工程的手段制备重组人源过氧化氢酶。本发明所制备的人源过氧化氢酶产量高，高活性，生产方法简便，无疾病源污染的问题。本发明进一步目的是提供本方法制得的重组人源过氧化氢酶在抗氧化抗衰老中的用途。本发明提供的利用基因工程技术制备人源的过氧化氢酶的方法，其包含下述步骤 (1)将可编码人源过氧化氢酶的基因嵌入含适当转录启动子的表达载体中构建重组 质粒；(2) 将该重组质粒转化到适当的宿主细胞中；(3) 于适合该细胞表达过氧化氢酶的条件下培养该转化细胞；(4) 纯化所表达的人源过氧化氢酶。 基于人所有组织的过氧化氢酶基因均具有一致的基因同源性，本发明的方法除可以生产人胚胎肝细胞来源的过氧化氢酶外，还适用于人组织和血浆来源的所有过氧化 氢酶。本发明方法以基因库中的人源过氧化氢酶基因的DNA序列为基础设计引物，PCR 扩增各种人组织来源的过氧化氢酶基因，构建表达载体，转化宿主细胞，并令其表达 而制得。
扩增的人源过氧化氢酶基因以公知的方法插入表达载体中，包括任何可用于细菌， 酵母，昆虫表达系统的表达载体。例如PBR， PUC， PET， pPIC等载体，可根据需要选 用。构建完成的表达载体可以转化适当的宿主并进行表达。可用于本发明的宿主细胞 包括细菌大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌，酵母甲醇酵母，或是昆虫细胞果蝇表达 系统，家蚕表达系统，其中优选酵母表达系统，最优选毕氏甲醇酵母表达系统。所述 的毕氏甲醇酵母表达系统已于2006年9月26日保藏，保藏单位CGMCC,北京市海 淀区中关村北一条13号，保藏编号CGMCC No.1825,分类命名毕氏甲醇酵母^'c力is pastorj's 。转化的宿主细胞株于适宜该外来质粒大量表达的条件下培养，最后将产物分离。 依常法，硫酸铵沉淀，疏水层析，离子交换层析，获得95%的人源过氧化氢酶。采用本方法制备的过氧化氢酶可用于外源性抗感染如急性肺炎；抗氧化损伤如烧 伤等氧自由基引起的急性氧化损伤；抗衰老如抗长期氧自由基损伤引起的衰老等病理 状况和抗肿瘤等用途。
图1: RT-PCR扩增得到基因片段泳道l， RT-PCR扩增得到的基因片段，大小为1.6Kb， 泳道2， RT-PCR扩增得到的基因片段，大小为1.6Kb，泳道3， DNA Marker,从上到下为10000bp， 7500bp， 5000bp， 2500bp， 1000bp， 500bp，泳道4， RT-PCR的模版RNA。 图2: pPIC9k_CAT重组表达质粒构建。 图3:重组质粒的PCR鉴定泳道l: DNA Marker大小从2000bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp，泳道2:阳性对照，A0X引物PCR产物大小为2. 1Kb左右，泳道3:阴性对照，A0X引物，PCR产物大小为492bp，泳道4:重组质粒l， A0X引物，PCR产物大小为2.1Kb，泳道5:重组质粒2， A0X引物，PCR产物大小为2. 1Kb,泳道6:重组质粒l，基因引物，PCR产物大小为1.6Kb， 泳道7:重组质粒2，基因引物，PCR产物大小为1.6Kb，泳道8: DNA Marker大小从15000bp， 10000bp， 7500bp, 5000bp， 2500bp，1000bp， 500bp。 图4:重组质粒的酶切鉴定泳道l:阳性重组质粒，BglII酶切后，大片段在8400bp，小片段为2500bp; 泳道2:腿Marker大小从15000bp, 10000bp， 7500bp， 5000bp， 2500bp，1000bp， 500bp，泳道3:空质粒，Bgl II酶切后，大片段在6800bp,小片段为2500bp。 图5:阳性重组菌PCR鉴定泳道l、 2、 3:均为阳性重组菌，泳道4: DNA Marker大小从2000bp, 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp， 泳道5 :重组质粒作为阳性对照。 图6:.表达菌株发酵曲线。图7:表达产物的纯化(SDS-PAGE)及westen blot鉴定 其中A : SDS-PAGE鉴定泳道l:发酵液上清硫酸铵浓縮液，泳道2:发酵液经硫酸铵浓縮后，疏水柱脱盐后，上柱于Q-S柱，纯度已经达 80%，泳道3:将Q-S柱分液，再经羟基磷灰石，纯度达95%，B: westen-blot鉴定泳道l:发酵液上清浓縮液，泳道2: Q-S离子交换柱纯化后的人源过氧化氢酶泳道3:羟基磷灰石柱分后的人源过氧化氢酶 图8:抗急性肺炎模型三张切片分别为正常组小鼠肺部切片，病毒诱导组小鼠肺部切片，病毒给药组 小鼠肺部切片，显示给药能明显减轻小鼠肺部病变程度。图9:抗亚急性衰老模型Morris水迷宫试验结果 其中，A为正常对照组，B为亚急性衰老组，C为给药组。
具体实施方式
为使本发明的内容更为明确，以下列非限制实施例进一步详细说明。实施例1 pPIC9k-CAT表达质粒的构建 人胚胎肝细胞CDNA的提取将lg新鲜的人胚胎肝组织液氮冷冻，研磨，研细后，用上海生物工程公司购得RNA 提取试剂盒，提取RNA。将RNA溶液用上海生物工程公司购得CDNA反转录试剂盒通过 RT-PCR获得总的CDNA。编码人肝过氧化氢酶的基因扩增5'端和3'端引物的合成根据NCBI基因库中2004年刚发布的人肝全长 CDNA[gi :50490312]，找出其中的ORF序列，设计引物。合成5，端引物TACGTA ATGGCTGACAGCCGGGATCC，此序列含SNABI酶切位 点。3，端引物CCGGCGGCCGC TCACAGATTTGCCTTCTCC,此序列含Notl酶切位点。PCR扩增:取肌C腿，加入1叱DNTP， 5叱10XBuffer，机5，端引物和化L3， 端引物，34叱水，l叱Taq酶(takara大连宝生)后，加入50叱石蜡油液封。设定PCR 参数如下摄氏94度5分钟，l个循环；摄氏94度30秒，63度30秒，72度1分40 秒，3个循环；摄氏94度30秒，60度30秒，72度1分40秒，共25个循环。PCR结 束后，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析，确定扩增得到的DNA片段的大小为1.6Kb左右 (见图1)。T-A克隆将Taq酶PCR得到的DNA片段取4叱，加l礼T-vector, 5叱solution 1,16度水 浴连接8小时，将连接产物加入大肠杆菌TGI感受态细胞中，42度热激90秒，冰浴2 分钟，加lmlLB100rpm培养复苏，4000RPM离心5分钟，弃去大部分上清，将其余部 分混均，取20(HiL涂布于含Xgal和IPTG的抗性平板上(lOOPg/ml氨苄青霉素)，37 度，生长18小时，将白色菌落，挑出扩增，抽取质粒，PCR鉴定条件同前，得到阳性 的T-A质粒。测序与NCBI基因库上公布的CDNA全长序列中ORF区域100%吻合，证明所获得基因片段为目的基因片断。 pPIC9k-CAT表达质粒的构建将筛选得到的T-A克隆质粒，用SnaB I和Not I在37摄氏度下反应2h，利用琼 脂糖凝胶回收1. 6Kb左右的目的基因片段，将纯化后的片段用T4 DNA连接酶连接到也 同样用SnaB I和Not I酶切好的pPIC9k载体上(invitrogen公司)，16摄氏度连接 过夜，将连接产物转化到大肠杆菌TGI感受态细胞，经筛选得到阳性pPIC9k-CAT表达 质粒。再经酶切和用A0X1序列作引物的PCR验证，确定目的基因已经克隆进pPIC9k 载体(见图2，图3，图4)。实施例2 pPIC9k-CAT表达质粒转化和阳性菌株筛选将获得的pPIC9k-CAT表达质粒经Bgl II在37度下酶切2小时线性化完全，无水 乙醇沉淀，10000RPM离心，弃上清，挥去残留的乙醇，用无菌水溶解。取5叱与80叱 处于感受状态的新鲜制备的酵母菌SMD1168 (市购)混匀，具体参考irwitrogen公司 的电转化Protocol,电击穿孔导入。将电击完的菌液30度复苏1小时，涂布于MD平 板上，30度生长3-5天，将生长的白色克隆接到含4mg/ml的G418的YPD平板上进行 抗性筛选，筛选高拷贝的重组菌毕氏甲醇酵母pic力ia / a"o/^s，将获得的重组菌用 煮_冻-煮的方法裂解细胞，抽取基因组DNA，进行PCR验证。用基因引物和AOX引物都 能获得阳性的条带，说明目的基因已经整合到基因组上。(见图5)实施例3高表达活力的阳性重组菌的筛选和人源过氧化氢酶的过量表达将所得的阳性重组菌与原始菌在5mlBMGY培养基中，250RPM， 30摄氏度，生长24 小时后，4000RPM离心，换BMMY培养基，以1%的甲醇诱导，每隔24小时补加一次， 培养条件同上。取菌液10000RPM离心后，观察上清的过氧化氢酶活力，筛选得到毕氏 甲醇酵母(Fudan s4)高活力菌种。将S4高产菌株用14L的全自动发酵罐进行高效表达，在BS培养基中，30摄氏度， 溶氧40%，搅拌400RPM， PH为6. 8的时候，在甲醇诱导36小时，活力达到最高，其表 达活力以牛肝过氧化氢酶(sigma公司)为对照，达到每升220mg等量的牛肝过氧化氢 酶。(见图6)实施例4表达产物的纯化将发酵液4000RPM， 4摄氏度冷冻离心，收获上清，加入80%饱和度的硫酸铵，搅 拌，置4摄氏度放置2小时，待沉淀完全后，10000RPM， 4摄氏度冷冻离心，收获沉淀。 活力回收率为85%以上。将沉淀用1M的硫酸铵溶液溶解，上柱于同样用1M硫酸铵平衡的苯基纤维素疏水 柱，用1M-0M硫酸铵浓度递减的方法洗脱，酶活力集中在O. 1M硫酸铵的洗脱液中。去 除部分杂蛋白和脱盐。将0. 1M硫酸铵洗脱液用PH7. 0， 10mM的磷酸缓冲液透析3次，每次体积比为1: 100以上，透析完全后，上柱于同样磷酸缓冲液平衡的Q-S印harose FF柱，以含0M-0. 5M NaCl的磷酸缓冲液洗脱，收集酶活部分，获得85%纯度的目的蛋白。将上步洗脱液用lOmM的ra6. 8的磷酸钾缓冲液透析3次，每次体积比为1: 100 以上，透析完全后，上柱于同样用缓冲液平衡的羟基磷灰石，以0-0.3M磷酸钾缓冲液 洗脱，收集酶活部分，获得95%纯度的目的蛋白。(见图7)实施例5表达产物的SDS-PAGE鉴定及Westen Blot鉴定将表达产物在10%的浓度的SDS-PAGE，牛肝过氧化氢酶作为对照，考马斯亮蓝染 色发现66KD下有一明显蛋白条带。同样做一块SDS-PAGE胶，半干转移至PVDF膜，5%牛奶封闭过夜，与鼠抗人过氧化 氢酶的一抗杂交，25摄氏度1小时，洗膜后，与AP标记抗鼠的二抗杂交后，洗膜， BCIP/NBT底物显色后，发现膜上有明显的特异性条带。说明此表达蛋白为人源的过氧 化氢酶。(见图8)蛋白质及活性测量蛋白质的含量测定以牛血清白蛋白为标准，采用蛋白质定量试 剂盒及方法(购自南京建成出品)；过氧化氢酶活性测定采用钼酸铵法测定，牛肝过氧 化氢酶(sigma公司，13800U/mg)作为标准品对照，所有的样品活力均用牛肝过氧化 氢酶标定。 -实施例6纯化过氧化氢酶抗小鼠急性肺炎损伤实验将昆明种小鼠，6只为一组，每只重量都在16-18g，分为正常组，单纯病毒组，病 毒给药组。给病毒组和病毒给药组接种流感病毒，制造急性肺炎模型。诱导一天后，病毒组给生理盐水30ul，吸入给药。病毒给药组给含纯化过氧化氢 酶的生理盐水30ul，吸入给药。连续给药到第5天，第6天处置，观察各组小鼠的肺部病变情况及切片观察肺部组 织。(见图9)结果显示，给药组能明显减轻肺部的病变情况，表明通过外源性的人过氧化氢酶的给
药方式能有效抗急性肺炎产生的氧化损伤。实施例7纯化的过氧化氢酶抗小鼠亚急性衰老实验将昆明种小鼠，6只为一组，分为正常组，亚急性衰老组，给药组，每只重量16-18g。 亚急性衰老组和给药组，分别颈背部皮下注射定量的D-半乳糖，连续40天，诱导其产 生亚急性衰老。正常组和亚急性衰老组注射生理盐水，给药组注射纯化的人源过氧化 氢酶。观察各组小鼠的各脏器衰老程度，如心肌，脑部，海马回，肾脏等的电镜，光 镜及生化指标和小鼠行为学差异，如morris水迷宫等。实验结果显示，在行为学上表现为经过训练后，给药的小鼠的各象限的寻台时间少 于衰老组，表明过氧化氢酶对的小鼠的学习，记忆能力及活动能力都有明显提高，具 有抗衰老的作用(见图9)。
权利要求
1、重组人源过氧化氢酶的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)将可编码人源过氧化氢酶的基因嵌入含适当转录启动子的表达载体中构建重组质粒；(2)将该重组质粒转化到适当的宿主细胞中；(3)于适合该细胞表达过氧化氢酶的条件下培养该转化细胞；(4)纯化所表达的人源过氧化氢酶。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的过氧化氢酶其来源是人组织 和/或血浆。
3、 根据权利要求1所述的方法，其中所述的宿主细胞选自细菌，酵母或昆虫细 胞。
4、 根据权利要求1或3所述的方法，其中所述的宿主细胞是毕氏甲醇酵母pj'c力h pas"r/s，保藏单位CGMCC,保藏编号CGMCCNo.1825 。
5、 根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)的纯化是以硫酸铵沉淀，有机 溶剂沉淀，疏水层析法和离子交换法，分子排阻法，将所表达的过氧化氢酶予以 纯化。6、 一种表达人源的过氧化氢酶的重组质粒，其特征是所述重组质粒是采用基 因工程技术将人源过氧化氢酶基因嵌入表达载体。
6、 根据权利要求6所述的重组质粒，其基因来源为人组织和/或血浆。
7、 根据权利要求6所述的重组质粒，其表达载体选自细菌，酵母或昆虫表达 系统的表达载体。
8、 根据权利要求1的方法所制得的人源的过氧化氢酶在制备外源性抗感染、 抗氧化损伤，抗衰老或抗肿瘤药物中的用途。
9、 根据权利要求8的用途，其中外源性抗感染是抗急性肺炎；外源性抗氧化 损伤是抗烧伤等氧自由基引起的急性氧化损伤；抗衰老是抗长期氧自由基损伤引 起的衰老病理状况。
全文摘要
本发明属生物工程技术领域，涉及制备重组人源过氧化氢酶的方法。具体而言，本发明提供了一种采用基因工程技术克隆人源过氧化氢酶基因，构建其表达质粒，转化细胞获得高产量人源过氧化氢酶的方法。本发明所制得的人源过氧化氢酶产量高，高活性，生产方法简便，无疾病源污染的问题。本发明亦包括此方法中构建的新的重组质粒及转化细胞。本发明经实验证实，可将表达的重组人源的过氧化氢酶应用于制备抗感染、抗氧化、抗衰老或抗肿瘤药物。
文档编号C12N9/08GK101148659SQ20071012672
公开日2008年3月26日 申请日期2007年6月15日 优先权日2007年6月15日
发明者冯美卿, 史训龙, 珮 周, 李继扬, 海 黄 申请人:复旦大学