专利名称:猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定的利记博彩app
技术领域:
本发明属于生物技术技术领域,涉及猪y -千扰素在重组杆状病 毒中的表达及其抗病毒活性的测定 背景技术干扰素(Interferon, IFN)是在特定的抗原刺激下由细胞分泌的一类具 有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白,是发现最早,研 究最多的细胞因子。根据IFN的细胞来源和结合受体不同,将IFN分为I 型和II型。I型IFN主要有a、 p两个亚型,分别主要由淋巴细胞和成纤维 细胞产生[11,它们作用于哼一受体,可抑制病毒DNA复制和蛋白质合成, 活化NK细胞,促进MHCI类分子提呈抗原。II型IFN为Y-干扰素,主要 由T细胞和NK细胞产生M,与I型IFN相比有多种免疫学活性,具有促进 MHCII类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强辅助T细胞 和细胞毒性T细胞的产生等诸多免疫调节活性,既可以单独作为生物制剂 应用于疾病的防治,也可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果13 4。PoIFN-Y 全基因为501个碱基,编码166个氨基酸,前20个氨基酸为信号肽,后146 个氨基酸为成熟多肽,含有两个糖基化位点[51。国内外研究表明,PoIFN-Y 在抑制猪口蹄疫病毒,蓝耳病病毒和非洲猪瘟病毒的试验中均取得了良好 效果6~8]。19卯年Dijikmans等肯先克隆出PoIFN-y基因,此后国内外学者利用基 因工程技术生产rPoIFN"Y的研究也开始兴起。迄今为止,PoIFN-y基因已在 大肠杆菌[91、毕赤酵母"w、和兔肾细胞1111等细胞中获得表达。与原核表达 系统相比,杆状病毒表达系统可以对外源蛋白进行多种翻译后加工和修饰, 表达重组蛋白更接近天然结构。为此,本研究采用BAC-TO-BAC杆状病毒 表达系统(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System)对PoIFN-丫全基因 进行了表达,构建含有PoIFN-y完整开放阅读框(ORF)的重组杆状病毒, 感染s投细胞表达出具有高效抗病毒活性的rPoIFN,。我国是养猪大国,每年因病毒性疾病的爆发给养猪业带来巨大损失,研制出具有抗病毒活性和 免疫调节活性的基因工程rPoIFN-Y在猪病防治上具有十分重要的意义。发明内容本发明的目的采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC Baculoviras Expression System )对PoIFN-y全基因进行了高表达,构建含有PoEFN-y完整开放阅读框的重组杆状病毒,感染昆虫细胞表达出具有高效抗 病毒活性的重组PoIFN卞为了达到本发明的目的,釆用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统 (BAC-TO-麻AC Baculovirus Expression System ,由美国Gibco brl公司开发) 对IFN-y全基因进行了表达构建含有IFN-y完整开放阅读框的重组杆状病 毒,感染昆虫细胞表达IFN-Y,通过间接IFA和间接EUSA方法,证实目 的蛋白在昆虫细胞中获得表达。并分别釆用VSV*GFP-PK15细胞系统通过 感染复制神制试验测定重组猪IFN,抗病毒活性,达到2xl04IU/ml。发明效果(1) 目的蛋扫表达的高效性选用昆虫细胞优势密码子对GENEBANK中 提交的猪ffN-Y基因序列进行密码子优化,以便目的蛋白在杆状病毒-昆虫 细胞中高效表达;(2) 目的蛋白获得的时效性Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中重组病毒的 筛选是在大腾杆菌中进行,利用抗性基因和PCR筛选,并采用杆状病毒穿 梭载体技术,如此大大縮短了病毒纯化和鉴定的时间,使原来的几个月时 间縮短到几周,大大縮短了实验时间;(3) 杆状病奪表达系统是目前颇受欢迎的一种表达系统,它可以进行多种 翻译后修饰作用,包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙酰化、羧基末端 酰胺化和信号肽的切割、转运,所表达蛋白在结构和功能上与天然蛋白比 较接近。重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组IFN-y进行了多种翻译后加 工和修饰作用,产物和天然IFN-y—样可以进行分泌型表达,具有较高的生 物学活性。(4) 生物安全性杆状病毒具有高度的种属特异性,仅感染昆虫,对脊椎 动物无感染性,其表达产物安全可靠。(5) 制备方便,成本低廉重组杆状病毒感染的昆虫细胞能分泌表达IFN-y,只需经过离心豕活等简单处理程序即可以直接应用于畜禽疾病的临床应用o(6)抗病毒活性检测方法准确可靠采用VSV*GFP-PK15细胞系统通过感 染复制抑制试验测定重组IFN-Y抗病毒活性。传统的干扰素抗病毒活性是利 用细胞病变抑制法测定,通过肉眼或显微镜观察噬斑的数量而确定其活性 单位,本实验釆用的重组VSV*GFP可以在感染宿主细胞内表达绿色荧光蛋 白,通过观察荧光强度和数量,便可确定其感染和复制情况,因此通过测 定其荧光强度和数量就可以确定干扰素的活性单位,使得干扰素活性的测 定更加准确和简便。
图1是IFA检测重组PoIFN,在重组杆状病毒感染细胞中的表达图。 图2是阆接ELISA检测重组PoIFN-y在重组杆状病毒感染细胞上清中 的表达曲线图。图3是重组杆状病毒表达PoIFN-Y抑制VSV*GFP在PK15细胞上复制 表达4是鼠抗PoIFN-y免疫血清阻断重组PoIFN-y抗病毒活性试验结果具体实施方式
实施例1: 1材料和方法 1.1材料质粒PLlC57-PoIFN-Y (PoIFN-Y基因插在S附al位点)、原核表达质粒 pET-30a(+)、供体质粒pFastBacTMl (Invitrogen) ; DH则加感受态细胞 (Invitrogen) , sf9细胞系,PK-15细胞,骨髓瘤细胞(SP2/0)均由本实验 室保存。Grace's培养基,DMEM培养基;转染试剂(Cellfectin Reagent) 购于Irwitrogen公司。荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物 技术公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG购自Sigma公司。 引物(PoIFN,-f、 PoIFN个r; M13-48f、 M13-47r)由上海博亚生物有限公 司合成。表达绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV *GFP由 本实验室构建、滴定并保存。 1.2抗单克隆抗体的制备 以原核表达载体构建引物(PoIFN"Y-f 5,TCTC^HZ]eCAGGCCCCCTTCTTCA 3, ; PoIFN-y-r5,CCTACrorCG^CATATTGGAGGCACG 3')扩增PoIFN-"/不包含信号肽 序列的455bp基因片段,将PCR扩增目的片段£coR I和I限制酶^酶 切后克隆于原核表达质粒pET-30a(+)&oRI和Sa/ I位点,PoIFN,蛋白表 达框架与His标签融合。转化BL21, IPTG诱导,SDS-PAGE检测融合蛋白 表达,Ni化琼脂糖柱纯化。原核表达重组PoIFN-Y蛋白作为抗原按10ug/ 只的剂量腹腔和后肢肌肉注射免疫BALB/c小鼠,首免弗氏完全佐剂乳化, 二免、三免弗氏不完全佐剂乳化,间隔时间三周,第三次免疫后(采血分 离血清,制每鼠抗原核表达重组PoIFN,免疫血清),加强免疫一次后三天 取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经3次有限稀 释,最终获得1株稳定分泌抗PoIFN-Y单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹 水,测定效价,-20"€保存备用。1.3表达rPoHTSPy重组杆状病毒rBac-PoIFN-Y的构建与鉴定So/1和I双酶切pUC57-PoIFN-y,将编码PoIFN々完整ORF克隆 至供体质粒pFastBacTMl,构建pFastBacTMl-PoIFN-y (pFast-PoIFN-y)。将 pFast-PoIFN^y转化至DHlflBae,提取质粒,PCR筛选阳性重组穿梭质粒 rBacmid-Poim-Y,制备高纯度阳性审组穿梭质粒,采用CdlfectinRReagent(Invitrog節)转染s投细胞,待细胞出现病变后,按文献|12|进行重组病毒 扩增,蛋白,K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA,以M13-48f、 M13-47r 为引物PCR验证PoIFN-y基因在重组病毒中获得稳定重组,重组病毒命名 为rBac-PoIFNi。扩增种毒,进行效价滴定后,4'C保存备用。 1.4间接免疫荧光检测PoIFN-y表达上述r&恥-PoIFN"Y种毒液按1:10体积比感染新鲜制备sf9细胞,至绅 胞病变达邻%时,收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上,自然阴干后 95%乙醇固定,同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1:100 稀释抗PoIFN^单克隆抗体和相同倍数稀释的正常小鼠腹水为一抗。PBST(0.05% Tw球n20)洗涤后加入1:50倍稀释荧光素(F1TC)标记的羊抗鼠 IgG为二抗,作用30min, PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察 结果。1.-5间接EUSA检测PoIFN-Y表达收取rBaoPoIFN"Y感染sf9细胞上清作为抗原,WNa2C03、 NaHC03 (pH=9.6)凝沖液分别做1:5、 1:10、 1:20、 l:40稀释,按每孔100ul包被96孔ELISA板(Costar) ,.4'C过夜;10%脱脂乳封闭以抗PoIFN-y单克 隆抗体为一抗,并将其做1:102 1:107系列稀释;1:2500稀释HPR标记山 羊抗鼠IgG为二抗另设l:5稀释野生杆状病毒感染细胞上清包被阴性对照 PBST洗涤,底物OPD作用15min, 2M硫酸终止反应后,测定OD490nm . (Bio-RW, Benchmark plus)。每个稀释度至少设3个平行孔,取平均值。 1.6重组PoHTSPy抗病毒活性测定按文献['31,用VSV*GFP-PK-15细胞系统测定rPoIFN-Y抗病毒活性,以 2xlO、ells/孔密度将PK-15细胞铺于24孔板,待细胞贴壁后,加入2xl0 2xl(^不同倍数稀释rBac-PoIFN-Y感染sf9细胞的培养上清(rPoIFN^)和 2xlO 2xlO^不同倍数稀释野生杆状病毒感染细胞的培养上清,37'C作用过 夜,并设空白对照。100pfiV孔VSV*GFP感染细胞,lh后换完全培养液, 24h后荧光显微镜观察结果,以荧光亮度为对照组50%的最高稀释度为一 个抗病毒单位(IU)。 1.7重组PoffN^抗病毒活性阻断试验以2xlO、lls/孔密度将PK-15细胞铺于24孔板,待细胞贴壁后,取100IU 的rPoIFNwy与不同稀释度的鼠抗原核表达重组PoIFN-y免疫血清室温作用lh,同时设非免疫小鼠血清与100IU的rPoIFN-Y作用对照组,将混合液体 作用PK-15细胞过夜,100pfu/孔VSV'GFP感染细胞,lh后换完全培养液, 24h后荧光显微镜观察结果。 2结果2.1重组杆状病毒rBac-PoIFN-Y的构建与鉴定为构建表达PoIFN-y基因的重组杆状病毒,首先将PoIFN,完整ORF 克隆至供体貭粒pFastBacTMl,构建pFast-PoIFN-y, £coR I和///wlin双酶 切后获得约4700bp和560bp两个片段,与理论预期值相符。.将 pFastBacTMlAoIFN"Y转化至DH10Bac,经蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组穿 梭质粒rBac加id-PoIFN卞进一步提取重组质粒rBacmid-PoIFN-y转染sf9细 胞获得重组杆状病毒rBac-PoIFN-Y,提取病毒基因组DNA,以M13-48f和 M13-47r为引物进行PCR鉴定,扩增出特异的2.8kb的产物,表明PoIFN-y 基因在杆状病毒中获得重组。 2.2间接IFA检测rPoIFN,的表达分别以滞ac-PoIFN"7和野生杆状病毒感染sf9细胞,至细胞病变达90%时收集细胞制备涂片,再分别以1:100抗PoIFN-Y单克隆抗体和相同倍数 稀释的注射SP2/0小鼠腹水为 一抗进行间接IFA检测。结果抗PoIFN-y单克 隆抗体检测rBac-PoIFN-Y感染sf9细胞均显示强荧光信号,并且荧光主要集 中在细胞膜上(图1A),'而1:100稀释注射SP2/0小鼠腹水则荧光信号阴 性(图1B);以野生型杆状病毒感染sf9细胞制备涂片,1:100稀释抗PoIFN-y 单克隆抗体荧光信号也为阴性(图1C),结果表明rPoIFN,在sf9细胞中 获得表达。2.3间接EUSA检测rPoIFN"Y的表达收取rBac-PoIFN,感染sf9细胞上清作为抗原,分别以1:5、 1:10、 1:20 和1:40进行稀释,按每孔100ul包被96孔ELISA板,以10倍系列稀释的 抗PoIFN^单克隆抗体为一抗1:2500倍稀释HRP标记山羊抗鼠IgG为二 抗;底物OPD作用15min, 2M硫酸终止反应后,测定OD49()nm。结果表明 rBac-PoIFNi感染昆虫细,培养上清5倍、10倍、20倍稀释ELISA OD490nm 值相近,而40倍稀释OD4'衡m值明显降低,并且血清1000倍稀释后P/N值 仍大于2.0 (图2),表明rPoIFN-Y在sf9细胞中获得表达。 2.4间接ELISA检测rPoIFN"Y的表达收取出ac-PoIFN-Y感染sf9细胞上清作为抗原,分别以1:5、 1:10、 1:20 和1:40进行稀释,按每孔100ul包被%孔ELISA板,以10倍系列稀释的 抗PoIFN-y单克隆抗体为一抗;1:2500倍稀释HRP标记山羊抗鼠lgG为二 抗;底物OPD作用15min, 2M硫酸终止反应后,测定OD490nm。结果表明-rBac-PoIFN-y感染昆虫细胞培养.卜.清5倍、10倍、20倍稀释EUSA OD柳圆 值相近,而邻倍稀释OD49o,值明显降低,并且血清1000倍稀释后P/N值 仍大于2.0 (图2),表明rPoIFN-Y在sf9细胞中获得表达。 2.5重组PoIFN々抗病毒,阻断试验利用VSV*GFP-PK-15细胞系统间接证实rPoIFN-Y抗病毒活性,用不同 稀释度的鼠抗原核表达重组PoIFN-y免疫血清与100IU的rPoIFN-y室錄下 结合lh,作用PK-15细胞过夜,感染VSV'GFP, 24h后荧光显微镜观察。 结果表明rPoIFN"7的抗病毒活性可以有效地被鼠抗原核表达重组PoIFN-y 免疫血清阻断。完全阻断100IU的VSV*GFP感染性的有效稀释倍数为128, 非免疫鼠血清则完全不能阻断rPoIFN-Y的抗病毒活性(图4)。 3讨论Y-干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性,人Y-干扰素在 临床疾病的防治中早有应用,动物?干扰素作为生物制剂或疫苗佐剂也具 有较好的应用前景,许多国家已经将动物细胞因子的开发利用作为研究重 点。,干扰素基因在正常情况下处于抑制状态,只有在某些刺激因子的刺激 下才能表达,产量低、纯化困难、成本比较高,难以大量制备,随着基因 工程技术的迅速发展,可以利用该技术大量制备Y-干扰素。本研究构建了含有PoIFN-y完整ORF的重组杆状病毒,感染sf9细胞 有效表达出rPoIFN"Y。以抗PoIFN-Y单克隆抗体为一抗,间接IFA和间接 ELISA证实tPoIFN^在sf9细胞中获得良好表达,进行间接IF A检测PoIFN-y 表达时,发现荧光主要集中在细胞膜上,胞浆中荧光相对较少。同时利用 rBac-PoIFN^感染sf9细胞培养上清为包被抗原进行间接ELISA试验的 OD柳nm明显髙于以rBac-PoIFN-Y感染sf9细胞裂解物,结果表明,细胞培 养上清含有大量rPoIFN个iPoIFN-y在信号肽的引导下被分泌到细胞培养 上清中,为以后rPoIFN-Y的提纯提供便利。传统的IFN抗病毒活性是利用细胞病变抑制法测定,通过噬斑的数量 而确定其活性单位,本研免采用的重组VSV*GFP可以在宿主细胞内复制, 并表达绿色荧光蛋白,通过观察荧光强度和数量确定其感染和复制情况, 即可测定,rPcrfFN"Y的抗病毒活性。因此,使用VSV*GFP作为攻击病毒, 在PK15 ^臁上测定rPoIFlSPy抗病毒活性时,采用测定荧光强度或数M代 替传统的噬斑数量计数而确定其活性单位,使得IFN抗病毒活性的测定更 加准确和简便。采用VSV*GFP在PK15的感染复制抑制试验初步研究了 rPoIFN-Y抗病毒活性,并证实rPoIFN,具有高效抗病毒活性,rBac-PoIFN^ 感染sf9细胞上清抗病毒效价可达2xl04IU/ml,而相同倍数稀释的野生杆状 病毒感染细胞上清不具有抗病毒活性,仅在20倍稀释时能非特异性的部分 抑制VSV*GFP在PK15中的复制。Bac-to^Btc杆状病毒袭达系统采用杆状病毒穿梭载体技术大大縮短了 病毒纯化和鉴定的时间,使原来的几个月时间縮短到几周。重组杆状病毒 感染sf9细胞表达的rPoIFN-Y进行了多种翻译后修饰,接近于天然PoIFN个 具有较高的生物学活性,而且杆状病毒具有高度的种属特异性,仅感染昆 虫,对脊椎动物无感染性,其表达产物安全可靠,经过简单处理即可以直 接应用于畜,病的临床治疗。参考文献[1]卡恩.分子病毒学原理[M].北京科学出版社,2006: 177-178.[2] Williams J G, Jurkovich G J, Maier R V. 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权利要求
1. 猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达,其特征在于将GeneBank中提交的猪γ-干扰素基因序列进行密码子优化并人工合成得到PUC57-PoIFN-γ(PoIFN-γ基因插在Sma I位点),Sal I和KpnI双酶切PUC57-PoIFN-γ,将编码PoIFN-γ基因DNA克隆至pFastBacTM1,构成pFastBacTM1-PoIFN-γ;将pFastBacTM1-PoIFN-γ转化DH10Bac,提取质粒,PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-PoIFN-γ,制备阳性重组基因组克隆DNA,采用CellfectinRReagent(Invitrogen)转染sf9细胞,待细胞出现病变后,按文献[12]介绍的方法,进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增,蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA,M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)为引物PCR验证PoIFN-γ基因在纯化病毒中获得稳定重组,重组病毒命名为rBac-PoIFN-γ;上述rBac-PoIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞,至细胞病变达90%时,收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上,自然阴干后95%乙醇固定,同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1∶100稀释抗PoIFN-γ单克隆抗体和相同倍数稀释的正常小鼠腹水为一抗;PBST(0.05%Tween20)洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗,作用30min,PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。
2、 根据权利要求l所述的猪Y-干扰素在重组杆状病毒中的表达,其特 征在于其抗病毒活性的测定采用VSV*GFP-PK15细胞系统测定重组 PoIFN"Y抗病毒活性,以2xlO"cells/孔密度将PK15铺于24孔板,待细胞贴 壁后,加入2xl0 2xl()6不同稀释度的重组PoIFN-y (rBac-PoIFN-Y感染sf9 细胞上清),371C作用过夜。10(^11/孔丫8丫*0 感染细胞,l小时后换完 全培养液,24小时后荧光显微镜观察结果,以荧光亮度为对照孔50%的最 高稀释度为一个单位(IU)。
全文摘要
本发明公开了密码子优化后的猪γ-干扰素基因序列、猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定,构建了表达猪γ-干扰素的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ,采用抗PoIFN-γ单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。抗病毒活性试验显示,结果表明重组PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得良好表达,并具有高效抗病毒活性。
文档编号C12N15/866GK101220376SQ20071005644
公开日2008年7月16日 申请日期2007年1月12日 优先权日2007年1月12日
发明者李守军, 李旭东, 步志高, 莉 赵, 鲍恩东 申请人:天津瑞普生物技术集团有限公司