专利名称：松材线虫分子检测快速制样方法
技术领域：
本发明涉及一种林木病害生物的检测，具体涉及松材线虫(^//^sp力e7e/7c力M ^^op/^7"s)分子检测的DNA提取试剂及适合于口岸检验检疫、林间松材线虫病早期诊 断的快速制样技术。
背景技术：
松材线虫LSwnra; /2e/ewc/n^"/o/7fe7附(Steiner & Buhrer 1934) Nickle 1970]是当前 严重为害和威胁中国松林安全的最主要入侵的有害生物，是国际上公认的重要的检疫 性有害生物，也是世界四大林木病害之一。松材线虫是引起松树萎蔫病的主要原因，能 导致松树萎蔫病。此病又称松材线虫病，是松树的一种毁灭性病害，具有发病致死速度 快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点，因此被称为"松树癌症"。松树一旦感染此病， 最快的40多天即可枯死;病害流行很快，一般从发病到松林毁灭只需3 — 5年。此病自 1905年发现、1934年被报道以来，现己广泛分布于日本、美国、韩国、加拿大、墨西 哥、希腊、葡萄牙、挪威和中国等。其中受害最为严重的是日本和中国。日本每年用于 该病的防治费用占森林病虫害防治费用的93.6 % ,占林业总投资的20 % ，但每年因该病 损失木材仍然达100万m2左右。我国于1982年发现该病以来，现己扩展到江苏、浙江、 安徽、广东、山东、湖北、上海、香港和台湾等地,发生面积已超过73 hm2 ,死亡松树 200万株，造成林业经济、森林生态上的巨大损失和自然景观的严重破坏，并对我国广大 适生区的松林构成严重威胁。松材线虫由卵发育为成虫，其间要经过4龄幼虫期。雌、雄虫交尾后产卵，雌虫可 保持30天左右的产卵期，1条雌虫产卵约100粒。在生长最适温度(25°C)条件下约4天1 代，发育的临界温度为9.5'C，高于33'C则不能繁殖。由卵孵化的幼虫在卵内即蜕皮l 次，孵出的幼虫为2龄幼虫。秋末冬初，病死树内的松材线虫已逐渐停止增殖，并有自 然死亡，同时开始出现另一种类型的3龄幼虫，称为分散型3龄虫，进人休眠阶段，翌年 春季，当媒介昆虫松墨天牛将羽化时，分散型3龄虫蜕皮后形成分散型4龄虫，特称为 dauerlarvae，即休眠幼虫(耐久型幼虫)。这个阶段的幼虫即分散型3龄、分散型4龄幼 虫在形态上及生物学特性上都与繁殖阶段不同，如角质膜加厚、内含物增多，形成休眠 幼虫口针、食道退化，这阶段幼虫抵抗不良环境能力加强，休眠幼虫适宜昆虫携带传播。松材线虫的生物传播媒介主要是天牛，但远距离跳跃式迅速扩散蔓延的主要方式是 人为携带罹病木材和制品。松材线虫通过天牛补充营养的伤口进入木质部，寄生在树脂 道中。在大量繁殖的同时移动，逐渐遍及全株，并导致树脂道薄璧细胞和上皮细胞的破 坏和死亡，造成植株失水，蒸腾作用降低，树脂分泌急剧减少和停止。所表现出来的外 部症状是针叶陆续变为黄褐色乃至红褐色，萎蔫，最后整株枯死。由于松材线虫在实际检测中容易与同属的拟松材线虫CSi^^/^e/ewc/z^ 历"crorst"s)混淆，而后者对松树的致病力较弱，不属于植物检疫对象，因此对松材线 虫的准确、快速、灵敏鉴定，是控制病害扩散的关键。分子生物学技术因其高灵敏度，可靠性，准确性和特异性等优点，在林木病原物检 测中已经有相当广泛应用。现今检测松材线虫的分子生物学检测技术大多基于DNA的检 测，如DNA探针技术、基于DNA的体外扩增(PCR技术)技术和卫星DNA技术等，其 中应用最为广泛的是PCR技术。现有的各种松材线虫分子检测中，制样占了很长的时间。 这主要是由于目前松材线虫的检测样品大多都是采用布尔曼漏斗法或浅盘法以及在此 基础上改进的方法分离出松材线虫后，再提取其DNA，然后进行分子检测。分离松材 线虫一般用时需要24h后才能有良好的分离效果，而且当松材线虫密度低时难于分离出 松材线虫。因此，目前这种松材线虫分子检测的制样方法时间长，灵敏度低，不适用于 口岸检验检疫和林间松材线虫病早期诊断。发明内容本发明的目的是提供一种能快速的从疫木木屑中直接提取低至每克木屑中l条松 材线虫的DNA作为模板用于出入境和林间疫病防治中病害的松材线虫分子检测快速制样 方法。为达上述目的，本发明的具体方法是[1]用直径为7 10mm的电钻在待测木质材料上钻取木屑，将所得木屑混合均匀， 取l 8克木屑置于5 20ml离心管中； [2]将裂解液按每克木屑2 3毫升溶液的比例加入步骤[1]的离心管中，62 68°C 水浴1 2小时；所述裂解液由0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)， 0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)， 1% 十二烷基磺酸钠(SDS)在常温下的混合物，pH值为8.0;[3]将步骤[2]所得混合液经5000rc璃心10min后，将上清液600pl lml转入另一2 3ml离心管中，加入一定量变性液，使变性液的终浓度为4M,混合均匀后，室温下放置8 15min， 10000rc璃心8 10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rc璃心l 2min， 弃滤液；所述变性液是12M异硫氰酸胍；[4]在步骤[3]所述DNA吸附柱中加入清洗液600 80(V1， 10000rc璃心l 2min清洗， 弃滤液；所述清洗液是70%乙醇(V/V); [5]重复步骤[4]一次； [6]再次离心除去所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入溶解液50 60^1溶解DNA， 10000rcf离心1 2min，收集滤 液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。 采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于方法简单快捷，可以在3h内从木屑中直接提取出松材线虫的DNA，用于PCR检测。 可以检测出每克疫木中低至1条松材线虫的DNA，灵敏度高。本发明能对松材线虫检验检疫和林间采集的各种木质样品进行快速松材线虫DNA 样品制备，用于松材线虫分子生物学的快速鉴定或检测，尤其是对带虫的松材线虫疫木 流向实施跟踪和林间病害流行学动态进行预警监测，实际意义非常重大。以下实验可以证明本发明效果实验一1.准备用于松材线虫分子检测制样的试剂，其组成为[l]裂解液0.1M三羟甲基氨基甲垸(Tris)， 0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)， 1%十 二烷基磺酸钠(SDS)， PH值为8.0; [2]变性液12M异硫氰酸胍 [3]清洗液70%乙醇(V/V) [4]溶解液超纯水2.松材线虫分子检测快速制样的方法，按以下步骤进行-[1]用直径10mm的电钻在受检木质材料上钻取疫木木屑lg， 2g， 3g， 4g，分别混合 均匀后，放于5ml 15ml离心管中；[2]将上述裂解液按每克木屑2ml 3ml的比例加入有木屑的离心管中，65'C水浴1 小时；[3]将装有木屑和裂解液的离心管经5000rc璃心10niin后，取其上清液600pl lml 转入另一2ml离心管中。加入上述的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室 温下放置10min， 10000rc璃心10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rc璃心lmin， 弃滤液；[4]在DNA吸附柱中加入上述的清洗液75(^1， 10000rc璃心lmin清洗，弃滤液；[5]重复步骤[4]一次；[6] 10000rcf再次离心DNA吸附柱l次，彻底除去上述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入上述的溶解液5(Hi1， 10000rc璃心lmin，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。结果判定标准是-以松材线虫特异DNA序列为引物，通过PCR扩增，电泳有目标靶带出现即为松材线虫 样品。实际检测l 4g疫木均可以检测出其中的松材线虫，电泳显示出松材线虫特异DNA 靶带。实验二[1]以直径10mm的电钻钻取健康松木木屑lg， 1.5g， 2g， 2.5g，分别加入l条松材线 虫与木屑混合均匀，放于10ml离心管中；[2]将实验一所述裂解液按lg/3ml比例加入步骤[l]的离心管中，65"水浴1小时；[3]木屑线虫混合液经5000rc璃心10min后，将上清液800nl lml转入另一2ral离心 管中。加入实验一所述的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置 10min， lOOOOrc缡心lOmin后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rc璃心lmin，弃滤液；[4]在柱中加入实验一所述的清洗液750nl， 10000rc璃心lmin清洗，弃滤液；[5]重复步骤[4]一次；[6] 10000rcf将清洗后的DNA吸附柱再次离心l次，除去实验一所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入实验一所述的溶解液50nl， 10000rc璃心lmin，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。将得到的样品对松材线虫特异引物进行PCR扩增，根据DNA扩增条带的亮度来判断本制样方法的检测灵敏度。实验结果显示该制样方法配合常规PCR技术，可以检测出1.5克木屑中的1条松材线虫。实验三、(一)、常规布氏漏斗法提取疫木中松材线虫DNA:[1]将待检感病松木段去皮砍成厚薄为l 2mm的薄木片20克置于铺有双层滤纸的布 氏漏斗上。布氏漏斗下接一段乳胶管，用止水夹夹住末端。加温水(2(TC 3(TC)浸泡 木片，8hr以后打开止水夹放水到培养皿中，显微镜检査水中是否有游离出的线虫。[2]如有线虫则离心收集含线虫水悬液200nl，加入实验一所述裂解液40(^1， 65°C 水浴30分钟；[3]线虫裂解物经12000rc璃心10min后，将上清液约500nl转入另一3ml离心管中。 加入实验一所述的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置12min， 10000rc缡心10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rc璃心1.5min，弃滤液；[4]在DNA吸附柱中加入实验一所述的清洗液750nl， 10000rc璃心2min清洗，弃滤液；[5]重复步骤[4]一次；[6] 10000rcf再次离心DNA吸附柱l次，除去实验一所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入实验一所述的溶解液50^1， 10000rc璃心2min，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。此方法所需时间为9小时左右。时间太短不能保证松材线虫已经分离出来，可能造成假阴性。(二)、用本发明所述方法提取疫木中松材线虫DNA:[1]用直径9mra的电钻在受检材料不同位置上钻取疫木木屑20克，木屑混合均匀，取3克木屑于10ml离心管中；[2]将实验一所述裂解液按lg/3ml比例加入步骤[l]的离心管中，65'C水浴1小时； [3] 线虫裂解产物经5000rcf离心10min后，将上清液约80(^l linl转入另一3ml离心管中。加入实验一所述的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置12min， 10000rc璃心10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rc缡心1.5min，弃滤液；[4]在DNA吸附柱柱中加入实验一所述的清洗液750pl， 10000rc璃心2min清洗，弃 滤液；[5]重复步骤[4]一次；[6] 10000rcf离心经步骤[5]清洗后的DNA吸附柱l次，除去实验一所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入实验一所述的溶解液50nl， 10000rc缡心2min，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。此方法所需制样时间为2小时以内。不需要分离线虫，保证了检测效果可靠性。实验结果表明采用传统方法即常规布氏漏斗法提取疫木中松材线虫DNA，所花时 间长，而且受松材线虫活动性影响大，结果不确定；而采用本发明方法直接从感病寄主 木屑中提取松材线虫DNA作为PCR检测的模板，不受松材线虫活动性影响，结果可靠， 并大大缩短了制样的时间。
具体实施方式
实施例1:1. 准备用于松材线虫分子检测制样的试剂，共4种试剂，其组成分别是-[l]裂解液0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)， 0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)， 1%十 二烷基磺酸钠(SDS)， PH值为8.0; [2]变性液12M异硫氰酸胍 [3]清洗液70%乙醇(V/V) [4]溶解液超纯水2. 松材线虫分子检测快速制样的方法，按以下步骤进行[1]用直径7mm的电钻在受检木质材料不同部位上钻取疫木木屑10g左右，将木屑混合均 匀后取5g装入15ml离心管中；将上述裂解液按lg/2ml比例加入步骤[l]的离心管中，63。C水浴l小时；[3]将木屑及裂解液混合物经5000rc璃心10min后，将其上清液1000pl转入另一3ml 离心管中，加入上述的变性液，使变性液的终浓度为4M,混合均匀后，室温下放置10min， 10000rc璃心10min后将上清液转入DNA吸附柱中，lOOOOrc璃心lmin，弃滤液；[4]经步骤[3]后的DNA吸附柱中加入上述的清洗液80(V1， 10000rc璃心lmin清洗， 弃滤液；[5]重复步骤[4]一次；[6] lOOOOrcf再次对DNA吸附柱离心l次，除去上述的清洗液； [7]经步骤[6]清洗后的DNA吸附柱中加入上述的溶解液50pl， 10000rc璃心lmin， 收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。实施例2:取用实施例l所述的松材线虫分子检测制样的试剂裂解液、变性液、清洗液、溶解液。松材线虫分子检测快速制样的方法，按以下步骤进行[1]用直径10mm的电钻在受检木质材料不同部位上钻取疫木木屑1.5g，将木屑混合 均匀后转入5ml离心管中；[2]将上述裂解液按lg/3ml比例加入有木屑的离心管中，65匸水浴1.5小时；[3]木屑与裂解液混合物经5000rc璃心10min后，取上清液600nl转入另一新的2ml 离心管中，加入上述的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置15min， 10000rc璃心12min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rc璃心1.5min，弃滤液；[4]在DNA吸附柱中加入上述的清洗液650pl， 10000rc璃心1.5min清洗，弃滤液；[5]重复步骤[4]一次；[6] DNA吸附柱10000rc璃心l次，除去上述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入上述的溶解液60)il， 10000rcf离心1.5min，收集滤液，即为 松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。
权利要求
1.一种松材线虫分子检测快速制样方法，其特征在于，按以下步骤进行[1]用直径为7～10mm的电钻在待测木质材料上钻取木屑，将所得木屑混合均匀，取1～8克木屑放于5～20ml离心管中；[2]将裂解液按每克木屑2～3毫升溶液的比例加入步骤[1]的离心管中，62～68℃水浴1～2小时；所述裂解液由0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)在常温下的混合物，pH值为8.0；[3]将步骤[2]所得混合液经5000rcf离心10min后，将其上清液600μl～1ml转入另一2～3ml离心管中，加入一定量的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置8～15min，10000rcf离心8～10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rcf离心1～2min，弃滤液；所述变性液是12M异硫氰酸胍；[4]在上一步的DNA吸附柱中加入清洗液600～800μl，10000rcf离心1～2min清洗DNA，弃滤液；所述清洗液是70％乙醇(V/V)；[5]重复步骤[4]一次；[6]再次离心除去所述的清洗液；[7]DNA吸附柱中加入溶解液50～60μl溶解DNA，10000rcf离心1～2min，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测。所述溶解液为超纯水。
全文摘要
本发明涉及一种松材线虫分子检测快速制样方法，是专门针对对林业影响巨大的松材线虫而建立起的快速制样的方法。利用该方法，不需要分离线虫，就可以直接提取疫木中松材线虫DNA用于分子检测。配合PCR技术，可以检测出1.5克木屑中的1条松材线虫，时间仅需要3h，效果稳定可靠。该方法克服了传统松材线虫检测制样方法时间较长、效果不稳定的缺点；适用于进出口通关木质材料松材线虫的快速检验检疫和林间病害早期诊断中大批量样品的检测。
文档编号C12Q1/68GK101153334SQ20071009278
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月29日 优先权日2007年9月29日
发明者刘裕兰, 夏玉先, 彭国雄, 曹月青, 殷幼平, 王中康, 青 袁 申请人:重庆大学