专利名称：一种外源基因在球虫类原虫——隐孢子虫体内表达的转染系统的利记博彩app
技术领域：
本发明提供了一种外源基因在球虫类原虫——隐孢子虫体内表达的 转染系统，属于基因工程领域。
背景技术：
球虫类原虫——隐孢子虫是一种重要的人兽共患原虫，该虫宿主范围 广，感染率高，且危害严重，虽经多年研究，但迄今尚无理想的防治办法， 究其原因就是缺乏研究隐孢子虫细胞和分子生物学的适宜的基因转染载 体系统。
发明内容
本发明提供了一种以球虫类原虫——隐孢子虫病毒为转染载体和以 DNA为转染载体的转染系统，为研究球虫类原虫的分子生物学和细胞生 物学提供了转染系统。该转染系统含有多克隆酶切位点，使用方便，可将多种外源基因转入 隐孢子虫体内，进行隐孢子虫的基因表达调控及生化代谢等研究。本发明的技术解决方案如下利用隐孢子虫病毒RNA或含隐孢子虫的基因启动子的DNA作转染 载体，在隐孢子虫体内进行外源基因的表达。包括用以隐孢子虫病毒RNA 为载体和以DNA为载体的转染系统。1、以隐孢子虫病毒RNA为载体的转染系统分别将含外源基因和多克隆酶切位点的基因替换隐孢子虫L-dsRNA 或S-dsRNA的部分编码区，并分别在5'外编码区前端加入T7启动子，后 用RNA聚合酶进行体外转录，后将其转录体电穿孔至隐孢子虫子孢子或卵囊体内进行外源基因的表达。2、以DNA为载体的转染系统分别将装在质粒载体上的隐孢子虫L,dsRNA或S-dsRNA病毒全长 cDNA(附图l-l， 2: L,dsRNA1783bp或S-dsRNA 1375bp)的5'外编码 区前连接隐孢子虫基因的启动子和信号肽基因，将含外源基因和多克隆酶 切位点的基因替换L,dsRNA或S-dsRNA的部分编码区，构建含外源基因 的重组质粒，然后分别将该质粒电穿孔至隐孢子虫体内表达外源基因。 微小隐孢子虫病毒基因组L-dsRNA全长cDNA序列表。 微小隐孢子虫病毒基因组S-dsRNA全长cDNA序列表。 本发明的积极效果在于球虫类原虫——隐孢子虫病毒基因组小、稳 定、感染率高，每个细胞可达5xl03，而且隐孢子虫为真核生物，外源基 因在隐孢子虫体内表达出的蛋白具有活性。该转染系统含有多克隆位点， 为通用型转染载体，多种外源基因可在隐孢子虫体内表达，为研究球虫类 原虫的分子生物学和细胞生物学提供了转染系统。
图l、以微小隐孢子虫病毒RNA为载体的转染系统； a: L-dsRNA全长1783bp b:S-dsRNA全长1375bpc:微小隐孢子虫病毒L-dsRNA转染载体构建方式d:微小隐孢子虫病毒S-dsRNA转染载体构建方式 图2、 ppoly2/sfinotcpvGFP重组质粒构建图。 图3、隐孢子虫病毒体外转录体转染后荧光显微镜检测结果。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本 发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例l以隐孢子虫病毒RNA为载体的转染系统如图l-a,b,c,d所示，根据CPV基因组L-dsRNA与S-dsRNA的序列特征， 将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因替换L-dsRNA与 S-dsRNA的部分编码区，构建CPV与GFP的嵌合体。对CPVL-dsRNA与 S-dsRNA运用PCR反应将T7启动子分别弓|入到CPV L-dsRNA与S-dsRNA cDNA的5'端前，运用PCR方法扩增出CPVL的5'端489bp (包括5'端UTRs 与部分编码区)、3'端548bp， GFP编码区702bp， CPVS的5'端459bp (包 括5'端UTRs与部分编码区)、3'端293bp五个片段，分别构建CPVL与GFP 和CPVS与GFP的嵌合体，并分别克隆入载体pPoylI/sfinot，得重组质粒酶切线性化后，用凝胶回收试剂盒回收、定量。取约1.5吗线性化质粒作为模板，应用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System进行体外转录。将线性化质粒pCPVL489/GFP/pCPVL548体外转录体RNA(200吗)、线性化质粒pCPVS459/GFP/pCPVS293体外转录体RNA(200吗)、pCPVL489/GFP/pCPVL548与pCPVS459/GFP/pCPVS293体外转录体混合物RNA (各200吗)。分别加入微小隐孢子虫卵囊液中，以电压(3000V/cm)、脉冲时间(8ms)进行电击反应。之后分别冰浴15min，离心沉淀后，力Plml脱囊液，于37"C温箱中作用90min。之后洗去脱囊液，用PBS悬浮沉淀，置5MC02 37"C温箱中孵育18h后，在蓝荧光激发条件下，三种情况都有卵囊及子孢子发出绿色荧光。说明可以利用微小隐孢子虫病毒作为一种转染载体，携带外源基因在其体内表达。 实施例2以DNA为载体的转染系统如图2所示，首先克隆球虫类原虫——隐孢子虫a -tubulin promotor(a-微管启动子)基因并进行全序列分析；在应用PCR技术扩增并克隆 球虫类原虫——隐孢子虫a -微管基因启动子序列和多聚poly(A)信号与 GFP，引入多克隆酶切位点(MCS)，并利用MCS分别将绿色荧光蛋白(GFP)插入a-微管基因启动子与信号肽之间，克隆入载体，构建GFP 表达盒pa-微管/GFP/信号肽，电穿孔法(以电压(3000V/cm)、脉冲时 间(8ms))导入球虫类原虫——隐孢子虫，后荧光显微镜检测到了GFP的 表达，确定其转录活性；线性化后转染球虫类原虫——隐孢子虫，通过筛 选及核酸鉴定，在球虫类原虫——隐孢子虫体内稳定表达了绿色荧光蛋 白，构建球虫类原虫——隐孢子虫稳定DNA转染载体，建立了球虫类原 虫——隐孢子虫DNA稳定转染方法。微小隐孢子虫病毒基因组L-dsRNA全长cDNA序列表1 61121' 181421 481 541781 8411141 1201 '1321 1381 1441' 1501' 15611681 '1741 CGGCCACATGTTACCCAAGACCGGCAGGGTCCGAGGGAAGCCT微小隐孢子虫病毒基因组S-dsRNA全长cDNA序列表
权利要求
1、一种外源基因在球虫类原虫——隐孢子虫体内表达的转染系统，其特征在于利用隐孢子虫病毒RNA或含隐孢子虫的基因启动子的DNA作转染载体，在隐孢子虫体内进行外源基因的表达，包括用以隐孢子虫病毒RNA为载体和以DNA为载体的转染系统。
2、 一种以隐孢子虫病毒RNA为载体的转染系统，其特征在于分 别将含外源基因和多克隆酶切位点的基因替换隐孢子虫L-dsRNA或 S-dsRNA的部分编码区，并分别在5'外编码区前端加入T7启动子，后用 RNA聚合酶进行体外转录，后将其转录体电穿孔至隐孢子虫子孢子或卵 囊体内进行外源基因的表达。
3、 一种以DNA为载体的转染系统，其特征在于分别将装在质粒 载体上的隐孢子虫L,dsRNA或S-dsRNA病毒全长cDNA的5'外编码区 前连接隐孢子虫基因的启动子和信号肽基因，将含外源基因和多克隆酶切 位点的基因替换L,dsRNA或S-dsRNA的部分编码区，构建含外源基因的 重组质粒，然后分别将该质粒电穿孔至隐孢子虫体内表达外源基因。
全文摘要
本发明提供了一种以球虫类原虫——隐孢子虫病毒为转染载体和以DNA为转染载体的转染系统。利用隐孢子虫病毒RNA或含隐孢子虫的基因启动子的DNA作转染载体，在隐孢子虫体内进行外源基因的表达。包括用以隐孢子虫病毒RNA为载体和以DNA为载体的转染系统。球虫类原虫——隐孢子虫病毒基因组小、稳定、感染率高，每个细胞可达5×10<sup>3</sup>，而且隐孢子虫为真核生物，外源基因在隐孢子虫体内表达出的蛋白具有活性。该转染系统含有多克隆位点，为通用型转染载体，多种外源基因可在隐孢子虫体内表达，为研究球虫类原虫的分子生物学和细胞生物学提供了转染系统。
文档编号C12N15/09GK101235371SQ20071005637
公开日2008年8月6日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者于新友, 宫鹏涛, 张西臣, 李建华, 举 杨 申请人:吉林大学