专利名称：日本结缕草高频基因枪转化方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及日本结缕草基因枪转化方法。
背景技术：
日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)是禾本科优质暖季型草坪草，在现代城市绿化和运动场建设及水土保持中，都占有重要地位，但日本结缕草也有苗期生长缓慢、对某些生物及非生物胁迫抵御能力差等缺点，而绿期短则已经成为限制其大量应用的瓶颈。全世界草坪草育种学家多年来一直致力于日本结缕草新品种的培育，但多采用传统育种方法，由于日本结缕草离体培养困难，转基因相关研究很少，也不系统，缺乏对转化过程中各个参数的研究，转化的也多为报告基因，抗旱、耐寒、耐盐等抗性功能基因转化尚属空白。基因枪转化法是目前较为常用的一种转化方法，避开了原生质体再培养的困难，克服了农杆菌的宿主限制，受体材料来源广泛，加之其方法操作简单，在草坪草遗传转化过程中应用广泛。本发明对基因枪转化日本结缕草的具体的转化参数进行系统研究，并且把能综合提高植物抗旱、耐盐耐寒的DREB1A基因转入日本结缕草胚性愈伤组织中，得到了转基因植株。
发明内容
本发明的目的在于提供日本结缕草高频基因枪转化方法，以提高结缕草的转化效率。
本发明方法选择日本结缕草胚性愈伤组织为转化受体；以单因素试验和正交试验设计对基因枪转化日本结缕草的具体因素进行筛选与优化，确定基因枪转化法的具体参数；并进一步确定了转化子筛选方案。
本发明结缕草基因枪转化法，选用直径1μm的金粉、每枪250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轰击距离、轰击3次。轰击压力为1100psi。
转化受体可以为结缕草成熟种子或者其他外植体诱导形成的胚性愈伤组织，选择诱导4个月、继代培养25d左右的胚性愈伤组织作为靶材料进行基因枪轰击，靶材料在轰击前4h至轰击后12h间，培养于含有甘露醇及山梨醇各0.2M的高渗培养基上。
愈伤组织经轰击后采用延迟筛选的方式，根据选择标记确定筛选方案。
进一步地，本发明确立了日本结缕草的潮霉素筛选方案。具体地说，将含有潮霉素抗性标记的表达载体转入植物受体后，恢复培养5d，然后转入含有50mg/L潮霉素的愈伤组织继代培养基上，培养2个月，每月继代一次，转入潮霉素浓度为30mg/L的抗性植株再生培养基中。
本发明对日本结缕草基因枪转化方法进行了系统的研究，获得较高的转化效率。具体包括1)基因枪转化过程中，在轰击压力一定的情况下，基因枪转化受多个因素的综合影响，本专利运用单因素试验设计研究了金粉直径、受体处理、受体状态等因素的影响，并且以正交试验设计综合考察了金粉与DNA用量、轰击高度、轰击次数综合效果。找到了最佳的基因枪轰击参数，建立了高效的转化体系。
2)将含有潮霉素抗性标记的表达载体转入植物受体后，要对转化子进行抗生素筛选，本发明对潮霉素浓度进行筛选，确立了日本结缕草的潮霉素筛选方案，可应用于含有潮霉素抗性标记的表达载体转入日本结缕草后，进行转化体的初步筛选鉴定。
3)将DREB1A-GUS双基因表达载体成功转入日本结缕草培训愈伤组织中，证明了这种方法的可靠性与实用性。
附图1 DREB1A-GUS双基因表达载体结构图；附图2愈伤组织中GUS瞬时表达；附图3潮霉素抗性愈伤中GUS的稳定表达；附图4筛选培养基中抗性愈伤组织的生长；附图5潮霉素抗性植株再生；附图6 GUS在转基因植株根中的表达；附图7移栽后的转基因植株；附图8转DREB1A植株PCR分析，图中1～5为转化植株；6为未转化植株；7为质粒；8为分子量标准DL2000；附图9转DREB1A基因抗性植株PCR-Southern杂交结果，图中1为阳性对照；2为未转化植株；3～12为抗性植株；附图10转DREB1A基因抗性植株的Southern杂交结果，图中1为转化植株；2为未转化植株；3为质粒；4为分子量标准DL2000。
具体实施例方式1材料和方法1.1植物材料日本结缕草品种‘Zenith’、‘Liaoning’、‘Qingdao’(Zenith’种子购自美国TMI公司(Turf Merchants，Inc)，‘Liaoning’、‘Qingdao’品种种子购自北京市种子公司)成熟种子以次氯酸钠溶液(北京化工厂生产，＞5％活性氯，加入1滴吐温20)在磁力搅拌器上消毒1小时，以无菌水冲洗3～5次，4℃下浸泡3d，再以次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干多余水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，黑暗状态下28℃诱导愈伤。愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白或黄色、颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养，作为基因转化的受体材料。
1.2表达载体结构图见附图1，双基因表达载体pCAMBIA1301(CAMBIA)，包含DREB1A和gus基因，分别由ubi及CaMV35S启动子驱动，筛选基因为hph，由CaMV35S启动子调控。该表达载体北京林业大学草坪草实验室构建并保存。
1.3基因枪转化因素的确定采用美国Bio-Rad公司的PDS-1000/He型基因枪，具体操作方法参照说明书进行。通过统计抗性愈伤率、GUS染色率为指标对金粉粒径、金粉与DNA用量、轰击高度、轰击次数、渗透处理、受体状态等因素进行探讨，获得最佳的轰击方法。
1.4筛选压的确定将状态相同的日本结缕草胚性愈伤组织转入含不同浓度潮霉素的愈伤组织继代培养基上，并测量愈伤初重，30d后测量愈伤终重，用未加潮霉素的处理作对照，观察愈伤组织生长状况。以愈伤增重率绘制潮霉素对愈伤组织生长影响曲线(killing curves)，确定愈伤组织筛选培养基中的筛选压。将‘Zenith’品种的胚性愈伤组织接种于含不同浓度潮霉素的植株再生培养基上，1个月后统计植株再生率，以未加潮霉素的处理作对照，观察潮霉素对愈伤组织分化的影响，确定抗性植株再生培养基中的潮霉素浓度。
1.5转化植株的筛选再生转化后16h，将轰击过的愈伤组织转至无渗透压的愈伤组织继代培养基上，恢复培养5d后(考察延迟筛选对转化效率影响的实验中，直接转入筛选培养基)，转入愈伤组织筛选培养基，每月挑选生长旺盛的愈伤组织继代到相同的培养基上。2个月后，将潮霉素抗性愈伤组织转到抗性愈伤再生培养基上，诱导体胚发生和植株再生。约1个月后，待小植株出现，将其转入不含潮霉素的1/2MS培养基中壮苗。根系强壮后，炼苗3d，然后小心洗去植株根部琼脂，移栽入由砂(0.25～0.5mm)与草炭土混合基质中，混合比例9∶1。
1.6 GuS表达的检测转化后40h，对转化的受体进行组织化学染色，观测愈伤组织中GUS基因的瞬时表达，在Olympus体视显微镜下观察染色情况；2个月后，对潮霉素抗性愈伤组织进行组织化学染色，观测GUS基因的稳定表达。染色方法参考Jefferson方法(Jefferson Richard A，Tony A.Kanvanagh and Michael W.Bevan.Gus fusionsβ-glucuronidaseand a sensitive and versatile gene[J].The EMBO Journal，1987，6(13)3901-3907)，以未转化愈伤组织作对照。
1.7转化植株的分子检测采用SDS法提取抗性植株的植物组DNA，后进行PCR扩增分析及Southern印迹杂交。
DREB1A引物序列引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATGAAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACTCCA TAA CGA TAC G＜3’反应体系采用25μl反应体系，具体如下10×Taq buffer 2.5μLdNTP 2.0μL引物F+R2×1.0μLTaq酶 0.5μL模板(质粒和代测植物)DNA1μLddH2O 17μL总体积 25μL反应条件
2结果与分析2.1筛选压的确定将日本结缕草的愈伤组织接种于含不同浓度潮霉素(30、50、70和90mg/L)的培养基上，称量初重，5周后称量愈伤组织终重，计算愈伤增重率，以未添加潮霉素的处理作对照，测定潮霉素对愈伤组织生长的影响。将胚性愈伤组织接种于含不同浓度潮霉素的植株再生培养基中，以不含潮霉素的处理作对照，测定潮霉素对植株再生的影响。
表1 潮霉素对愈伤组织生长与植株再生的影响
结果可见，对于日本结缕草的基因枪转化，在愈伤组织筛选阶段选用50mg/L的潮霉素浓度，植株再生培养基中降至30mg/L，效果较好。
2.2基因枪转化参数的多因素正交实验在1100psi的轰击压力下，设计不同的基因枪转化处理，轰击后40h观测愈伤组织中GUS基因的瞬时表达，统计并计算瞬时表达率。试验设计及结果见表2。
表2 基因枪转化参数试验设计及结果
可见，金粉和DNA用量分别为250μg和0.5μg、轰击距离5cm、轰击次数3次的组合，GUS瞬时表达率最高，说明该组合最适于日本结缕草基因枪转化。
2.3金粉直径对转化效率的影响分别以直径为0.6μm及1μm的金粉包被DNA，以1100psi的轰击压力、5cm的轰击距离和轰击3次的基因枪转化参数转化受体材料，轰击后40h进行组织染色，观察GUS的瞬时表达，以愈伤组织染色率考察金粉直径对转化效果的影响。
表3 金粉直径对基因枪转化GUS瞬时表达的影响
由表3可见，使用直径为0.6μm的金粉，愈伤组织的GUS瞬时表达率仅为21.23％，远远低于使用直径1μm金粉的处理(75.04％)。数据经反正弦变换后进行方差分析，结果表明两种直径的金粉处理差异显著(P＜0.05)。因此，在日本结缕草基因枪转化中选用直径为1μm的金粉。
2.4渗透处理对转化效率的影响基因枪轰击前4h，将日本结缕草愈伤组织转至高渗透压培养基上(含山梨醇、甘露醇各0.2M)，转化后16h，再将愈伤转移至无渗透压及筛选压的愈伤组织继代培养基上，恢复培养5d后再进行潮霉素选择培养，以筛选1个月后的抗性愈伤率作为考察指标，每处理3个重复，以未经过渗透处理的愈伤以同样方法转化作对照。
表4 渗透处理对基因枪转化抗性愈伤率的影响Tab.3-4 Effect of Osmotic Treatment on Calli Survival Rates following Biolistic Bombardment
表中数据经反正弦变换后进行方差分析，结果显示渗透处理与非渗透处理间在0.05水平上有显著差异。从均值来看，经过渗透处理抗性愈伤率(32.52％)高于非渗透处理(24.24％)。
2.5受体状态对转化效率的影响在日本结缕草胚性愈伤组织不同生长时期内，分别以250μg+0.5μg的金粉和DNA用量、5cm轰击距离、每皿轰击3次的参数做转化，统计抗性愈伤率及抗性植株率，结果如表5所示。
表5 愈伤生长时期对基因枪转化抗性愈伤率的影响
注a.抗性愈伤率＝抗性愈伤数/靶组织块数×100％；b.抗性植株获得率＝抗性株系数/靶组织块数×100％可见，在生长时期分别为4、6、8和12个月的愈伤组织的基因枪转化中，生长时期为4个月的愈伤组织所得到的抗性愈伤率和抗性植株率最大，分别为28.4％和5.6％，随着愈伤组织继代时期的增加，抗性愈伤率和抗性植株率总体呈下降的趋势，至愈伤生长12个月时，没能获得抗性植株。
3.结论3.1建立了日本结缕草抗性愈伤组织的筛选方案。对于基因枪法，采用延迟筛选的方式，愈伤组织轰击后恢复培养5d，然后转入含有50mg/L潮霉素的愈伤组织继代培养基上，培养2个月，每月继代一次，转入潮霉素浓度为30mg/L抗性植株再生培养基中。
3.2建立了高效的日本结缕草基因枪转化体系。其技术要点为选用直径为1μm的金粉、每枪250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轰击距离、轰击3次的基因枪转化参数，选择诱导4个月、继代培养25d左右的胚性愈伤组织进行基因枪轰击，靶材料在轰击前4h至轰击后12h间，培养于含有0.2M的甘露醇及0.2M的山梨醇高渗培养基上。
3.3运用已经建立的遗传转化体系进行日本结缕草的遗传转化，获得了转入DREB1A基因的日本结缕草转基因植株，是一次成功的运用实例。
权利要求
1.日本结缕草高频基因枪转化方法，其特征在于，选择胚性愈伤组织作为转化受体进行基因枪转化，转化采用直径为0.6-1μm的金粉、每枪250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轰击距离、轰击1-3次的基因枪转化参数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因枪转化采用直径为1μm的金粉，5cm的轰击距离轰击3次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，选择诱导4个月、继代培养23～27天的胚性愈伤组织进行基因枪轰击，靶材料在轰击前4h至轰击后12h间，培养于含有0.2M的甘露醇及0.2M的山梨醇高渗培养基上。
4.一种制备转基因日本结缕草的方法，其特征在于，该包括如下步骤1)采用权利要求1～3所述的方法进行基因枪转化；2)筛选转化子。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化使用含有潮霉素抗性标记的表达载体。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，筛选转化子的方法是转化后16h，轰击后的愈伤组织继续在高渗培养基上培养12h，然后应用延迟筛选方案，转入不含筛选压的愈伤组织继代培养基上恢复培养5d，再转移至含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选2个月，每月继代一次；将获得的抗性愈伤组织转入潮霉素浓度降至30mg/L的抗性植株再生培养基中。
全文摘要
本发明提供了结缕草高频基因枪转化方法，建立了一套完整、高效的遗传转化体系。本发明基因枪法转化的具体参数是选用直径为1μm的金粉、每枪250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轰击距离、轰击3次的基因枪转化参数，选择诱导4个月、继代培养25d左右的胚性愈伤组织进行基因枪轰击，靶材料在轰击前4h至轰击后12h间，培养于含有0.2M的甘露醇及0.2M的山梨醇高渗培养基上。本发明还进一步将可综合提高植物抗旱、耐寒、耐盐性的DREB1A基因转入日本结缕草胚性愈伤组织中，获得了转基因植株。并且确立了结缕草转化子的潮霉素筛选方案。
文档编号C12N15/82GK101045935SQ200710064240
公开日2007年10月3日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者韩烈保, 齐春辉, 梁小红, 刘君, 王维飞, 曾会明 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 齐春辉