一种同时受外源IPTG和O₂浓度调控的表达载体及其构建方法

专利名称：一种同时受外源IPTG和O₂浓度调控的表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种生物表达载体，尤其涉及一种同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体及其构建。

背景技术：
光合细菌广泛分布于淡水，海水，极地或温泉(包括高热水体)以及高盐，高有机质含量等不同的生态环境中，是一类进行不产氧光合作用，具有复杂代谢功能的微生物。紫色非硫细菌科红细菌属的类球红细菌Rhodobactersphaeroides是一种革兰氏阴性光合细菌，是研究捕光系统的重要模式生物。
当类球红细菌利用光能获得能量进行生长代谢的过程中，捕光系统发挥了重要的作用，首先利用捕光系统2(Light-harvesting2或LH2)吸收光子，然后传递到捕光系统1(Light-harvesting1或LH1)，LH1环抱着光合反应中心(Reaction Center或RC)，LH1直接将获得的光子传递到RC，最终在RC中发生能量交换。LH2、LH1和RC都是类球红细菌进行光合作用的工具，是典型的跨膜蛋白。目前，人们利用X-射线衍射、透射电子显微镜、原子力显微镜等技术对LH2、LH1以及RC的结构和功能进行了较为深入的研究，尤其对LH2的认识比较深入。类球红细菌LH2由九个alpha亚基和九个beta亚基组成，alpha亚基和beta亚基分别结合不同数目的菌绿素和类胡萝卜素，菌绿素的作用主要是吸收光子，而类胡萝卜素的作用主要是保护细菌免受光合氧化作用的破坏。由于菌绿素和类胡萝卜素的存在，LH2在800nm和850nm处有特征吸收峰。其中alpha亚基大小为5.457KDa，beta亚基的大小为6.809KDa，分别由puc操纵子(puc operon)中的结构基因pucA和pucB编码。此外，puc操纵子中的结构基因pucC对alpha亚基和beta亚基正确组装成有功能的LH2起着重要的作用。puc操纵子的表达主要受到氧气密度和光照强度的影响。氧气密度越高，表达水平越低，反之，则越高；光照强度越强，表达水平越低，反之，越高；氧气密度对puc操纵子表达水平的影响强于光照强度。当在合适的氧气浓度或者光照强度条件下，光合细菌的内膜会自动凹陷，极大的增加了光合细菌的内膜系统，为膜蛋白的表达提供了大量的空间，为了填充这些空间，光合细菌puc操纵子中的结构基因pucB、pucA和pucC大量表达，并迅速在内膜上组装成捕光系统2。由于天然的puc启动子在有氧条件下有部分本底表达，而且培养液内氧气浓度难于实时监控，使得利用puc操纵子在类球红细菌中表达外源蛋白难于人为调控。
目前，已利用大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq和操纵基因Lac0，构建了一系列受外源IPTG调控的强杂合启动子和表达载体，并广泛应用于大肠杆菌表达系统，生产出大量对人类健康有重要作用的药用蛋白或多肽，为人类的发展做出了重大的贡献。光合细菌类球红细菌是一类广泛存在于自然界的重要微生物，生长迅速，易于培养，操作简单。但是，到目前为止，还没有被人类利用来生产有用的药用蛋白或多肽。其根本原因就在于还没有建立一个可以在类球红细菌中人为调控外源蛋白表达的强杂合启动子和表达载体。因此，构建一个能人为调控的，在类球红细菌中启动外源蛋白表达的强启动子及其表达载体，为类球红细菌表达系统的建立和开发应用提供了必备的工具和前提条件。


发明内容
本发明根据类球红细菌puc操纵子能在合适条件下大量表达的特点，利用乳糖操纵子调节基因LacIq和操纵基因Lac0，与类球红细菌puc操纵子的启动子构建成一个同时受外源IPTG和O2调控的强杂合启动子，同时在结构基因pucB后插入Xa因子、限制性内切酶位点和10个组氨酸编码序列，便于接入外源基因构建成pucB融合蛋白，该表达载体可以在类球红细菌LH2缺失突变株中大量诱导表达，并可经组氨酸亲和层析法分离纯化外源蛋白。该发明可用于利用类球红细菌研究光合细菌中各种光合系统基因的表达以及在类球红细菌表达系统中人为调控外源蛋白的表达和纯化。
因此，本发明的目的是提供一种同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体的构建方法，该方法主要包括以下步骤 (1)大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的PCR扩增并连接到表达载体pRK415上； (2)类球红细菌puc操纵子的启动子和大肠杆菌乳糖操纵子的操纵基因Lac0的PCR扩增及与步骤(1)中所得的连接产物连接； (3)类球红细菌puc操纵子的SD序列，结构基因pucB和Xa因子的PCR扩增及与步骤(2)中所得的连接产物连接； (4)10个组氨酸编码序列和类球红细菌操纵子的结构基因pucA，pucC及终止子的PCR扩增及与步骤(3)中所得的连接产物连接。
本发明的进一步方案中，上述步骤(1)中采用的PCR引物为SEQ ID2和SEQ ID3的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO4。
步骤(2)中采用的PCR引物为SEQ ID5和SEQ ID6的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO7。
步骤(3)中采用的PCR引物为SEQ ID8和SEQ ID9的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO10。
步骤(4)中采用的PCR引物为SEQ ID11和SEQ ID12的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO13。
步骤(4)中构建完成的表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO14。
步骤(4)中构建完成的表达载体具有一个同时受外源IPTG和O2浓度调控的强杂合启动子。
为了证明本发明所构建同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体的有效性，本发明提供了该表达载体转化宿主菌、诱导表达及基因表达情况检测的方法，主要包括以下步骤 (a)表达载体转化大肠杆菌S17-1； (b)表达载体经接合转移到类球红细菌； (c)类球红细菌pucB、pucA和pucC的诱导表达； (d)类球红细菌pucB、pucA和pucC基因表达情况的检测。
本发明的较佳技术方案中，上述步骤(a)中采用的受体菌是大肠杆菌S17-1。
步骤(a)中采用CaCl2转化法将上述同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体转化到上述的大肠杆菌S17-1。
步骤(b)中采用的受体菌是类球红细菌DD13。
步骤(b)中采用接合转移法将上述同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体从上述的大肠杆菌S17-1转移到上述的类球红细菌DD13。
步骤(c)中采用外源IPTG和O2浓度诱导上述同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体上类球红细菌pucB、pucA和pucC基因的表达。
步骤(d)中采用分光光度计扫描检测所述的pucB、pucA和pucC基因的表达情况。
本发明的优点是经过上述步骤构建的表达载体具有同时受外源IPTG和O2浓度调控的强杂合启动子，使得该表达载体在光合细菌类球红细菌中能够人为调控表达，外源蛋白第一次可以在类球红细菌中，通过外源IPTG人为调控表达，为建立光合细菌类球红细菌外源蛋白表达系统提供了必备的工具。此外，在添加外源IPTG之前，本发明所构建表达载体在类球红细菌中可以达到无本底表达，避免了有毒外源蛋白对宿主菌——类球红细菌迅速生长的影响，对有毒外源蛋白的大量表达具有重要意义。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。



图1为本发明的同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体的构建过程示意图； 图2为本发明的重组质粒pRK-Iq经EcoRI和XhoI的双酶切鉴定电泳图； 图3为本发明的pucB、pucA和pucC基因表达情况的检测图谱； 图4为本发明的步骤示意图。

具体实施例方式 材料 1.PrimeSTARTM HS DNA聚合酶(Takara公司产品，中国大连) 2.各种限制性内切酶(Takara公司产品，中国大连) 3.连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.0(Takara公司产品，中国大连) 4.DNA纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒(天为时代公司产品，中国北京) 5.DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(Takara公司产品，中国大连) 6.大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara公司产品，中国大连) 7.大肠杆菌S17-1(美国典型微生物菌种保藏中心，保藏登记号为ATCC No.47055，保藏时间1960) 8.类球红细菌RS-1(英国国家菌种保藏中心，保藏登记号为UKNCC No.8253，保藏时间1956) 注以下试剂均为市售产品。
9.LB培养基 酵母提取物 5g 胰蛋白胨 10g NaCl 10g 固体培养基加入2％(w/v)琼脂粉 溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌。
10.M22+培养基 固体M22+向100ml 10×M22储备液中加入900ml去离子水和15g琼脂粉，混匀，高压蒸汽灭菌。使用之前使固体培养基溶解，降温到60℃时加入1ml过滤灭菌的1000×维生素混合液。
其中10×M22储备液的配制 KH2PO430.6g K2HPO4.3H2O 30g 乳酸钠 25g (NH4)2SO4 5g NaCl5g 琥珀酸钠43.425g 谷氨酸钠2.7g 天冬氨酸0.4g Solution C 200ml 去离子水定容到1000ml，用NaOH调节pH值至6.8，高压蒸汽灭菌。
其中Solution C的配制 MgCl2.6H2O 24g CaCl2 3.34g EDTA.Na2.2H2O 0.125g ZnCl2 0.261g FeCl2.4H2O 0.25g MnCl2.4H2O 0.09g (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.009g CuCl2.2H2O 0.008g Co(NO3)2.6H2O 0.0124g 硼酸 0.0057g 氮川三乙酸10g 去离子水定容到1000ml，-20℃保存，无需灭菌。
其中1000×维生素混合液的配制 烟酸 1g 硫胺素0.5g 对氨基苯甲酸 0.1g 生物素0.01g 去离子水定容到1000ml，过滤灭菌，-20℃保存。
液体M22+在超净工作台上向一经过高压蒸汽灭菌的1L培养瓶中分别加入100ml高压蒸汽灭菌的10×M22储备液，1ml过滤灭菌的1000×维生素混合液，20ml 5％高压蒸汽灭菌的酸水解酪素和879ml灭菌去离子水，混匀后于4℃保存备用。
其中5％酸水解酪素的配制 称取5g酸水解酪素，用去离子水溶解定容到100ml，高压蒸汽灭菌，-20℃保存。
实施例一大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的PCR扩增和连接 按照DNA提取试剂盒的操作说明，从大肠杆菌JM109中提取基因组DNA，根据GenBank上报道的大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的突变启动子和蛋白质编码序列(GenBank accession numberEF189157)设计一对PCR引物A1和A2(SEQID NO2和SEQ ID NO3)，上游引物A1的5′端含有保护碱基和酶切位点SacI、XhoI，下游引物A2的5′端含有保护碱基和酶切位点EcoRI，引物序列如下 A15’-CTCTGAGCTCGAGGACACCATCG AATGGTGC-3’(SEQ ID NO2) A25’-CTCTGAATTCTAATTGCGTTGCGCTCACTG-3’(SEQ ID NO3) PCR的反应体系为100μl，其中含引物A1和A2各20pmol，200μmol的dNTP，1μl基因组DNA，5×PrimeSTARTM反应缓冲液20μl，高保真的PrimeSTARTM HSDNA聚合酶5U。PCR的反应条件为第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物(SEQ ID NO4)经1％琼脂糖电泳检测可见约1200bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
参照图1，取适量纯化PCR产物进行EcoRI酶切，酶切体系为2μl 10×H缓冲液，1μl EcoRI酶液，适量PCR产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化EcoRI酶切产物，然后取适量纯化EcoRI酶切产物进行SacI酶切，酶切体系为2μl 10×L缓冲液，1μl SacI酶液，适量EcoRI酶切产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化SacI酶切产物。同时，按照上述酶切体系将广宿主性表达载体pRK415质粒DNA(SEQ ID NO1)(pRK415质粒来源Keen，N.T.，S.Tamaki，D.Kobayashi，and D.Trollinger.1988.Improved broad-host-range plasmids for DNAcloning in Gram-negative bacteria.Gene 70191 197.)进行EcoRI和SacI分步酶切并纯化。
按照连接试剂盒的操作说明将适量经EcoRI和SacI酶切的pRK415质粒DNA和LacIq PCR产物进行连接。连接产物通过CaCl2转化法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，经10μg/ml四环素抗性筛选后，挑取LB平板上的白色菌落于含有10μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃，250rpm，振荡培养过夜，次日提取质粒DNA，用EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定，酶切体系为2μl 10×H缓冲液，0.5μl EcoRI酶液，0.5μl XhoI酶液，适量质粒DNA，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，酶切图谱如图2所示，其中分子量标记物是DL2000plus(分子量从大到小为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。由于pRK415质粒DNA没有XhoI酶切位点，上述PCR引物A1的5’端引入了一个XhoI酶切位点，如果上述PCR产物正确插入pRK415质粒DNA，重组质粒就具有一个XhoI单酶切位点，经EcoRI和XhoI双酶切可以切出约1200bp大小的上述PCR产物片段，对于酶切正确的重组质粒进行测序，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的启动子和完整的编码序列，该重组质粒命名为pRK-Iq。
实施例二类球红细菌puc操纵子启动子pucP和大肠杆菌乳糖操纵子操纵基因Lac0的PCR扩增和连接 利用DNA提取试剂盒提取类球红细菌RS-1基因组DNA，根据GenBank上报道的puc操纵子序列(GenBank accession numberX68796)设计一对PCR引物B1和B2(SEQ ID NO5和(SEQ ID NO6)，上游引物B1的5’端含有保护碱基和酶切位点XhoI，下游引物B2的5’端含有保护碱基和酶切位点KpnI以及大肠杆菌乳糖操纵子操纵基因Lac0，引物序列如下 B15’-ATATCTCGAGGCCTCGGA CACCCTCGTT TTTGC-3’(SEQ ID NO5) B25’ -CTCTGGTACCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATGGGTGTCAC-3’(SEQID NO6) PCR的反应体系为100μl，其中含引物B1和B2各20pmol，200μmol的dNTP，1μl RS-1基因组DNA，5×PrimeSTARTM反应缓冲液20μl，高保真的PrimeSTARTMHS DNA聚合酶5U。PCR的反应条件为第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物(SEQ ID NO7)经1.5％琼脂糖电泳检测可见约250bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
参照图1，取适量纯化PCR产物进行XhoI酶切，酶切体系为2μl 10×H缓冲液，1μl XhoI酶液，适量PCR产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化XhoI酶切产物，然后取适量纯化XhoI酶切产物进行KpnI酶切，酶切体系为2μl 10×L缓冲液，1μl KpnI酶液，适量XhoI酶切产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化KpnI酶切产物。同时，按照上述酶切体系将pRK-Iq质粒DNA进行XhoI和KpnI分步酶切并纯化。
按照连接试剂盒的操作说明将适量经XhoI和KpnI酶切的pRK-Iq质粒DNA和PCR产物进行连接。连接产物按照实施例1中所述方法转化、筛选和鉴定阳性重组质粒并进行序列测定，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是类球红细菌puc操纵子启动子pucP和大肠杆菌乳糖操纵子操纵基因Lac0，该重组质粒命名为pRK-PO。
实施例三类球红细菌puc操纵子SD序列，结构基因pucB和Xa因子的PCR扩增和连接 根据GenBank上报道的puc操纵子序列(GenBank accession numberX68796)设计一对PCR引物C1和C2(SEQ ID NO8和SEQ ID NO9)，上游引物C1的5′端含有保护碱基和酶切位点KpnI，下游引物C2的5′端含有保护碱基，酶切位点XbaI和SacI，以及3’端插入Xa因子的编码序列，引物序列如下 C15’-ATATGGTACCAGTTGGGAGACGACACAGTGACTG-3’(SEQ ID NO8) C25’-ATATTCTAGAGAGCTCCCTTCCCTCGATGCCGAGCCACGGGGTC-3’(SEQ IDNO9) PCR的反应体系为100μl，其中含引物C1和C2各20pmol，200μmol的dNTP，1μl RS-1基因组DNA，5×PrimeSTARTM反应缓冲液20μl，高保真的PrimeSTARTMHS DNA聚合酶5U。PCR的反应条件为第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物(SEQ ID NO10)经1.5％琼脂糖电泳检测可见约200bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
参照图1，取适量纯化PCR产物进行KpnI酶切，酶切体系为2μl 10×L缓冲液，1μl KpnI酶液，适量PCR产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化KpnI酶切产物，然后取适量纯化KpnI酶切产物进行XbaI酶切，酶切体系为2μl 10×M+BSA缓冲液，1μl XbaI酶液，适量KpnI酶切产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化XbaI酶切产物。同时，按照上述酶切体系将pRK-PO质粒DNA进行KpnI和XbaI分步酶切并纯化。
按照连接试剂盒的操作说明将适量经KpnI和XbaI酶切的pRK-PO质粒DNA和PCR产物进行连接。连接产物按照实施例一中所述方法转化、筛选和鉴定阳性重组质粒并进行序列测定，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是类球红细菌puc操纵子SD序列，结构基因pucB和Xa因子编码序列，该重组质粒命名为pRK-BXa。
实施例四10个组氨酸编码序列和类球红细菌操纵子结构基因pucA，pucC及终止子的PCR扩增和连接 根据GenBank上报道的puc操纵子序列(GenBank accession numberX68796)设计一对PCR引物D1和D2(SEQ ID NO11和SEQ ID NO12)，上游引物D1的5′端含有保护碱基和酶切位点XbaI，以及10个组氨酸编码序列，下游引物D2的5′端含有保护碱基，酶切位点PstI，引物序列如下 D15’-ATATTCTAGACACCACCACCACCACCACCACCACCACCACTAAGTCGACGGATCTACTAGTCAGGAGAAGACTGACATGAC-3’(SEQ ID NO11) D25’-ATATCTGCAGCAGTGGCAGGCAGGTCGCTGCCTAG-3’(SEQ ID NO12) PCR的反应体系为100ul，其中含引物D1和D2各20pmol，200μmol的dNTP，1μl RS-1基因组DNA，5×PrimeSTARTM反应缓冲液20μl，高保真的PrimeSTARTMHS DNA聚合酶5U。PCR的反应条件为第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，循环30次；第三阶段72℃延伸10分钟。所得PCR产物(SEQ ID NO13)经1.0％琼脂糖电泳检测可见约2000bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
参照图1，取适量纯化PCR产物进行XbaI酶切，酶切体系为2μl 10×M+BSA缓冲液，1μl XbaI酶液，适量PCR产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化XbaI酶切产物，然后取适量纯化XbaI酶切产物进行PstI酶切，酶切体系为2μl 10×H缓冲液，1μl PstI酶液，适量XbaI酶切产物，加灭菌双蒸水到20μl，37℃酶切1小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化PstI酶切产物。同时，按照上述酶切体系将pRK-BXa质粒DNA进行XbaI和PstI分步酶切并纯化。
按照连接试剂盒的操作说明将适量经XbaI和PstI酶切的pRK-BXa质粒DNA和PCR产物进行连接。连接产物按照实施例一中所述方法转化、筛选和鉴定阳性重组质粒并进行序列测定，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是10个组氨酸编码序列，终止密码子，类球红细菌puc操纵子结构基因pucA，pucC及puc操纵子的终止子，该重组质粒命名为pRK-CH。
经过上述实施例1-4的载体构建过程，构建成了一个具有同时受外源IPTG和O2浓度调控的强杂合启动子的表达载体，该表达载体就为上述的pRK-CH(SEQID NO14)。
实施例五表达载体转化大肠杆菌S17-1 (1)S17-1感受态细胞的制备 取-80℃保藏的大肠杆菌S17-1划线于LB平板上，37℃过夜培养；挑单菌落接种于10ml LB培养液中，37℃，250rpm，振荡培养过夜；取1ml过夜培养物加入100ml LB培养液中，37℃，250rpm，振荡培养2小时；将100ml培养物置于冰水中10分钟使细菌冷却到0℃；然后于4℃，2500rpm，离心7分钟；弃上清，用10ml冰浴预冷的0.1M CaCl2重悬；4℃，2000rpm，离心5分钟；弃上清，用2ml冰浴预冷的0.1M CaCl2重悬，冰水中静置2小时备用。
(2)转化 取100μl冰浴的S17-1感受态细胞加到预冷的1.5ml EP管中，再加入1μl构建好的表达载体pRK-CH质粒DNA，轻轻地混合均匀，冰水中放置30分钟；然后于42℃热激90秒，迅速置于冰水中，放置2分钟；加入500μl LB培养液，37℃，150rpm，振荡培养1小时；取50μl菌液均匀涂布于含有10μg/ml四环素的LB平板上，37℃，倒置培养过夜。次日，于四环素抗性平板上正常生长的为S17-1转化菌。
实施例六表达载体经接合转移到类球红细菌 按照Jones等(Jones MR，Fowler GJ，Gibson LC，Grief GG，Olsen JD，Crielaard W，Hunter CN.Mutants of Rhodobacter sphaeroides lacking oneor more pigment-protein complexes and complementation withreaction-centre，LH1，and LH2 genes.Mol Microbiol.1992；6(9)1173-1184.)报道的方法，将类球红细菌RS-1中的捕光系统1，捕光系统2和光合反应中心敲除，获得类球红细菌突变株DD13。当表达载体pRK-CH转化到类球红细菌突变株DD13后，在外源IPTG和合适氧浓度条件下表达出捕光系统2的alpha亚基和beta亚基，正确组装成有功能的捕光系统2，在800nm和850nm处可检测出特征吸收峰，互补了类球红细菌突变株DD13捕光系统2缺失的功能。
将类球红细菌突变株DD13划线于含有20μg/ml新霉素的M22+培养基上，34℃，黑暗，倒置培养3天；挑取DD13单菌落接种于10ml含有20μg/ml新霉素的M22+培养液中，34℃，250rpm，黑暗振荡培养过夜；次日，4℃，6000rpm，离心10分钟收集菌体，1ml LB培养液重悬菌体；刮取S17-1转化菌单菌落加入100μl LB细菌重悬液中，充分混匀，然后滴到充分干燥的LB培养基上，34℃，培养6h-8小时，从LB培养基上刮取细菌，1ml M22+重悬菌体，取100μl重悬菌液涂布于M22+培养基上(含有四环素1μg/ml，新霉素20μg/ml)，34℃，黑暗培养3-4天左右即可看到红色菌落；由于表达载体pRK-CH上含有四环素抗性基因，类球红细菌突变株DD13基因组中含有新霉素抗性基因，只有含有表达载体pRK-CH质粒DNA的类球红细菌才能在具有这两种抗生素的培养基中正常生长，所以这些红色菌落即为含有表达载体pRK-CH质粒DNA的类球红细菌；挑取单菌落接种到10ml M22+培养液(四环素1μg/ml，新霉素20μg/ml)中，34℃，250rpm，黑暗振荡培养过夜；次日，-80℃菌种保藏，保藏菌命名为RS-CH。
实施例七类球红细菌pucB、pucA和pucC的诱导表达 取-80℃保藏菌RS-CH划线培养于M22+培养基(四环素1μg/ml，新霉素20μg/ml)上，34℃，黑暗倒置培养3天；挑取单菌落接种到10ml M22+培养液(四环素1μg/ml，新霉素20μg/ml)中，34℃，250rpm，黑暗条件下振荡培养过夜；取1ml过夜培养物接种到200ml M22+培养液中(四环素1μg/ml，新霉素20μg/ml，培养液体积为容器的50％)，34℃，250rpm，黑暗条件下振荡培养20小时；加入IPTG至终浓度1mM，34℃，150rpm，黑暗条件下诱导5小时。同时，在相同条件下，没有IPTG诱导的RS-CH菌，IPTG诱导DD13菌和未达到半厌氧条件下(黑暗条件下振荡培养＜20小时)即加入IPTG诱导的RS-CH菌做为阴性对照。
实施例八类球红细菌pucB、pucA和pucC基因表达情况的检测 采用分光光度计Lambda 900UV/VIS/NIR spectrometer(美国)，以M22+培养液为参比，在700-900nm波长范围内扫描转化菌RS-CH的诱导培养液，在800nm和850nm分别出现特征吸收峰，而上述实施例七中所述的三个阴性对照培养液在相应波长范围内无特征吸收峰出现，扫描结果如图3所示，图中A为未达到半厌氧条件下(黑暗条件下振荡培养＜20小时)即加入IPTG诱导的RS-CH菌液扫描结果，图中B为未加IPTG诱导的RS-CH菌液扫描结果，图中C为达到半厌氧条件下(黑暗条件下振荡培养20小时)才加入IPTG诱导的RS-CH菌液扫描结果，图中D为达到半厌氧条件下(黑暗条件下振荡培养20小时)才加入IPTG诱导的DD13菌液扫描结果。由此可见，本发明构建的表达载体pRK-CH已成功转入类球红细菌突变体DD13中，并只有在外源IPTG和厌氧条件下才能诱导表达出光合细菌捕光系统2的alpha和beta亚基，并正确组装成有功能的捕光系统2，从而结合菌绿素和类胡萝卜素，于800nm和850nm处分别出现特征吸收峰，互补了类球红细菌突变体DD13捕光系统2缺失的功能。由此可见，本发明构建的表达载体中同时受外源IPTG和O2浓度调控的杂合启动子，能在类球红细菌中有效的、人为的启动pucB、pucA和pucC基因的表达。
本发明提供的上述表达载体的构建方法及证明其有效性的步骤示意图如图4所示，本发明的实验结果表明，通过将乳糖操纵子操纵基因Lac0和紫色非硫细菌科红细菌属的类球红细菌的puc操纵子的启动子进行杂合连接成一个强杂合启动子，并引入乳糖操纵子调节基因LacIq，Xa因子以及10个组氨酸的DNA序列，构建成同时由外源IPTG和氧气浓度调控的表达载体，该表达载体可在类球红细菌中诱导表达光合细菌捕光系统2的alpha和beta亚基，以及其他外源蛋白。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
<110>重庆大学
<120>一种同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体及其构建方法
<130>
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>10690
<212>DNA
<213>载体pRK415质粒DNA序列
<400>1
ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggatggga60
ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc 120
ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat tggtttaaaa 180
gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt gcaaatgctg 240
gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca tctgtcagca 300
ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt cagtagtcgc gcccctcaag 360
tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg gaaactcgcg 420
taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc cggccgaaat 480
cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca agtgtcaacg 540
tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca acgccggcgg 600
ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg cgtttgcagg gccatagacg 660
gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg tcggaaaggc gctcttccgc 720
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 780
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 840
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 900
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 960
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 1020
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 1080
gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 1140
tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 1200
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcgagctc ggtacccggg 1260
gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 1320
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 1380
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 1440
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 1500
gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctcg gtcttgcctt gctcgtcggt gatgtacttc 1560
accagctccg cgaagtcgct cttcttgatg gagcgcatgg ggacgtgctt ggcaatcacg 1620
cgcacccccc ggccgtttta gcggctaaaa aagtcatggc tctgccctcg ggcggaccac 1680
gcccatcatg accttgccaa gctcgtcctg cttctcttcg atcttcgcca gcagggcgag 1740
gatcgtggca tcaccgaacc gcgccgtgcg cgggtcgtcg gtgagccaga gtttcagcag 1800
gccgcccagg cggcccaggt cgccattgat gcgggccagc tcgcggacgt gctcatagtc 1860
cacgacgccc gtgattttgt agccctggcc gacggccagc aggtaggccg acaggctcat 1920
gccggccgcc gccgcctttt cctcaatcgc tcttcgttcg tctggaaggc agtacacctt 1980
gataggtggg ctgcccttcc tggttggctt ggtttcatca gccatccgct tgccctcatc 2040
tgttacgccg gcggtagccg gccagcctcg cagagcagga ttcccgttga gcaccgccag 2100
gtgcgaataa gggacagtga agaaggaaca cccgctcgcg ggtgggccta cttcacctat 2160
cctgcccggc tgacgccgtt ggatacacca aggaaagtct acacgaaccc tttggcaaaa 2220
tcctgtatat cgtgcgaaaa aggatggata taccgaaaaa atcgctataa tgaccccgaa2280
gcagggttat gcagcggaaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc2340
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct2400
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat2460
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc2520
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg2580
ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc2640
gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgccagaa ggccgccaga gaggccgagc2700
gcggccgtga ggcttggacg ctagggcagg gcatgaaaaa gcccgtagcg ggctgctacg2760
ggcgtctgac gcggtggaaa gggggagggg atgttgtcta catggctctg ctgtagtgag2820
tgggttgcgc tccggcagcg gtcctgatca atcgtcaccc tttctcggtc cttcaacgtt2880
cctgacaacg agcctccttt tcgccaatcc atcgacaatc accgcgagtc cctgctcgaa2940
cgctgcgtcc ggaccggctt cgtcgaaggc gtctatcgcg gcccgcaaca gcggcgagag3000
cggagcctgt tcaacggtgc cgccgcgctc gccggcatcg ctgtcgccgg cctgctcctc3060
aagcacggcc ccaacagtga agtagctgat tgtcatcagc gcattgacgg cgtccccggc3120
cgaaaaaccc gcctcgcaga ggaagcgaag ctgcgcgtcg gccgtttcca tctgcggtgc3180
gcccggtcgc gtgccggcat ggatgcgcgc gccatcgcgg taggcgagca gcgcctgcct3240
gaagctgcgg gcattcccga tcagaaatga gcgccagtcg tcgtcggctc tcggcaccga3300
atgcgtatga ttctccgcca gcatggcttc ggccagtgcg tcgagcagcg cccgcttgtt3360
cctgaagtgc cagtaaagcg ccggctgctg aacccccaac cgttccgcca gtttgcgtgt3420
cgtcagaccg tctacgccga cctcgttcaa caggtccagg gcggcacgga tcactgtatt3480
cggctgcaac tttgtcatgc ttgacacttt atcactgata aacataatat gtccaccaac3540
ttatcagtga taaagaatcc gcgcgttcaa tcggaccagc ggaggctggt ccggaggcca3600
gacatgaaac ccaacatacc cctgatcgta attctgagca ctgtcgcgct cgacgctgtc3660
ggcatcggcc tgattatgcc ggtgctgccg ggcctcctgc gcgatctggt tcactcgaac3720
gacgtcaccg cccactatgg cattctgctg gcgctgtatg cgttggtgca atttgcctgc3780
gcacctgtgc tgggcgcgct gtcggatcgt ttcgggcggc ggccaatctt gctcgtctcg3840
ctggccggcg ccactgtcga ctacgccatc atggcgacag cgcctttcct ttgggttctc3900
tatatcgggc ggatcgtggc cggcatcacc ggggcgactg gggcggtagc cggcgcttat3960
attgccgata tcactgatgg cgatgagcgc gcgcggcact tcggcttcat gagcgcctgt4020
ttcgggttcg ggatggtcgc gggacctgtg ctcggtgggc tgatgggcgg tttctccccc4080
cacgctccgt tcttcgccgc ggcagccttg aacggcctca atttcctgac gggctgtttc4140
cttttgccgg agtcgcacaa aggcgaacgc cggccgttac gccgggaggc tctcaacccg4200
ctcgcttcgt tccggtgggc ccggggcatg accgtcgtcg ccgccctgat ggcggtcttc4260
ttcatcatgc aacttgtcgg acaggtgccg gccgcgcttt gggtcatttt cggcgaggat4320
cgctttcact gggacgcgac cacgatcggc atttcgcttg ccgcatttgg cattctgcat4380
tcactcgccc aggcaatgat caccggccct gtagccgccc ggctcggcga aaggcgggca4440
ctcatgctcg gaatgattgc cgacggcaca ggctacatcc tgcttgcctt cgcgacacgg4500
ggatggatgg cgttcccgat catggtcctg cttgcttcgg gtggcatcgg aatgccggcg4560
ctgcaagcaa tgttgtccag gcaggtggat gaggaacgtc aggggcagct gcaaggctca4620
ctggcggcgc tcaccagcct gacctcgatc gtcggacccc tcctcttcac ggcgatctat4680
gcggcttcta taacaacgtg gaacgggtgg gcatggattg caggcgctgc cctctacttg4740
ctctgcctgc cggcgctgcg tcgcgggctt tggagcggcg cagggcaacg agccgatcgc4800
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gcgccctagg agtgcggttg gaacgttggc ccagccagat actcccgatc acgagcagga4920
cgccgatgat ttgaagcgca ctcagcgtct gatccaagaa caaccatcct agcaacacgg4980
cggtccccgg gctgagaaag cccagtaagg aaacaactgt aggttcgagt cgcgagatcc5040
cccggaacca aaggaagtag gttaaacccg ctccgatcag gccgagccac gccaggccga5100
gaacattggt tcctgtaggc atcgggattg gcggatcaaa cactaaagct actggaacga5160
gcagaagtcc tccggccgcc agttgccagg cggtaaaggt gagcagaggc acgggaggtt5220
gccacttgcg ggtcagcacg gttccgaacg ccatggaaac cgcccccgcc aggcccgctg5280
cgacgccgac aggatctagc gctgcgtttg gtgtcaacac caacagcgcc acgcccgcag5340
ttccgcaaat agcccccagg accgccatca atcgtatcgg gctacctagc agagcggcag5400
agatgaacac gaccatcagc ggctgcacag cgcctaccgt cgccgcgacc cgcccggcag5460
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gaagatgcgc atccaccaga ttcccgttgg aatctgtcgg acgatcatca cgagcaataa5580
acccgccggc aacgcccgca gcagcatacc ggcgacccct cggcctcgct gttcgggctc5640
cacgaaaacg ccggacagat gcgccttgtg agcgtccttg gggccgtcct cctgtttgaa5700
gaccgacagc ccaatgatct cgccgtcgat gtaggcgccg aatgccacgg catctcgcaa5760
ccgttcagcg aacgcctcca tgggcttttt ctcctcgtgc tcgtaaacgg acccgaacat5820
ctctggagct ttcttcaggg ccgacaatcg gatctcgcgg aaatcctgca cgtcggccgc5880
tccaagccgt cgaatctgag ccttaatcac aattgtcaat tttaatcctc tgtttatcgg5940
cagttcgtag agcgcgccgt gcgcccgagc gatactgagc gaagcaagtg cgtcgagcag6000
tgcccgcttg ttcctgaaat gccagtaaag cgctggctgc tgaaccccca gccggaactg6060
accccacaag gccctagcgt ttgcaatgca ccaggtcatc attgacccag gcgtgttcca6120
ccaggccgct gcctcgcaac tcttcgcagg cttcgccgac ctgctcgcgc cacttcttca6180
cgcgggtgga atccgatccg cacatgaggc ggaaggtttc cagcttgagc gggtacggct6240
cccggtgcga gctgaaatag tcgaacatcc gtcgggccgt cggcgacagc ttgcggtact6300
tctcccatat gaatttcgtg tagtggtcgc cagcaaacag cacgacgatt tcctcgtcga6360
tcaggacctg gcaacgggac gttttcttgc cacggtccag gacgcggaag cggtgcagca6420
gcgacaccga ttccaggtgc ccaacgcggt cggacgtgaa gcccatcgcc gtcgcctgta6480
ggcgcgacag gcattcctcg gccttcgtgt aataccggcc attgatcgac cagcccaggt6540
cctggcaaag ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg cgcttcgcgt6600
actccaacac ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg acgccggtgt6660
aggtgatctt cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc gcctcgcgcg6720
ggattttctt gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt ggcatcgctc6780
gcatcgtgtc cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc ttgatctgct6840
gcttcgtgtg tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt gccaggtcct6900
cgccggcggt ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg gtcatcgact6960
tcgccaaacc tgccgcctcc tgttcgagac gacgcgaacg ctccacggcg gccgatggcg7020
cgggcagggc agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc gtagcttgct7080
ggaccatcga gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg gtgcggcttg7140
cgatggtttc ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc ctgtatgcct7200
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tatcggcaat gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac ttggtattcc7380
gaatcttgcc ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg tgggcctcgg7440
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catgacgtac ctcggtgtca cgggtaagat taccgataaa ctggaactga ttatggctca7620
tatcgaaagt ctccttgaga aaggagactc tagtttagct aaacattggt tccgctgtca7680
agaactttag cggctaaaat tttgcgggcc gcgaccaaag gtgcgagggg cggcttccgc7740
tgtgtacaac cagatatttt tcaccaacat ccttcgtctg ctcgatgagc ggggcatgac7800
gaaacatgag ctgtcggaga gggcaggggt ttcaatttcg tttttatcag acttaaccaa7860
cggtaaggcc aacccctcgt tgaaggtgat ggaggccatt gccgacgccc tggaaactcc7920
cctacctctt ctcctggagt ccaccgacct tgaccgcgag gcactcgcgg agattgcggg7980
tcatcctttc aagagcagcg tgccgcccgg atacgaacgc atcagtgtgg ttttgccgtc8040
acataaggcg tttatcgtaa agaaatgggg cgacgacacc cgaaaaaagc tgcgtggaag8100
gctctgacgc caagggttag ggcttgcact tccttcttta gccgctaaaa cggccccttc8160
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<213>根据大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的突变启动子和蛋白质编码序列设计并人工合成的上游引物
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<213>大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的启动子和完整基因的核苷酸序列
<400>4
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tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact 360
gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc 420
ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga 480
ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt 540
ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg 600
cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag 660
ttctgtctcg gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat 720
tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat 780
gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc 840
gctgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt 900
agtgggatac gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgtcaa ccaccatcaa 960
acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg 1020
ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct 1080
ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 1140
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaga attcagag 1198
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>根据puc操纵子序列设计并人工合成的上游引物
<400>5
atatctcgag gcctcggaca ccctcgtttt tgc33
<210>6
<211>58
<212>DNA
<213>根据puc操纵子序列设计并人工合成的下游引物
<400>6
ctctggtacc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattatg ggtgtcac 58
<210>7
<211>276
<212>DNA
<213>类球红细菌puc操纵子启动子pucP和大肠杆菌乳糖操纵子操纵基因Lac0的核苷酸序列
<400>7
atatctcgag gcctcggaca ccctcgtttt tgcagcagcg agaggctgcg ggacggccct 60
gtggggccgg gacaggcagc gtcaatttcc cgcgcgcctg cggcaaaatt gtcccttttc120
aagccgttac gcaggattcc cggccgatct ggcggccaat aagtcgcacc caaaacggcc180
ttgtcagcca acactgacat tgaatctgtc agcgcaatgt gacacccata atgtgtggaa240
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggta ccagag 276
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>根据puc操纵子序列设计并人工合成的上游引物
<400>8
atatggtacc agttgggaga cgacacagtg actg34
<210>9
<211>44
<212>DNA
<213>根据puc操纵子序列设计并人工合成的下游引物
<400>9
atattctaga gagctccctt ccctcgatgc cgagccacgg ggtc 44
<210>10
<211>208
<212>DNA
<213>类球红细菌puc操纵子SD序列，结构基因pucB和Xa因子的核苷酸序列
<400>10
atatggtacc agttgggaga cgacacagtg actgacgatc tgaacaaagt ctggccgagc60
ggcctgaccg ttgccgaagc cgaagaagtt cataagcaac tcatcctcgg cacccgcgtc 120
ttcggtggca tggcgctcat cgcgcacttc ctcgccgccg ctgcgacccc gtggctcggc 180
atcgagggaa gggagctctc tagaatat 208
<210>11
<211>81
<212>DNA
<213>根据puc操纵子序列设计并人工合成的上游引物
<400>11
atattctaga caccaccacc accaccacca ccaccaccac taagtcgacg gatctactag60
tcaggagaag actgacatga c 81
<210>12
<211>35
<212>DNA
<213>根据puc操纵子序列设计并人工合成的下游引物
<400>12
atatctgcag cagtggcagg caggtcgctg cctag 35
<210>13
<211>2283
<212>DNA
<213>10个组氨酸编码序列，终止密码子，类球红细菌puc操纵子结构基因pucA，pucC及终止子的核苷酸序列
<400>13
atattctaga caccaccacc accaccacca ccaccaccac taagtcgacg gatctactag60
tcaggagaag actgacatga ccaacggcaa aatctggctc gtggtgaaac cgaccgtcgg 120
cgttccgctg ttcctcagcg ctgccgtcat cgcctccgtc gttatccacg ctgctgtgct 180
gacgaccacc acctggctgc ccgcctacta ccaaggctcg gctgcggtcg cggccgagta 240
atgctgcgca aggcgcgggc ctgcgggccc acgccagcca gtccgtgagt tccgagcagg 300
ccgggatcct tgggttccgg cctgctcgtc acaccagcga cgtgttcctg tcgccttgcc 360
cgttcgcggt gtgtgcctga agcccgacat cctttccagt cgcgcagtct gcgctacccc 420
gggattcttc acgcatgagc cgaattgccg aacatctggt ccgcatcgga ccgcggtttc 480
tgccatttgc cgacgcggcc tcggaccagc tgcccctgcg caagctgctg cgcctgtcgc 540
tgtttcaggt cgccgtgggc atggccatcg tcctgctcgt cggcacgctg aaccgggtga 600
tgatcgtcga gctgaaggtg cccgcctcgg tggtggggat catgatctcg ctgccgctcc 660
tgttcgcgcc cttccgcgcg ctgatcgggt tcaagtccga cacccatgtc tccgcactcg 720
gctggcggcg cgtgccctgg atctaccgcg ggacgctggc gctgtggggc ggcttcgcca 780
tcatgccctt cgcgctgatc gtgctcggcg ggcagggcta tgccgagggc cagcccttct 840
ggctcggcgt ctcctcggcc gcgctcgcct tcctgatggt gggcggcggc gtgcacacga 900
tccagacggt ggggcttgcg ctggccaccg acctcgcccc gcgcgaggac cagccgaagg 960
tcgtgggcct gatgtatgtg gtgctgctca tcagcatgat cttcgcctcg atcggcttcg 1020
gctggctgct cgatccctat tatgacgcgc agctcatcaa ggtcatctcg ggcgtcgccg 1080
tcgccgtgtt cttcctgaac atgatcgccc tgtggaagat ggagccgcgc aaccgcgcct 1140
tcaccgtgaa gcccgagaag gagcccgagt tcggcgacca ctggcgcgag ttcatcagcc 1200
gcgagaacgc gctccacggg ctgatcgtga tcgggctcgg cacgctgggc ttcggcatgg 1260
ccgacgtgat cctcgagccc tacggcggcg aggtgctctc gatgacggtg gccgagacga 1320
cccggctgac cgcgaccttc gcggggggcg ggctcgtggg cttctggctg gcctcgtggg 1380
tgctcggccg gggcttcgat cccctgcgga tggccttcct cggcgccgcc gcggggctgc 1440
cgggcttctt cgccatcatg ggcgcgaccg agatgacgaa cgtctgggtc ttcctcctcg 1500
gcacgctggt ggtggggttc ggcggcgggc tcttcagcca cgggacgctc acggccacga 1560
tgcggctggc gccgaaggag caggtgggcc ttgcgctcgg cgcctggggt gcggtgcagg 1620
ccacggccgc gggcgtggcc atcgcgggcg caggcgtgct gcgcgacatc ctgcaggcga 1680
tgccggatct ctccggctac ggtcccggcg cgccctacgt cgcggtcttc gccctcgagg 1740
caggcttcct cttcctgacc atgatcgtga tcctgcctct cttgcgctcg gctctcgccg 1800
cccgccgcct gtgacgaatc accacgccct gcgtgcccgc ttcccggagg tgcaaaaggc 1860
tactcctttg ggggtctttg aaatctcagc ctgcaggttc gcgccctcgg cgcgcttcgc 1920
cgcagggttg aaccaggaca accctgacgg cgagattccg cgcacgtccc ccactcgccg 1980
ccgaggcgaa acccttggtt aacacaacgt taacaagacc ttccctgccc cgacttgtcc 2040
acaacctgac catttcggca gggcacaggg tagcctcccc ctttttcctg ctataacaga 2100
cctttgcggc atcattggct gcatgctaaa gtatggaaat cgacaaaact ttgaagagta 2160
ggatttagcc gggtttgcgt cccaaacaca aagtggacag attgtgatga atcattcgac 2220
cgactctttt tcgaaatctt tgaataccct aggcagcgac ctgcctgcca ctgctgcaga 2280
tat2283
<210>14
<211>14557
<212>DNA
<213>本发明构建的载体pRK-CH质粒DNA序列
<400>14
ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggatggga 60
ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc 120
ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat tggtttaaaa 180
gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt gcaaatgctg 240
gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca tctgtcagca 300
ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt cagtagtcgc gcccctcaag 360
tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg gaaactcgcg 420
taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc cggccgaaat 480
cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca agtgtcaacg 540
tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca acgccggcgg 600
ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg cgtttgcagg gccatagacg 660
gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg tcggaaaggc gctcttccgc 720
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 780
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 840
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 900
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 960
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc1020
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc1080
gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc1140
tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag1200
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attctaattg cgttgcgctc1260
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg1320
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga1380
cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca1440
cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac1500
atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc1560
cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg1620
cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac1680
tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc1740
agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt1800
gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga1860
aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag1920
tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc1980
cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc2040
gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg2100
cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg2160
actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg2220
ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg2280
aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca2340
cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt2400
tgcaccattc gatggtgtcc tcgaggcctc ggacaccctc gtttttgcag cagcgagagg2460
ctgcgggacg gccctgtggg gccgggacag gcagcgtcaa tttcccgcgc gcctgcggca2520
aaattgtccc ttttcaagcc gttacgcagg attcccggcc gatctggcgg ccaataagtc2580
gcacccaaaa cggccttgtc agccaacact gacattgaat ctgtcagcgc aatgtgacac2640
ccataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggtaccagt tgggagacga2700
cacagtgact gacgatctga acaaagtctg gccgagcggc ctgaccgttg ccgaagccga2760
agaagttcat aagcaactca tcctcggcac ccgcgtcttc ggtggcatgg cgctcatcgc2820
gcacttcctc gccgccgctg cgaccccgtg gctcggcatc gagggaaggg agctctctag2880
acaccaccac caccaccacc accaccacca ctaagtcgac ggatctacta gtcaggagaa2940
gactgacatg accaacggca aaatctggct cgtggtgaaa ccgaccgtcg gcgttccgct3000
gttcctcagc gctgccgtca tcgcctccgt cgttatccac gctgctgtgc tgacgaccac3060
cacctggctg cccgcctact accaaggctc ggctgcggtc gcggccgagt aatgctgcgc3120
aaggcgcggg cctgcgggcc cacgccagcc agtccgtgag ttccgagcag gccgggatcc3180
ttgggttccg gcctgctcgt cacaccagcg acgtgttcct gtcgccttgc ccgttcgcgg3240
tgtgtgcctg aagcccgaca tcctttccag tcgcgcagtc tgcgctaccc cgggattctt3300
cacgcatgag ccgaattgcc gaacatctgg tccgcatcgg accgcggttt ctgccatttg3360
ccgacgcggc ctcggaccag ctgcccctgc gcaagctgct gcgcctgtcg ctgtttcagg3420
tcgccgtggg catggccatc gtcctgctcg tcggcacgct gaaccgggtg atgatcgtcg3480
agctgaaggt gcccgcctcg gtggtgggga tcatgatctc gctgccgctc ctgttcgcgc3540
ccttccgcgc gctgatcggg ttcaagtccg acacccatgt ctccgcactc ggctggcggc3600
gcgtgccctg gatctaccgc gggacgctgg cgctgtgggg cggcttcgcc atcatgccct3660
tcgcgctgat cgtgctcggc gggcagggct atgccgaggg ccagcccttc tggctcggcg3720
tctcctcggc cgcgctcgcc ttcctgatgg tgggcggcgg cgtgcacacg atccagacgg3780
tggggcttgc gctggccacc gacctcgccc cgcgcgagga ccagccgaag gtcgtgggcc3840
tgatgtatgt ggtgctgctc atcagcatga tcttcgcctc gatcggcttc ggctggctgc3900
tcgatcccta ttatgacgcg cagctcatca aggtcatctc gggcgtcgcc gtcgccgtgt3960
tcttcctgaa catgatcgcc ctgtggaaga tggagccgcg caaccgcgcc ttcaccgtga4020
agcccgagaa ggagcccgag ttcggcgacc actggcgcga gttcatcagc cgcgagaacg4080
cgctccacgg gctgatcgtg atcgggctcg gcacgctggg cttcggcatg gccgacgtga4140
tcctcgagcc ctacggcggc gaggtgctct cgatgacggt ggccgagacg acccggctga4200
ccgcgacctt cgcggggggc gggctcgtgg gcttctggct ggcctcgtgg gtgctcggcc4260
ggggcttcga tcccctgcgg atggccttcc tcggcgccgc cgcggggctg ccgggcttct4320
tcgccatcat gggcgcgacc gagatgacga acgtctgggt cttcctcctc ggcacgctgg4380
tggtggggtt cggcggcggg ctcttcagcc acgggacgct cacggccacg atgcggctgg4440
cgccgaagga gcaggtgggc cttgcgctcg gcgcctgggg tgcggtgcag gccacggccg4500
cgggcgtggc catcgcgggc gcaggcgtgc tgcgcgacat cctgcaggcg atgccggatc4560
tctccggcta cggtcccggc gcgccctacg tcgcggtctt cgccctcgag gcaggcttcc4620
tcttcctgac catgatcgtg atcctgcctc tcttgcgctc ggctctcgcc gcccgccgcc4680
tgtgacgaat caccacgccc tgcgtgcccg cttcccggag gtgcaaaagg ctactccttt4740
gggggtcttt gaaatctcag cctgcaggtt cgcgccctcg gcgcgcttcg ccgcagggtt4800
gaaccaggac aaccctgacg gcgagattcc gcgcacgtcc cccactcgcc gccgaggcga4860
aacccttggt taacacaacg ttaacaagac cttccctgcc ccgacttgtc cacaacctga4920
ccatttcggc agggcacagg gtagcctccc cctttttcct gctataacag acctttgcgg4980
catcattggc tgcatgctaa agtatggaaa tcgacaaaac tttgaagagt aggatttagc5040
cgggtttgcg tcccaaacac aaagtggaca gattgtgatg aatcattcga ccgactcttt5100
ttcgaaatct ttgaataccc taggcagcga cctgcctgcc actgctgcag gcatgcaagc5160
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca5220
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa5280
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag5340
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcggtc5400
ttgccttgct cgtcggtgat gtacttcacc agctccgcga agtcgctctt cttgatggag5460
cgcatgggga cgtgcttggc aatcacgcgc accccccggc cgttttagcg gctaaaaaag5520
tcatggctct gccctcgggc ggaccacgcc catcatgacc ttgccaagct cgtcctgctt5580
ctcttcgatc ttcgccagca gggcgaggat cgtggcatca ccgaaccgcg ccgtgcgcgg5640
gtcgtcggtg agccagagtt tcagcaggcc gcccaggcgg cccaggtcgc cattgatgcg5700
ggccagctcg cggacgtgct catagtccac gacgcccgtg attttgtagc cctggccgac5760
ggccagcagg taggccgaca ggctcatgcc ggccgccgcc gccttttcct caatcgctct5820
tcgttcgtct ggaaggcagt acaccttgat aggtgggctg cccttcctgg ttggcttggt5880
ttcatcagcc atccgcttgc cctcatctgt tacgccggcg gtagccggcc agcctcgcag5940
agcaggattc ccgttgagca ccgccaggtg cgaataaggg acagtgaaga aggaacaccc6000
gctcgcgggt gggcctactt cacctatcct gcccggctga cgccgttgga tacaccaagg6060
aaagtctaca cgaacccttt ggcaaaatcc tgtatatcgt gcgaaaaagg atggatatac6120
cgaaaaaatc gctataatga ccccgaagca gggttatgca gcggaaaagc gccacgcttc6180
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca6240
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc6300
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg6360
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct6420
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata6480
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc6540
gccagaaggc cgccagagag gccgagcgcg gccgtgaggc ttggacgcta gggcagggca6600
tgaaaaagcc cgtagcgggc tgctacgggc gtctgacgcg gtggaaaggg ggaggggatg6660
ttgtctacat ggctctgctg tagtgagtgg gttgcgctcc ggcagcggtc ctgatcaatc6720
gtcacccttt ctcggtcctt caacgttcct gacaacgagc ctccttttcg ccaatccatc6780
gacaatcacc gcgagtccct gctcgaacgc tgcgtccgga ccggcttcgt cgaaggcgtc6840
tatcgcggcc cgcaacagcg gcgagagcgg agcctgttca acggtgccgc cgcgctcgcc6900
ggcatcgctg tcgccggcct gctcctcaag cacggcccca acagtgaagt agctgattgt6960
catcagcgca ttgacggcgt ccccggccga aaaacccgcc tcgcagagga agcgaagctg7020
cgcgtcggcc gtttccatct gcggtgcgcc cggtcgcgtg ccggcatgga tgcgcgcgcc7080
atcgcggtag gcgagcagcg cctgcctgaa gctgcgggca ttcccgatca gaaatgagcg7140
ccagtcgtcg tcggctctcg gcaccgaatg cgtatgattc tccgccagca tggcttcggc7200
cagtgcgtcg agcagcgccc gcttgttcct gaagtgccag taaagcgccg gctgctgaac7260
ccccaaccgt tccgccagtt tgcgtgtcgt cagaccgtct acgccgacct cgttcaacag7320
gtccagggcg gcacggatca ctgtattcgg ctgcaacttt gtcatgcttg acactttatc7380
actgataaac ataatatgtc caccaactta tcagtgataa agaatccgcg cgttcaatcg7440
gaccagcgga ggctggtccg gaggccagac atgaaaccca acatacccct gatcgtaatt7500
ctgagcactg tcgcgctcga cgctgtcggc atcggcctga ttatgccggt gctgccgggc7560
ctcctgcgcg atctggttca ctcgaacgac gtcaccgccc actatggcat tctgctggcg7620
ctgtatgcgt tggtgcaatt tgcctgcgca cctgtgctgg gcgcgctgtc ggatcgtttc7680
gggcggcggc caatcttgct cgtctcgctg gccggcgcca ctgtcgacta cgccatcatg7740
gcgacagcgc ctttcctttg ggttctctat atcgggcgga tcgtggccgg catcaccggg7800
gcgactgggg cggtagccgg cgcttatatt gccgatatca ctgatggcga tgagcgcgcg7860
cggcacttcg gcttcatgag cgcctgtttc gggttcggga tggtcgcggg acctgtgctc7920
ggtgggctga tgggcggttt ctccccccac gctccgttct tcgccgcggc agccttgaac7980
ggcctcaatt tcctgacggg ctgtttcctt ttgccggagt cgcacaaagg cgaacgccgg8040
ccgttacgcc gggaggctct caacccgctc gcttcgttcc ggtgggcccg gggcatgacc8100
gtcgtcgccg ccctgatggc ggtcttcttc atcatgcaac ttgtcggaca ggtgccggcc8160
gcgctttggg tcattttcgg cgaggatcgc tttcactggg acgcgaccac gatcggcatt8220
tcgcttgccg catttggcat tctgcattca ctcgcccagg caatgatcac cggccctgta8280
gccgcccggc tcggcgaaag gcgggcactc atgctcggaa tgattgccga cggcacaggc8340
tacatcctgc ttgccttcgc gacacgggga tggatggcgt tcccgatcat ggtcctgctt8400
gcttcgggtg gcatcggaat gccggcgctg caagcaatgt tgtccaggca ggtggatgag8460
gaacgtcagg ggcagctgca aggctcactg gcggcgctca ccagcctgac ctcgatcgtc8520
ggacccctcc tcttcacggc gatctatgcg gcttctataa caacgtggaa cgggtgggca8580
tggattgcag gcgctgccct ctacttgctc tgcctgccgg cgctgcgtcg cgggctttgg8640
agcggcgcag ggcaacgagc cgatcgctga tcgtggaaac gataggccta tgccatgcgg8700
gtcaaggcga cttccggcaa gctatacgcg ccctaggagt gcggttggaa cgttggccca8760
gccagatact cccgatcacg agcaggacgc cgatgatttg aagcgcactc agcgtctgat8820
ccaagaacaa ccatcctagc aacacggcgg tccccgggct gagaaagccc agtaaggaaa8880
caactgtagg ttcgagtcgc gagatccccc ggaaccaaag gaagtaggtt aaacccgctc8940
cgatcaggcc gagccacgcc aggccgagaa cattggttcc tgtaggcatc gggattggcg9000
gatcaaacac taaagctact ggaacgagca gaagtcctcc ggccgccagt tgccaggcgg9060
taaaggtgag cagaggcacg ggaggttgcc acttgcgggt cagcacggtt ccgaacgcca9120
tggaaaccgc ccccgccagg cccgctgcga cgccgacagg atctagcgct gcgtttggtg9180
tcaacaccaa cagcgccacg cccgcagttc cgcaaatagc ccccaggacc gccatcaatc9240
gtatcgggct acctagcaga gcggcagaga tgaacacgac catcagcggc tgcacagcgc9300
ctaccgtcgc cgcgacccgc ccggcaggcg gtagaccgaa ataaacaaca agctccagaa9360
tagcgaaata ttaagtgcgc cgaggatgaa gatgcgcatc caccagattc ccgttggaat 9420
ctgtcggacg atcatcacga gcaataaacc cgccggcaac gcccgcagca gcataccggc 9480
gacccctcgg cctcgctgtt cgggctccac gaaaacgccg gacagatgcg ccttgtgagc 9540
gtccttgggg ccgtcctcct gtttgaagac cgacagccca atgatctcgc cgtcgatgta 9600
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gctcgccgat aggggtgcgc ttcgcgtact ccaacacctg ctgccacacc agttcgtcat10500
cgtcggcccg cagctcgacg ccggtgtagg tgatcttcac gtccttgttg acgtggaaaa10560
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cctcgctgac ctgttttgcc aggtcctcgc cggcggtttt tcgcttcttg gtcgtcatag10800
ttcctcgcgt gtcgatggtc atcgacttcg ccaaacctgc cgcctcctgt tcgagacgac10860
gcgaacgctc cacggcggcc gatggcgcgg gcagggcagg gggagccagt tgcacgctgt10920
cgcgctcgat cttggccgta gcttgctgga ccatcgagcc gacggactgg aaggtttcgc10980
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cgtcgatcag ttcttgcctg tatgccttcc ggtcaaacgt ccgattcatt caccctcctt11100
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gtgccttggt gtccagataa tccaccttat cggcaatgaa gtcggtcccg tagaccgtct11220
ggccgtcctt ctcgtacttg gtattccgaa tcttgccctg cacgaatacc agcgacccct11280
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actgccccga tcccggcaat ggcaaggact gccagcg 1455权利要求
1.一种同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体的构建方法，其特征在于该方法包括步骤
(1)大肠杆菌乳糖操纵子调节基因LacIq的PCR扩增并连接到表达载体pRK415上；
(2)类球红细菌puc操纵子的启动子和大肠杆菌乳糖操纵子的操纵基因Lac0的PCR扩增及与步骤(1)中所得的连接产物连接；
(3)类球红细菌puc操纵子的SD序列，结构基因pucB和Xa因子的PCR扩增及与步骤(2)中所得的连接产物连接；
(4)10个组氨酸编码序列和类球红细菌操纵子的结构基因pucA，pucC及终止子的PCR扩增及与步骤(3)中所得的连接产物连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中采用的PCR引物为SEQ ID2和SEQ ID3的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ IDN04。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中采用的PCR引物为SEQ ID5和SEQ ID6的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ IDNO7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中采用的PCR引物为SEQ ID8和SEQ ID9的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQID NO10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中采用的PCR引物为SEQ ID11和SEQ ID12的核苷酸序列，所得PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO13。
6.权利要求1所述的方法所得的表达载体，其特征在于所述的表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO14。
7.权利要求1所述的方法所得的表达载体，其特征在于所述的表达载体具有一个同时受外源IPTG和O2浓度调控的强杂合启动子。
8.权利要求1所述的方法所得的同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体，其特征在于所述的表达载体在类球红细菌中人为诱导pucB、pucA和pucC基因的表达。
全文摘要
本发明公开了一种同时受外源IPTG和O2浓度调控的表达载体及其构建方法，利用乳糖操纵子调节基因LacIq和操纵基因Lac0，与类球红细菌puc操纵子的启动子构建成一个同时受外源IPTG和O2调控的强杂合启动子，同时在结构基因pucB后插入Xa因子、限制性内切酶位点和10个组氨酸编码序列，便于接入外源基因构建成pucB融合蛋白，该表达载体可以在类球红细菌LH2缺失突变株中大量诱导表达，并可经组氨酸亲和层析法分离纯化外源蛋白。该发明可用于利用类球红细菌研究光合细菌中各种光合系统基因的表达以及在类球红细菌表达系统中人为调控外源蛋白的表达和纯化提供了有效的工具。
文档编号C12N15/63GK101148679SQ200710092678
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月10日 优先权日2007年9月10日
发明者胡宗利, 陈绪清, 陈国平, 赵志平, 宇 潘, 胡廷章 申请人:重庆大学