专利名称：男性y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及基因缺失检测领域，尤其涉及一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
全世界约有15％的夫妇被不育所困扰，其中男性因素约占一半。在排除输精管梗阻、克氏症和其他泌尿生殖系统原因后，严重少精症和无精子症最有可能的原因就是精子发生基因的异常。关于精子发生基因，特别关注Y染色体长臂11间隔。Y染色体构成人类基因组的2％， 由短臂(Yp)和长臂(Yq)组成。无精子症和严重少精子症的细胞遗传学和分子生物学研究也证实Y染色体上存在着无精子因子(azoospermia factor，AZF)，它有四个清楚的、非重叠的亚区，即AZFa、AZFb、AZFc和AZFd区。这些区域的基因微缺失可引起精子发生障碍，继而引起男性不育。因此Y染色体微缺失现在被认为是男性特发性不育最重要的遗传学病因。随着辅助生殖技术的进展，卵细胞胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术被认为是男性不育症治疗上的一次革命。然而该技术可能将携带染色体畸形、缺失或基因突变的精子注入到卵胞浆内，使卵子受精，从而将上述各种遗传缺陷传给下一代。因此，为了确定是否需要治疗，临床医生建议所以精子浓度＜5×106/mL的男性都要进行Y染色体微缺失的分子诊断。
AZF的片段较小，常规核型分析不易发现其缺失，故一般通过对STSs进行PCR扩增来获取Y染色体微缺失信息。常用的技术有1.多重PCR电泳多重PCR是目前Y染色体微缺失检测应用得最广泛的方法，具有简单、快速、灵敏、特异、经济和高通量的特点，是检测AZF的理想方法，但与常规PCR相比有更高的技术要求，且缺少标准筛查方案，各实验室结果不尽相同。
2.探针技术用特异探针进行Southern blot或Northern blot是研究AZF微缺失与男性不育关系的有效方法，但方法过于繁琐，难以推广，多用于实验室研究。
3.其他(1)基因芯片技术个别报道用基因芯片技术同时对多个热点基因进行研究，有助于筛选和研究无精子症相关基因，详尽了解无精子症的发病机制。(2)毛细管电泳技术具有高通量、高灵敏度、快速及进样量少的优点，但需要专门的毛细管电泳仪。
中国专利200410043918.0公开了特异性扩增Y染色体上微缺失STS中的sY87和sY143的两对引物序列，但作为Y染色体微缺失检测方法，不符合欧洲生殖学会检测至少6个STS(sY254、sY255、sY84、sY86、sY127、sY134)的最低要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，该试剂盒能稳定、高效地对男性Y染色体微缺失基因进行检测。
本发明的另一个目的在于提供一种男性Y染色体微缺失基因检测方法，该方法建立在多重PCR和凝胶电泳基础上，提高了多重PCR的稳定性和均一性。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY82序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示；特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY84序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY124序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY128序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY133序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY134序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY143序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY239序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY242序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY254序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY145序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY152序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；和特异性扩增男性特有Sry基因的引物，其碱基序列如SEQ IDNO31和SEQ ID NO32所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
所述试剂盒还包括PCR扩增所需试剂MgCl2、甜菜碱、热启动酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反应缓冲液。
所述MgCl2反应终浓度为1.5mM。
所述甜菜碱反应终浓度为1.3M。
所述dATP反应终浓度为200μM、dCTP反应终浓度为200μM、dGTP反应终浓度为200μM、dUTP反应终浓度为400μM。
一种男性Y染色体微缺失基因检测方法，包括以下步骤
1)从抗凝全血中提取人基因组DNA；2)以步骤1)所得DNA为模板，利用权利要求1所述特异性扩增Y染色体AZF的引物进行PCR扩增；3)PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析。
所述PCR扩增分四管进行，第一管包括10条引物，其碱基序列如SEQ ID NO1-8和SEQ ID NO31-32所示；第二管包括8条引物，其碱基序列如SEQ ID NO9-14和SEQ ID NO31-32所示；第三管包括10条引物，其碱基序列如SEQ ID NO15-22和SEQ ID NO31-32所示；第四管包括10条引物，其碱基序列如SEQ ID NO23-30和SEQ ID NO31-32所示。
所述PCR反应体系中含有甜菜碱，其反应终浓度为1.3M。
所述PCR扩增条件为 本发明设计了15对PCR引物分别特异地扩增AZF STSs序列，并同时设计1对内控PCR引物，扩增男性特有的SRY(sex-determiningregion of Y-chromesome)基因，以指示PCR正常进行。为了解决多重PCR扩增不稳定、不均一的问题，本发明将该15个STSs分属到4个PCR反应当中，并都添加SRY PCR引物，在同一条件下进行4个独立的扩增反应，最后再一起进行电泳分析。通过反复实验，调整各引物对浓度，使用热启动酶，并在PCR反应液里添加甜菜碱等增效剂，最终实现稳定和均一地扩增。本发明PCR产物用普通琼脂糖凝胶电泳来进行检测，因此设计的各引物对扩增产物片段大小必须能够被肉眼识别。本专利将15个STSs分属4个PCR反应，在每一个反应中各PCR产物片段大小必须相差至少30bp，所有片段大小不超过400bp(不包括SRY引物扩增产物，SRY扩增片段为470bp)。各引物对Tm值相差不超过2℃。因为采用了热启动酶和UNG酶(防污染)所以在PCR程序上也作了相应的变化。
采用本发明所述试剂盒对男性Y染色体微缺失基因进行检测，具有高效、低成本、结果稳定等优点。
图1是正常男性Y染色体微缺失基因检测结果。
图2是非正常男性Y染色体微缺失基因检测结果。
附图标号说明I、第一管PCR；II、第二管PCR；III、第三管PCR；IV、第四管PCR；1，5，9，13正常对照；2，6，10，14样品1；3，7，11，15样品2；4，8，12，16阴性对照。
具体实施例方式
实施例1一、材料1.仪器PCR仪、离心机2.引物设计本发明设计了15对PCR引物分别特异地扩增AZFSTSs序列，并同时设计1对内控PCR引物，扩增男性特有的Sry(sex-determining region of Y-chromesome)基因，以指示PCR正常进行。
表1 引物列表
3、试剂1 XPCR buffer50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)和0.1％TritonX-100MgCl2、甜菜碱、热启动酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP二、方法1、基因组DNA的获取用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA。分别提取三名男子基因组DNA和一名女子基因组DNA。
2、PCR扩增取PCR反应管，在管壁上做好标记，而后分别加入已提取的样本gDNA 4μL(含基因组DNA200-500ng)、引物及PCR反应试剂，最后加入无菌水至25μl反应总体系。该过程需在冰上操作，每个样品同时做4个PCR扩增进行检测，且每次检测都应同时设立一组阳性对照(正常男性基因组DNA)及阴性对照(女性基因组DNA)，PCR反应体系见表2。
表2 PCR反应体系
PCR按以下条件进行扩增
3、电泳检测取10μL PCR产物加2μL 6×上样缓冲液，(10uLPCR产物是针对1mm×3mm上样孔，可根据上样孔的大小作适当调整)混和均匀后经2.0％琼脂糖电泳，先用电压8V/cm电泳约3分钟使DNA迁移出上样孔，降低电压至4v/cm至溴酚蓝迁移出2-3厘米，即可在紫外灯下观察结果，如条带不能充分区分，可继续电泳至能区分为止。凝胶质量对条带的区分十分关键，推荐使用Promega或Biowest等进口琼脂糖，大多数国产的琼脂糖无法获得理想效果，并建议使用凝胶成像系统。
三、结果分析(1)阴性对照以女性基因组DNA为模板的反应管内，应无任何特异性产物扩增(2)阳性对照以正常男性基因组DNA为模板的反应管内应扩出以下条带
其中男性样品都应扩出内控带。若待测男性样品中无此带，说明其基因组DNA未抽提成功，应重新抽提DNA。
从图1可以看出，该样品扩增出了以正常男性基因组DNA为模板应该扩增出的全部条带，说明该样品正常，该男子Y染色体无微基因缺失。
从图2可以看出，样品1未扩增出sY84序列，样品2未扩增出sY254、sY242、sY239、sY152和sY128序列，说明样品1部分A座位缺失，样品2C座位和部分B、D座位联合缺失。
Y染色体微缺失的检测应用在医学领域具有如下功能(1)通过对无精子症或少精子症患者进行缺失筛查，指导临床诊断及治疗措施的选择，从而避免不必要的药物及手术治疗。
(2)单精子胞浆内注射技术(int ra2cytoplasmic sperminjection，ICSI)使许多少精症甚至是无精症患者可以生育下一代，但这种技术也可能将生殖缺陷人为地传给后代，导致子代男性生殖力下降或不育，通过术前筛查可以避免这种传递并指导ICSI后代的生育。
SEQUENCE LISTING<110>亚能生物技术(深圳)有限公司<120>男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法<130>11<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gggtgtgacc ataaggca 18<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2accagtatct agccaaagca gc 22<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3gcaggataga gaagggtag 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列
<400>4cccgtgtctg gagtactaat c 21<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5acgacagtac agacgagtt19<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6tcaaccacta atgtaagctc c 21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gttaccggga tatccgtgat 20<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8ctcttcatcg tgtagccac19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>9aggaatctcg ataacaggt 19<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gcctgactac caggaggctc 20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>11catatcattt ccctaatgaa gg 22<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>12tgcaagttgc acgaaatct 19<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13aagaacagtg ccattgtttc 20<210>14<211>20<212>DNA
<213>人工序列<400>14acgaggatgt acttagcagt 20<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>15gtgacacagg agactatgct tc 22<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>16acactacaga cgactaagct 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17ggatcactac gccaaagaac 20<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18ctacaggctt gtaatcaggg a21<210>19<211>24
<212>DNA<213>人工序列<400>19caacagaact acactcatat actg24<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>20tatgaataat tcatgttacg gg 22<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21caggttggac aacctgcaag 20<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22ctgtggcaac tagttgcttt c 21<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23gtcagcctct gaccataaaa cg 22<210>24
<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>24accagtgcca taactttcaa 20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>25cagtgaccac acatggatca 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26atgctgccgt tctcaatctc 20<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>27ggttgagact atttctggg19<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28agcggaatga taactggaca 20
<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29atatctctgg gcttcaccag 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30tgatcattgc gaaaagggaa 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31gataattccc cgtctccgga 20<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>32gcacgtgcag ccatagttga g 2权利要求
1.男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY82序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示；特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY84序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY124序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY128序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO2 7和SEQ ID NO28所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY133序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY134序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY143序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY239序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY242序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY254序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY145序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY152序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；和特异性扩增男性特有Sry基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO31和SEQ ID NO32所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
2.根据权利要求1所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR扩增所需试剂MgCl2、甜菜碱、热启动酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，其特征在于所述MgCl2反应终浓度为1.5mM。
4.根据权利要求2所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，其特征在于所述甜菜碱反应终浓度为1.3M。
5.根据权利要求2所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，其特征在于所述dATP反应终浓度为200μM、dCTP反应终浓度为200μM、dGTP反应终浓度为200μM、dUTP反应终浓度为400μM。
6.男性Y染色体微缺失基因检测方法，包括以下步骤1)从抗凝全血中提取人基因组DNA；2)以步骤1)所得DNA为模板，利用权利要求1所述特异性扩增Y染色体AZF的引物进行PCR扩增；3)PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析。
7.根据权利要求5所述的男性Y染色体微缺失基因检测方法，其特征在于所述PCR扩增分四管进行，第一管包括10条引物，其碱基序列如SEQ ID NO1-8和SEQ ID NO31-32所示；第二管包括8条引物，其碱基序列如SEQ ID NO9-14和SEQ ID NO31-32所示；第三管包括10条引物，其碱基序列如SEQ ID NO15-22和SEQ ID NO31-32所示；第四管包括10条引物，其碱基序列如SEQ ID NO23-30和SEQ ID NO31-32所示。
8.根据权利要求5所述的男性Y染色体微缺失基因检测方法，其特征在于所述PCR反应体系中含有甜菜碱，其反应终浓度为1.3M。
全文摘要
本发明涉及基因缺失检测领域，尤其涉及一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括特异性扩增Y染色体AZF的30条引物，和特异性扩增男性特有Sry基因的2条引物。采用本发明所述试剂盒对男性Y染色体微缺失基因进行检测，具有高效、低成本、结果稳定等优点。
文档编号C12N15/11GK101092648SQ20071007431
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者田洁, 任维, 向筑, 廖生赟, 邹耀东 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司