专利名称：一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法
技术领域：
本发明属于微生物工程领域，涉及一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法。
背景技术：
在国际上，大肠杆菌缺陷株E被用于从微生物中克隆耐盐相关基因。其做法是提取纯培养微生物的DNA，用限制性内切酶对其进行部分酶切，将酶切片段连接到适当的载体，并用连接产物转化大肠杆菌缺陷株E，然后，在含一定浓度NaCl或LiCl的固体培养基上对转化子进行筛选，从而获得携带耐盐相关基因的重组子。实际上，还可以用大肠杆菌缺陷株E克隆耐碱相关基因。所谓耐碱相关基因，是指与细胞内的pH稳态相关的基因。但截至目前，还没有人采用该菌株从微生物中规模化克隆耐碱相关基因。
发明内容
本发明的目的是从碱性环境微生物样品中克隆得到大量的耐碱相关基因，实现对微生物耐碱相关基因克隆的高通量和规模化。
一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，经过样品采集、宏基因组DNA的粗提、宏基因组DNA的纯化三个步骤，再通过阳性克隆的筛选、测序和亚克隆等步骤，获得耐碱相关单一基因，并对基因进行功能鉴定。其特征是1.样品采集从盐碱湖和盐碱地等多元化的地域环境中采集土壤样品，样品采集后，-70℃--80℃保存备用。
2.采用CTAB-SDS-冻融法粗提宏基因组DNA宏基因组DNA是指特定环境样品中所有微小生物的DNA总和。CTAB-SDS-冻融法(即十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠-冻融法)粗提宏基因组DNA的详细步骤为(1)称取1g土样于15mL离心管中(如果需要大量提取宏基因组DNA，可称取3-10g土样于50mL离心管中，相应试剂的用量按比例增加)，加入2-10mL经35-37℃预热的DNA提取液、50-200mg PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)、10-100μL(约20-200个活性单位)溶菌酶和5-20粒灭菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min条件下振荡30-90min。然后加入0.2-1.0mL浓度为20％的SDS(十二烷基硫酸钠)，上下用力颠倒，使之混匀；DNA提取液的配方包括100mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，100mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/L Na3PO4(磷酸三钠)，1.5mol/L NaCl，浓度为1-3％ CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，pH7.8-8.2。
(2)50-65℃水浴1-2小时(每隔10-30min上下轻轻颠倒离心管2-4次，切勿振荡！！)。水浴完毕，冷却至室温，然后加5-50μL(约10-100个活性单位)蛋白酶K，35-37℃温度下摇动30-60min；(3)置于-20℃冷冻20min-40min，然后50-65℃冻融、35-37℃温育30-60min；
0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)将得到的上清1转移至另一离心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混匀，50-65℃水浴1-2小时。然后于-20℃冷冻，50-65℃解冻，冰浴冷却；再冷冻和融化各1次，0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清2；将所得到的上清2吸出，并与上清1合并，所得上清液为上清3；(5)抽提向上清3中加入与上清3等体积预冷的氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，上下轻轻颠倒离心管，使充分混合，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清4；小心吸取上清液4至另一离心管，加入体积相当于上清液4的0.1倍的预冷的1mMEDTA-3M NaAc溶液(含有1mM乙二胺四乙酸与3M醋酸钠的试剂，pH5.2)和相当于上清液4体积0.6倍的预冷异丙醇。轻混匀后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小时，使DNA沉淀；0-10℃、8000-12000r/min离心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL经0-10℃预冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥机对沉淀物3进行干燥后，向所得粉末状宏基因组DNA中加入20-150μL的ddH2O(灭菌双蒸水)，-20℃保存备用(短时间保存可置4℃冰箱)。
3.宏基因组DNA的纯化采用试剂盒对经粗提获得的宏基因组DNA进行纯化，详细操作方法见Promega公司的DNA凝胶回收试剂盒。用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度。
对经过纯化的宏基因组DNA进行阳性克隆的筛选依次按以下步骤进行。
4.阳性克隆的筛选(1)宏基因组DNA的部分酶切预实验。用10mM Tris-HCl(pH8.0)稀释宏基因组DNA至900μl，加入100μl 10×酶切缓冲液充分混匀，10×酶切缓冲液成分为500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，1000mM NaCl，所得溶液为宏基因组DNA稀释液；准备10个离心管，依次编号；用切去尖端的移液器吸头，向1号离心管加入30μl宏基因组DNA稀释液，向2-10号离心管中各加入15μl宏基因组DNA稀释液，并将1-10号离心管置于冰上；向1号离心管中加入3μl(约0.06U)Sau3AI(分离自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 3A菌株的第一种限制性内切酶)，并温和混匀，然后从1号离心管中吸出15μl转移至2号离心管中，温和混匀，并吸取15μl转移至3号离心管中，依次类推，直至第10号离心管。将所有离心管于37℃温育60min。酶切消化结束后，快速置70-75℃加热10-20min，以灭活限制性内切酶。待样品降至室温后，用0.6-0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，以检测宏基因组DNA部分酶切的效果。酶切消化完全、且酶切产物集中在4-10kb范围的内切酶Sau3AI用量为最适酶量，其大致范围为0.001-0.006个活性单位/管。
(2)宏基因组DNA部分酶切产物的大规模制备。根据宏基因组DNA部分酶切预实验所确定的最适Sau3AI用量扩大酶切反应体系，用0.012-0.05个活性单位的Sau3AI对500-2,000ng的宏基因组DNA消化1小时，然后用酚∶氯仿小心抽提部分酶切产物两次；用相当于部分酶切产物2倍体积、经0-10℃预冷的无水乙醇进行沉淀，并将沉淀溶于30-200μl的ddH2O中，得到部分酶切产物；用0.6-1.0％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收4-10kb范围的DNA片段，并将回收的4-10kb范围的DNA片段置-20℃保存；(3)pGEM3Zf(+)载体的酶切和去磷酸化。对pGEM3Zf(+)载体依次用BamHI完全酶切以及牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化处理；(4)用经回收的宏基因组DNA部分酶切片段与pGEM3Zf(+)载体按6∶1-1∶4的比例进行连接，直接用获得的连接产物电转化大肠杆菌缺陷株E，然后在pH8.0-9.0的碱性条件下对重组子进行筛选，获得阳性克隆。所有阳性克隆均携带耐碱相关基因；(5)挑取阳性克隆依次进行质粒的快速检测、质粒提取和测序鉴定。
5.目的基因的亚克隆和再转化(1)根据阳性克隆携带重组质粒的序列比对结果，设计一对特异引物，通过常规的PCR方法，对耐碱相关基因的全长(包含推测的启动子和终止子)进行亚克隆，并将亚克隆基因连接到pGEM3Zf(+)载体(一种常用的克隆载体)获得重组质粒，然后用获得的重组质粒再次转化大肠杆菌缺陷株E，获得仅携带耐碱相关单一基因或基因簇的重组子。
(2)重组子在不同盐浓度下的生长能力测试分别在pH7.0-9.5的培养基中培养携带耐碱相关单一基因的大肠杆菌缺陷株E重组子，从而确定耐碱相关基因提高E缺陷株耐碱性的能力。
6.翻转膜(1)翻转膜的制备培养并收集各重组子和阴性对照菌株的菌体，用法式细胞破碎仪(French Press)以1,200-2,500p.s.i.的系统压力破碎细胞，然后80,000-100,000×g超速离心1-2小时，所得沉淀即为翻转膜，将获得的翻转膜置-70--80℃保存备用。
(2)翻转膜的性质钠离子输出蛋白的活性测定采用荧光分光光度计法测定翻转膜中耐碱相关蛋白在pH4.5-9.5下的活性，测定方法即利用吖啶橙作为荧光探针，向含有翻转膜的反应体系中添加Tris-L-乳酸钾或Tris-L-乳酸至终浓度为5-10mM，使荧光强度逐渐猝灭，并通过荧光分光光度计监控跨膜pH梯度的变化。荧光监测参数为激发光(EX)波长430-505nm，发射光(EM)波长510-530nm。当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入终浓度为2-10mM的NaCl、LiCl或KCl。如果翻转膜具有单价阳离子转运活性，则荧光强度开始恢复。根据荧光强度的恢复程度判断并表示翻转膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性的大小以及转运单价阳离子的特异性。
表观Km(米氏常数)和Vmax(最大反应速度)的测定在最适pH条件下，使用不同浓度的NaCl、LiCl或KCl分别测定翻转膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性。然后，以底物浓度和荧光强度作双倒数图，并由此计算耐碱相关蛋白对Na+、Li+和K+的表观Km值和Vmax值，获得新基因编码蛋白的动力学参数及转运单价阳离子的能力等特征信息。
采用本发明，可以从碱性环境微生物样品中克隆得到大量的耐碱相关基因，实现对微生物耐碱相关基因克隆的高通量和规模化。
具体实施例方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。
从采集自新疆碱湖的土壤样品中克隆微生物耐碱相关基因。其详细步骤为1.用样品采集器沿碱湖四周采集约20cm深的沉积土样，然后分装于灭菌的50ml离心管中。样品带回实验室后，-80℃保存备用。
2.土壤微生物宏基因组的提取。具体方法是(1)称取1g土样于15mL离心管中，加约50mg的PVPP和2.7mL预热的DNA提取液，再加入50μL溶菌酶，37℃、250r/min振荡30min；(2)加入0.3mL 20％的SDS，上下用力颠倒几次，使之混合均匀；(3)65℃水浴2小时(每隔20min左右上下轻轻颠倒离心管几次，切勿振荡！)。水浴完毕，冷却至室温，然后加20μL蛋白酶K，37℃温和摇动30-60min；(4)置于-20℃冷冻30min(或更长时间)，然后65℃冻融10min，37℃温育30min4℃、10,000r/min离心10min，得到上清1和沉淀物1，收集上清1转移至另一离心管中；(5)向(4)步得到的沉淀中加入0.9mL DNA提取液和0.1mL 20％ SDS，混匀，65℃水浴30min。然后于-20℃冷冻，65℃冻融10min，冰浴冷却；4℃、10,000r/min离心10min，得到的上清2，上清2与上清液1合并得到上清3；(6)抽提向上清3中加入与上清3等体积预冷的氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下轻轻颠倒离心管，使充分混合，然后4℃、10000r/min离心20min得到上清4；小心吸取上清液4至另一离心管，加入0.1倍体积预冷的1mM EDTA-3M NaAc(pH5.2)和0.6倍体积预冷的异丙醇，轻混匀，然后冰浴15min、或者-20℃放置1h，使DNA沉淀；4℃、10,000r/min离心20min，得到上清5和沉淀物2；(7)倒掉上清5，向沉淀物2中加入5mL经过4℃预冷的70％乙醇，冰浴30min，然后4℃、10000r/min离心20min得到上清6和沉淀物3；倒掉上清6，用真空干燥机对沉淀物3进行干燥后，向所得粉末状宏基因组DNA中加入20-150μL灭菌ddH2O，-20℃保存备用。
3.宏基因组部分酶切预实验用10mM Tris-HCl(pH8.0)稀释宏基因组DNA至900μl，加入100μl 10×酶切缓冲液，充分混匀，所得溶液为宏基因组DNA稀释液；准备10个离心管，用切去尖端的移液器吸头，向1号离心管加入30μl宏基因组DNA稀释液，向2-10号离心管中各加入15μl宏基因组DNA稀释液，并将1-10号离心管置于冰上；向1号离心管中加入3μl(约0.048U)Sau3AI，并温和混匀，然后从1号离心管中吸出15μl转移至2号离心管中，温和混匀，并吸取15μl转移至3号离心管中，依次类推。将所有离心管于37℃温育60min；酶切消化结束后，将上述10个离心管置70℃加热15min，以灭活Sau3AI。待反应温度降至室温后，用0.8％的琼脂糖对酶切产物进行凝胶电泳，以检测宏基因组DNA部分酶切的效果。酶切消化完全、且酶切产物集中在4-10kb范围的内切酶Sau3AI用量为最适酶量，最适酶量用量为0.0018个活性单位/管。
4.宏基因组部分酶切产物的大规模制备根据宏基因组DNA部分酶切预实验所确定的最适Sau3AI用量扩大酶切反应体系，用0.024个活性单位的Sau3AI对1000ng的宏基因组DNA消化1小时，然后用酚∶氯仿小心抽提两次，用相当于部分酶切产物2倍体积、经4℃预冷的无水乙醇沉淀部分酶切产物，并将所得沉淀溶于200μl的ddH2O中；用0.8％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收4-10kb范围的DNA片段，并将回收产物置-20℃保存；5.pUC18载体的酶切和去磷酸化对pUC18载体(是一种常用的克隆载体)依次用BamHI完全酶切以及CIAP去磷酸化处理，得到线性化的pUC18载体。其中，BamHI为分离自Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)H菌株的第一种限制性内切酶，CIAP为牛小肠碱性磷酸酶。
pUC18载体的酶切和去磷酸化反应体系如表1。
表1 pUC18载体的酶切和去磷酸化体系和反应条件
6.pUC18载体与基因组DNA部分酶切片段的连接将经过酶切和去磷酸化后产生的线性pUC18载体与经Sau3AI部分酶切的宏基因组DNA以1∶1的摩尔比进行连接，形成连接产物。连接体系如表2。
表2 pUC18与宏基因组部分酶切片段的连接体系和反应条件
7.阳性克隆的筛选
(1)从-80℃冰箱取出大肠杆菌缺陷株E的感受态细胞放入电激杯，冰上冻融，同时冰浴电激杯；(2)向感受态细胞中加入5μl连接产物，轻旋离心管以混匀内容物，然后冰浴5min；调节基因导入仪参数V＝1.6kV，R＝250Ω，电容25μF；(3)将感受态细胞和重组质粒的混合物转入电激杯，将电激杯推入电激槽，然后启动电脉冲；(4)取出电激槽，向电激杯内加入500μl经37℃预热的LBK液体培养基(LBK液体培养基的配制方法10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5-6.5g氯化钾，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min)，并抽吸3-5次；将杯内菌悬液移至离心管，37℃、180rpm温育1小时；(5)将菌悬液涂布于pH8.0的LBK固体培养基(即在LBK液体培养基中添加1.5-2.0％的琼脂粉和100μg ml-1氨苄青霉素)，37℃培养20小时，由此获得阳性克隆。所有阳性克隆均携带耐碱相关基因。
8.对阳性克隆依次进行质粒的提取以及测序鉴定。
质粒的提取按照上海生工生物技术公司的质粒提取试剂盒的说明操作，序列测定在上海英俊广州分公司进行。
9.耐碱相关基因的亚克隆用于亚克隆的PCR反应体系及条件如表3所示。
表3 目的基因的亚克隆体系及反应条件
10.亚克隆基因的再转化将亚克隆基因连接到pGEM3Zf(+)载体，然后用获得的重组质粒再次转化大肠杆菌E菌株，用获得的仅携带耐碱相关单一基因的重组子进行目的基因的功能研究，且均以携带空载体的大肠杆菌缺失株K/pGEM3Zf(+)作为阴性对照。
11.重组子在不同条件下的生长能力测试功能性表达的耐碱相关基因能不同程度地提高大肠杆菌缺陷株E的耐碱能力。分别在pH7.0-9.5的培养基中对大肠杆菌E重组子进行碱耐受性实验。
12.翻转膜的制备及性质测定(1)翻转膜的制备培养并收集各重组子和阴性对照菌株的菌体，用French Press方法以1,500p.s.i.的系统压力破碎细胞，然后100,000×g超速离心1小时，将获得的翻转膜置-80℃保存备用。
(2)翻转膜的性质耐碱相关基因编码蛋白的活性测定采用荧光分光光度计法测定翻转膜中耐碱相关基因编码蛋白在不同pH下的活性，即利用吖啶橙(AO)作为荧光探针，首先，向含有翻转膜的反应体系中添加Tris-L-乳酸钾或Tris-L-乳酸至终浓度为5mM，使荧光强度逐渐猝灭，并通过荧光分光光度计监控跨膜pH梯度的变化。荧光监测参数为激发光(EX)波长495nm，发射光(EM)波长530nm。当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入NaCl、LiCl或KCl至终浓度为10mM。如果翻转膜具有单价阳离子转运活性，则荧光强度开始恢复。根据荧光强度的恢复程度判断并表示翻转膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性的大小以及转运单价阳离子的特异性。
表观Km值和Vmax测定分别测定翻转膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性。然后，以底物浓度和荧光强度作双倒数图，并由此计算耐碱相关基因编码蛋白对Na+、Li+和K+的表观Km值和Vmax，获得新基因编码蛋白的动力学参数及转运单价阳离子的能力等特征信息。
权利要求
1.一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，经过样品采集、宏基因组DNA的粗提、宏基因组DNA的纯化三个步骤，再通过阳性克隆的筛选、测序和亚克隆，获得与耐碱相关的单一基因或基因簇，并对目的基因进行功能鉴定；其特征是样品采集自盐碱湖和盐碱地多元化的地域环境，样品采集后保存温度为-70℃--80℃；提取宏基因组DNA的详细步骤为(1)称取1g土样于15mL离心管中，加入2-10mL经过35-37℃预热的DNA提取液和50-200mgPVPP及10-100μL溶菌酶和5-20粒灭菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min条件下振荡30-90min，加入0.2-1.0mL浓度为20％的SDS，10-100μL溶菌酶合20-200个活性单位；(2)50-65℃水浴1-2小时，每隔10-30min上下颠倒离心管；水浴完毕，冷却至室温，然后加5-50μL蛋白酶K，35-37℃温度下摇动30-60min，5-50μL蛋白酶K合10-100个活性单位；(3)置于-20℃冷冻20min-40min，然后50-65℃冻融、35-37℃温育30-60min；0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)将得到的上清1转移至另一离心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混匀，50-65℃水浴1-2h，然后于-20℃冷冻，50-65℃解冻，冰浴冷却；重复冷冻和融化1次，0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清2；将所得到的上清2吸出，并与上清1合并，所得上清液为上清3；(5)抽提向上清3中加入与上清3等体积预冷的氯仿和异戊醇，氯仿与异戊醇体积比为24∶1，上下颠倒离心管，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清4；吸取上清液4至另一离心管，加入体积相当于上清液4的0.1倍的预冷的pH5.2的1mMEDTA-3MNaAc和体积相当于上清液4的0.6倍的预冷的异丙醇，混匀后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小时使DNA沉淀；0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL经0-10℃预冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥机对沉淀物3进行干燥后，向所得粉末状宏基因组DNA中加入20-150μL灭菌ddH2O，-20℃保存备用；对于大量提取宏基因组DNA，则土样的称取数量和相应试剂的用量要按比例增加。
2.如权利要求1所述的一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，其特征是对经过纯化的宏基因组DNA进行部分酶切，并将部分酶切片段连接到pGEM3Zf(+)载体，得到连接产物，依次按以下步骤进行(1)宏基因组DNA部分酶切预实验准备10只离心管，用切去尖端的移液器吸头向1号离心管加入30μl宏基因组DNA稀释液，向2-10号离心管各加入15μl宏基因组DNA稀释液，然后采用2倍稀释法，对加入酶切反应体系的Sau3AI进行梯度稀释，于37℃温育1小时，酶切消化结束后，将离心管快速置70-75℃加热10-20min，以灭活限制性内切酶；待反应体系降至室温后，用浓度为0.6％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，以检测酶切效果，酶切消化完全、且酶切产物集中在4-10kb范围的内切酶Sau3AI用量为最适酶量，最适酶量范围为0.001-0.006个活性单位/管；(2)宏基因组DNA部分酶切产物的大规模制备根据宏基因组DNA部分酶切预实验所确定的最适Sau3AI用量扩大酶切反应体系，用0.012-0.05个活性单位的Sau3AI对500-2,000ng的宏基因组DNA消化1小时，然后用酚氯仿对部分酶切体系进行两次抽提，用相当于抽提液2倍体积、0-10℃预冷的无水乙醇沉淀DNA，并将所得沉淀即部分酶切产物溶于30-200μl的ddH2O；用浓度为0.6-1.0％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收4-10kb范围的DNA片段，并将回收的4-10kb范围的DNA片段置-20℃保存；(3)载体的酶切和去磷酸化对pGEM3Zf(+)质粒依次用BamHI完全酶切以及CIAP去磷酸化处理；(4)用经回收的宏基因组DNA部分酶切片段与pGEM3Zf(+)载体按6∶1-1∶4的比例进行连接，获得连接产物。
3.如权利要求1所述的一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，其特征是阳性克隆的筛选(1)从-70--80℃冰箱取出大肠杆菌缺陷株E的感受态细胞放入电激杯，冰上冻融，同时冰浴电激杯；(2)向感受态细胞中加入0.5-5.0μl连接产物，轻旋离心管以混匀内容物，然后冰浴5min；调节基因导入仪参数V＝1.6-2.0kV，R＝200-500Ω，电容25-50μF；(3)将感受态细胞和重组质粒的混合物转入电激杯，将电激杯推入电激槽，然后启动电脉冲；(4)取出电激槽，向电激杯内加入500-800μl经过35-37℃预热的LBK液体培养基，并抽吸混匀；将杯内菌悬液移至离心管，35-37℃、150-300rpm温育30-60min；(5)将菌悬液涂布于pH8.0的LBK固体培养基，内含50-100μg ml-1氨苄青霉素，35-37℃培养16-24小时，由此获得阳性克隆。
4.如权利要求1所述的一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，其特征是目的基因的亚克隆和再转化根据阳性克隆携带重组质粒的序列比对结果，设计一对特异引物，通过常规的PCR方法，对耐碱相关基因的全长进行亚克隆，并将亚克隆基因连接到pGEM3Zf(+)载体，由此获得重组质粒，然后用获得的重组质粒再次转化大肠杆菌缺陷株E，获得仅携带耐碱相关单一基因或基因簇的重组子。
5.如权利要求1所述的一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，其特征是翻转膜的制备培养并收集各重组子和阴性对照菌株的菌体，用法式细胞破碎仪以1,200-2,500p.s.i.的系统压力破碎细胞，然后80,000-100,000×g超速离心1-2小时，即获得翻转膜，获得的翻转膜要在-70--80℃下保存。
6.如权利要求1所述的一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法，其特征是耐碱相关基因编码蛋白的活性测定在pH4.5-9.5下，利用吖啶橙作为荧光探针，向含有翻转膜的反应体系中添加Tris-L-乳酸钾或Tris-L-乳酸至终浓度为5-10mM，使荧光强度逐渐猝灭，并通过荧光分光光度计监控跨膜pH梯度的变化；荧光监测参数为激发光EX波长430-505nm，发射光EM波长510-530nm；当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入NaCl、LiCl或KCl至终浓度为2-10mM，根据荧光强度的恢复程度判断并表示翻转膜中耐碱相关基因编码蛋白Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性的大小以及转运单价阳离子的特异性；然后，在pH4.5-9.5条件下，使用不同浓度的NaCl、LiCl或KCl分别测定翻转膜中耐碱相关基因编码蛋白的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性；以底物浓度和荧光强度作双倒数图，并由此计算耐碱相关基因编码蛋白对Na+、Li+和K+的表观Km值和Vmax值。
全文摘要
本发明属于微生物工程领域，涉及一种规模化筛选微生物耐碱相关基因的方法。特点是采集典型的碱性环境土壤样品，通过粗提和纯化获得土壤样品的宏基因组DNA，然后用宏基因组DNA部分酶切片段与载体之间的连接产物电激转化大肠杆菌缺陷株E，通过筛选获得阳性克隆，并对阳性克隆携带的耐碱相关基因进行亚克隆和功能鉴定。本发明可以规模化克隆微生物的耐碱相关基因，用于耐碱作物和微生物的分子育种，进而充分开发和利用盐碱地以及进行高(盐)碱环境的污染修复。
文档编号C12P19/34GK101063174SQ20071009967
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者杨礼富, 王真辉 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所