专利名称：“一管法”乙肝病毒核酸提取与扩增-荧光pcr定量技术的利记博彩app
技术领域：
本发明专利属核酸提取与荧光聚合酶链反应(PCR)定量技术；该技术实现了核酸提取与 后续的PCR扩增两个步骤在同一 PCR管中进行，从根本上解决了该类实验的污染问题并实现 真正的快速和准确定量。
背景技术：
目前国内外市场正在临床应用的HBV DNA荧光定量PCR技术主要有以下几个特点
1. 核酸提取主要有以下几种，1)多聚糖浓縮沉淀病原，然后加碱性裂解液高温裂解、 离心获取核酸；2)碱性裂解液直接与含病原液体混匀，然后高温裂解、离心获取核酸；3) 层析柱法如采用层析柱吸附、纯化、洗脱获取核酸；4)磁珠法采用硅粉或聚乙二烯包被 的磁珠吸附、纯化、洗脱获取核酸。
以上提取方法都要经过3 8步的换管、离心(负压吸引)、移液等步骤方可获取核酸， 以上过程均存在核酸丢失、污染和疲劳操作等因素带来的定量误差或错误。
2. 外带定量标准品标准品大多由试剂公司随试剂盒一并提供的DNA纯品(重组或克隆 产物)，不与标本同时参加核酸提取，直接进入PCR扩增，部分试剂盒提供的标准品与标本同 时核酸提取，但采用的是核酸摻入法而非原病毒颗粒，与标本有本质不同，无法真实和全程 监控标本核酸提取和扩增过程。
3. 引物和探针均采用单条正向引物、荧光标记探针和单条反向引物，构成特异性扩增 序列，其扩增效率和敏感性尚有提升空间。4. PCR工作反应液PCR扩增缓冲液、引物、探针及Taq DNA聚合酶等所需成分混匀成 PCR工作液，为无色液体，容易导致视觉疲劳带来的操作误差。
5. PCR扩增温度条件的设置采用传统的40个扩增循环全部进行复性期荧光信号采集 的程序设置方法，而PCR前10个扩增循环中并无阳性信号，存在信号空测；并且荧光PCR前 几个循环存在荧光信号不稳的现象，不利于结果分析。
发明内容
1. 核酸提取采用本发明人发明的"微量核酸释放剂(申请号200310116699. X)"提取核 酸。3 pl血清(血浆或全血)标本与3 pl蓝色"微量核酸释放剂"在PCR管内混匀，核 酸释放剂即退色，可清晰判断加样的位置，从根本上解决了前处理过程中的加样错误；覆 盖10 15^1无菌石蜡油，经85。C,30s—99。C,7min— 5。C,30s温处理后，加入PCR工作 液，直接进入荧光PCR扩增程序，实现检测标本直接进入荧光PCR扩增管的准确定量。
2. HBV标准血清质控品收集HBV DNA强阳性混合血清，采用HBV DNA阴性正常人血清去纤 维后对阳性血清依次进行100倍稀释，分别制备出108、 106、 105和103copies/ml的HBV 标准血清质控品，采用卫生部标准质控品血清(国家一级标准)，进行10X10的实验内和 实验间重复，最终确定HBV标准血清质控品的DNA含量，并进行保存条件的稳定性实验。 实现原病毒血清质控品与标本同时进行核酸提取与扩增的全程监控。
3. 采用双正反向4条引物和正反向2条探针扩增技术在传统正向引物、正向探针和反向引 物模式基础上，增加了扩增核酸长度一致和TM值相同的临近反向引物、反向探针和正向 引物的序列设计技术，该技术较单正向序列的探针扩增敏感性高10 50倍左右，扩增效 率提高80%以上。序列设计如下正向引物1: NT2109-NT2127, 5， CCT GGG TGG GTA ATA ATT T 3，
反向引物1: NT2234-NT2217, 5， TTC CAA AAG TAA GGC AAG ATA TAT 3'
正向探针1: NT2142-NT2167， 5， FAM-CCA GGG ATC TAG TAG TCA ATT ATG TT—TAMRA 3，
正向引物2: NT2234-NT2215， 5， TTC CAA AAG TAA GGC AAG AT 3，
反向引物2: NT2131-NT2109, 5， CCT GGG TGG GTA ATA ATT TGG AA 3，
反向探针2: NT2200-NT2175, 5' FAM-TAG TTG CCT GAT CTT TAA ACC CAT GT-TAMRA 3，
4. PCR工作液中加入蓝色的"促荧光剂" 在无色的促荧光剂中加入终浓度为0.01 %的石绿，使最终配制的PCR工作液呈浅蓝色，
在PCR扩增的预变性过程退色，使PCR的操作轻松、准确，不但不影响荧光PCR的检测， 而且具有稳定荧光信号和增强荧光PCR扩增效率的重要功能。。
5. 荧光PCR扩增温度设置
采用两段变性和复性温度梯度的设定方法，只在后段温度梯度的复性期采集荧光信号， 温度条件如下50。C,2min;94。C2 min, (94°C 5s， 58°C， 40s) X3 cycles — (94°C 5s， 58°C 30s[采集荧光])X37 cycles
由于荧光PCR扩增的起始几个循环存在荧光信号不稳定的情况，并且临床检测的标本在 起始IO个循环均无阳性扩增，所以本方案在起始3 5个PCR循环未设定荧光采集，有助于 荧光曲线的分析及延长仪器荧光通道的使用寿命。
具体实施方式
1.技术试剂组成
1)微量核酸释放剂160pl(48T)/320)al(96T)2) PCR反应液:1700plXl管(48T) /2管(96T)
3) Taq DNA酶/UNG酶:8(^1 (48T) /160^1 (96T)
4) 促荧光剂60pl (48T) /120pl(96T)
5) 定量质控品HBV DNA标准质控血清①(6 9X108copies/ml) / HBV DNA标准质控血清 ②(0. 5 1. 2X107copies/ml) / HBV DNA标准质控血清③(1 3X 105copies/ml) / HBV DNA 标准质控血清④(4 9X103copies/ml) /阴性对照/各30(al
2. HBV DNA提取
3 pi微量核酸释放剂(浅蓝色)加3 pi待检血清和3 pi血清质控品，在管底吹打混 匀2 3下(变成无色)，加30u 1无菌石蜡油，用胶纸封严，进行如下温处理:85C， 30s—99 。C，7min— 5°C, 30s，备用。
3. PCR反应液配制与加样
按以下比例配制和加样反应液32.5ylX (n+4管血清校准品和1管阴性对照)，每管 加TaqDNA聚合酶/UNG混合酶1. 5 u 1和促荧光剂1 u 1;混匀稍离心后，按35 u 1/T的量直接 加入到HBV DNA提取管中，直接进入荧光PCR仪器扩增。
4. PCR扩增条件
50°C， 2min;94。C2 min， (94°C 5s， 58°C， 40s) X3 cycles — (94°C 5s， 58。C30s[荧光采 集])X37 cycles
5. 结果判断
结合4个定量校准血清曲线平台荧光值的3 6%确定荧光检测阈值。在定量范围内微调 4点血清校准品的量，使质控曲线的斜率在-3. 33±0. 1为佳；质控曲线的相关系数在0. 99以上为有效。本试剂盒的有效定量范围在3.5X102 2.5Xl()9copies/rnl，超出范围应使用阴性 血清进行10倍稀释进行复核；建议对低于500copies/ml的阳性标本进行复核后报告。
权利要求
1.采用带有指示和变色功能的“微量核酸释放剂”，实现在同一管内直接进行核酸提取与荧光PCR扩增微量血清与蓝色微量核酸释放剂在荧光PCR内混匀，蓝色微量核酸释放剂即变成无色，覆盖灭菌液体石蜡油经“85℃，30s→99℃，7min→5℃，30s”温处理后，直接加入荧光PCR工作液，即可进行荧光PCR扩增和分析结果。操作简捷、快速、无污染。
2. 该技术可直接对血清、血浆和全血标本中的HBV DNA进行荧光PCR检测。
3. 采用采用卫生部HBV标准质控血清，制备已知HBV DNA含量的4个梯度"原病毒血清 标准品"，作为荧光PCR定量标准品，该标准品与血清(血浆或全血)标本同时进行核 酸提取和荧光PCR扩增，实现从核酸提取到扩增的全程监控。
4. 采用双正反向4条引物和正反向2条探针扩增技术，在传统正向引物、正向探针和反向 引物模式基础上，增加了扩增核酸长度一致和TM值相同的临近反向引物、反向探针和正 向引物的序列设计技术，该技术较单正向序列的探针扩增敏感性高10 50倍左右，扩增 效率提高80%以上。
5. 在无色的促荧光剂中加入终浓度为0.01%的石绿，使最终配制的PCR工作液呈浅蓝色， 在PCR扩增的预变性过程退色，使PCR的操作轻松、准确，不但不影响荧光PCR的检 领(]，而且具有稳定荧光信号和增强荧光PCR扩增效率的重要功能。
6. 采用两段变性和复性温度梯度的设定方法，只在后段温度梯度的复性期采集荧光信号， 该方法不但方便荧光曲线的分析，而且延长荧光PCR仪器的使用寿命。
全文摘要
本发明采用申请人发明的微量核酸释放剂，实现在同一管中直接进行乙肝病毒核酸提取和荧光扩增，从根本上解决了多步骤核酸提取法带来的核酸丢失和污染问题，并首次适用于全血标本的荧光PCR检测；采用已定量的原病毒血清作为定量标准品，实现标准品对标本的全程监控；采用双对正反向引物和正反向两条荧光修饰的探针进行荧光PCR扩增，进一步提升其敏感性和扩增效率；引入蓝色的促荧光剂，使配制后的PCR工作液呈浅蓝色，在不影响荧光检测的同时，具有稳定荧光信号、增强扩增效率等作用；设定两段温度梯度程序，采用后段荧光采集法，方便分析并提高仪器的使用寿命；以上技术较传统方法具有革命性创新。
文档编号C12Q1/68GK101302560SQ200710097429
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者(请求不公开姓名) 申请人:王海滨