专利名称：一种乙型肝炎病毒基因分型的方法
技术领域：
本发明涉及病毒鉴定，更具体涉及乙型肝炎病毒的基因分型。
技术背景一、乙型肝炎病毒(HBV)及MASA液相芯片技术乙型肝炎病毒(HBV)简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科。 根据目前所知，乙肝病毒只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完 整的乙肝病毒成颗粒状，直径为42纳米，是英国科学家Dane于1970年首先发 现，故又称Dane颗粒(丹氏颗粒)。Dane颗粒由外膜和内核两部分组成，外膜厚 7纳米，由蛋白质和膜脂质组成，称作乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。中心部分的 直径约28纳米，为病毒的核心，其中包括核心抗原(HBcAg),病毒基因组DNA 和合成病毒基因组的DNA多聚酶。乙肝病毒基因组编码四个基因，表面抗原基因 (S、 PreSl及PreS2基因)，DNA多聚酶基因(P基因)，X蛋白基因，核心抗原基 因(C及PreC基因)。根据乙肝病毒基因组变异性大于8%,乙肝病毒分为A H 八个基因型。这些基因型在全球有显著的地域分布。A型和D型主要分布在欧洲 和地中海地区，B型和C型主要分布在亚洲，E型主要分布在西非，F型和H型 主要分布在中美洲及南美洲，G型主要分布在美国。乙肝病毒感染是一个严重的公共卫生问题。全球60亿人口中，约20亿人曾 感染过乙肝病毒，其中3. 5 4亿人为慢性乙肝病毒感染，约占全球人口 6%。 在这3.5 4亿慢性乙肝病毒感染者中，约15% 25%最终将死于与乙肝病毒感 染相关的肝病。而我国属于高流行区，根据2002年全国乙型肝炎血清流行病学 调査表明，我国一般人群中HBsAg流行率为9.09X,估计约1.2 1.3亿人为慢 性乙肝病毒感染，占全世界慢性乙肝病毒感染者的1/3，全国每年死于与乙肝相关肝病约30万例。根据研究，不同的基因型将导致不同的临床结果。例如在亚洲，乙肝病毒基 因型以B和C为主，大量的研究发现，严重肝病的发生与基因型C的关系比基因 型B的关系更密切。因此，对病人体内的乙肝病毒进行基因分型，将有利于对 疾病的进程进行预测。此外，大范围的对乙肝病毒进行基因分型，可以用于研究 乙肝病毒的进化与发展。MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array,多功能悬浮点阵仪)技 术是美国纳斯达克市公司上研制出的新一代生物芯片技术平台。它是一个非常灵 活的多功能技术平台。其关键是把微小的乳胶颗粒(Beads,微球)分别染成不同 的荧光色，然后再把针对不同检测物的核酸或蛋白以共价方式结合到给定颜色的 微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入 被检测物(被检测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等，也可以时PCR产物)。 在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列 通过两束激光， 一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测 定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)。所得的数据经电脑处理后 可以直接用来判断结果。美国纳斯达克市公司生产的Luminex仪器可以读取由藻红蛋白标记的基因 产物的荧光强度。二、现有乙肝病毒基因分型方法及其不足之处1.基因序列测定法1.1全基因序列测定法是根据乙肝病毒基因组变异性大于8%进行分 型,Okamoto这种方法区分出A D型，E、 G、 F、 H也通过序列分析得以证实,初 步建立了基因分型体系，该方法直接可靠，但繁琐费时，不适宜广泛开展。1.2表面抗原基因(S基因)序列测定法Norder通过对乙肝病毒携带者S 基因序列测序结果分析，证实了 Okamoto的结果,还发现了两个新的基因型E、 F， 经证实，S基因序列分型最接近全基因组序列分型，初步简化了HBV基因分型方 法。但相对而言，该方法仍然比较繁琐费时。2. 聚合酶链反应一限制性酶长度多态性分析(PCR—RFLP): Lindh通过PCR 扩增出目标基因片段(通常为S基因或PreS/S基因)，然后用给定的限制性内切 酶进行酶切，根据酶切图谱进行基因分型。这种方法简明，但有时结果比较模糊， 甚至完全不能判断。3. 基因型特异性引物PCR法Naito等设计了A F六种基因型的型特异性 引物，并进行套式PCR，保证了同一基因型内核苷酸序列差异《2，不同基因型 间核苷酸序列差异^3,并使不同基因型扩增产物的相对分子质量不同，在电泳 后得出结果，可用于乙肝病毒感染的分子诊断和大范围调査。但是这种方法可能 会出现假阳性，而且无法区分基因型F和基因型H。4. 基因型特异性线性探针检测法目前有两种， 一种采用线性探针的反向 杂交，将PCR扩增的乙肝病毒基因片段与被膜上的特异性探针杂交,另一种为PCR 微板核酸杂交法,通过探针包被的微核板，PCR扩增产物与之杂交，从而确定基 因型。但这种方法特异性不高，且实现过程中可能会出现很多问题，例如杂交温 度难以控制。5. 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫荧光(ELISA)法Usuda等制备 前S2区域基因型特异性表位单克隆抗体，并用辣根过氧化物酶进行标记，对68 例乙肝病毒阳性携带者血清检测，该方法分型结果与S基因测序分型完全一致， 适用于大规模的流行病学调査，但单克隆抗体的制备比较复杂，而且费用昂贵。6. 基于荧光定量PCR(rea1-timePCR)的方法这种方法利用各种基因型特 异的引物和探针，进行荧光定量PCR，从而确定基因型。该方法比较灵敏，并 且可以同时对乙肝病毒进行定量，但在基因分型中，荧光定量PCR结果容易受 基因位点突变的影响而使得结果不确定。发明内容本发明的目的是，提供一种乙型肝炎病毒基因分型的方法。该方法基于 MASA液相芯片技术对乙肝病毒基因进行分型，主要根据乙肝病毒八种基因型 的特点设计基因型特异的引物及探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex 仪器进行检测，从而确定乙肝病毒属于八种基因型的哪一种。本发明的优点是操作简单、结果明确、假阳性少、费用较低，适合大范围的推广应用。 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案。一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，该方法按下列步骤顺序进行。a、 提取样品中的DNA;b、 以步骤a中提取的DNA为模板进行第一轮PCR，在PCR管中加入25uL 下列物质IOXPCR缓冲液2.5uL四种脱氧核糖核苷酸(dATP, dTTP， dGTP， dCTP): 0.5uL 浓度为20umol/L所有型引物F: 0. 25uL 浓度为20umol/L所有型引物R: 0. 25uL Taq (Thermus aquaticus，水生嗜热菌)DNA聚合酶0. 5uL DNA模板(template): 0. 5 5uL 余者为超纯水(ddH2'0); 其中所有型弓I物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT 所有型引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGc、 将PCR管放入PCR仪，条件如下cl、 94'C 5分钟 c2、 94。C 30秒 c3、 57 。C 30秒 c4、 72'C 30秒 c5、重复29次步骤c2 c4 c6、 72'C 15分钟 c7、降到4。C 得到第一轮PCR的产物为扩增的目标基因溶液；d、 以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR,在PCR管中再加入50uL 下列物质IOXPCR缓冲液5uL 四种脱氧核糖核苷酸luL 浓度为20umol/L第二轮PCR引物F: 0.5uL 浓度为20咖ol/L第二轮PCR引物R: 0.5uLTaqDNA聚合酶luL 扩增的目标基因溶液0.1~0.5uL 余者为超纯水；其中第二轮PCR引物F为TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二轮PCR引物R为生物素(biotin) -CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、 将PCR管放入PCR仪，条件如下el、 94°C 5分钟e2、 94。C 30秒e3、 60。C 30秒e4、 72°C 30秒e5、重复29次步骤e2 e4e6、 72。C 15分钟e7、将温度降到4'C; 这样就将生物素加到扩增的目标基因的一端，得到第二轮PCR的产物为带有生 物素标记的目标基因溶液；f、 把所有型探针以共价方式结合到给定颜色的微球(微小的乳胶颗粒)上， 用杂交缓冲液(1.5xTMAC，氯化四甲铵)稀释，使得每微升含有100个微球， 其中所有型探针的序列为NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG ;g、 在棕色容器中加入TE缓冲液(1XTE buffer, PH=8. 0): 12uL 带有生物素标记的目标基因溶液5uL微球33uL ;h、 将棕色容器置于94'C 5分钟，再移至57'C温育15分钟，然后移到冰上， 加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57'C温育5分钟，得到荧光标记的目标基 因与探针结合的产物；i、 用Luminex仪器读取给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合 的产物的荧光检测值；j、当荧光检测值〈100时，说明样品中基本不含乙肝病毒DNA,停止检测； k、当100《荧光检测值<200时，样品中是否含乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值》200时，确定样品中含有乙肝病毒DNA;对这两种情况都用下列步骤作进一步的检测；1、分别用八种基因型的第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R，以步骤a 中提取的DNA为模板分别进行第一轮PCR，各引物对序列如下 基因型A引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG 基因型A引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT 基因型D引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAACAA 基因型D引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG 基因型G引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT 基因型G引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCC m、在PCR管中加入25uL下列物质IOXPCR缓冲液2.5uL四种脱氧核糖核苷酸0.5uL浓度为20umol/L第一轮PCR引物F: 0. 25uL浓度为20umol/L第一轮PCR引物R: 0.25uLTaqDNA聚合酶0.5uLDNA模板0.5 5uL余者为超纯水； n、将PCR管放入PCR仪，条件如下cl、 94'C 5分钟c2、 94。C 30秒c3、 57 。C 30秒c4、 72 。C 30秒c5、重复29次步骤c2 c4c6、 72°C 15分钟c7、降到4'C 得到第一轮PCR的产物为扩增的目标基因溶液；o、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR,在PCR管中再加入50uL 下列物质IOXPCR缓冲液5uL 四种脱氧核糖核苷酸luL浓度为20umol/L第二轮PCR引物F: 0.5uL 浓度为20umol/L第二轮PCR引物R: 0. 5uL Taq DNA聚合酶luL 扩增的目标基因溶液0.1~0.5uL 余者为超纯水；其中第二轮PCR引物F为TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二轮PCR引物R为生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG p、将PCR管放入PCR仪，条件如下 el、 94'C 5分钟 e2、 94 °C 30秒 e3、 60°C 30秒 e4、 72'C 30秒 e5、重复29次步骤e2 e4 e6、 72°C 15分钟 e7、将温度降到4'C; 得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液q、把与步骤n相同基因型的探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用 杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；八种基因型的探针序列如下 基因型A探针NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC 基因型B探针NH2-TTTnTTTTnTGGGCAGGTTCCIGTGGGC 基因型C探针NH2-TTTTTTnTnTRGGCAAGACCTGGYGGGC 基因型D探针NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC 基因型E探针NH2-TTTTTTTTTTCCTTGGGCAAGATTTGGTGGG 基因型F探针NH2-TTTTTTTTTTTGTTGGCAAACTCCAGGGGGC 基因型G探针NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTC 基因型H探针NH2-TTTTTTTTmTGTTGGCAAGTTCCAAGGGGC r、在棕色容器中加入TE缓冲液12uL带有生物素标记的目标基因溶液5uL微球33uLs、将棕色容器置于94'C 5分钟，再移至57'C温育15分钟，然后移到冰上， 加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57'C温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；t、用Luminex仪器分别读取八种给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与 探针结合的产物的荧光检测值；u、当荧光标记的目标基因与探针结合的产物是由步骤m所使用引物及步骤 q所使用探针的基因型得到，则当该荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧 光检测值<100时，说明样品中基本不含该基因型的乙肝病毒DNA;v、当100《该荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值〈200时， 样品中是否含该基因型的乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值^200时，确定 样品中含有该基因型的乙肝病毒DNA。因为有些样品中含有一种以上的基因型乙肝病毒DNA,因此，即使已检测到某一种基因型乙肝病毒DNA,还需要检测其是否还含有其它基因型的乙肝病 毒DNA。与现有技术相比，本发明具有操作简单，特异性髙，假阳性少，灵敏度高， 结果用数字表示，非常明确，对目前已知的所有8种基因型乙肝病毒都可进行明 确的区分，且费用较低，适合大范围的推广应用。
具体实施例方式实施例1已知样品中含有基因型A乙型肝炎病毒，按本发明的基因分型的方法进行 检测，具体步骤如下a、 提取样品中的DNA;b、 以步骤a中提取的DNA为模板进行第-下列物质IOXPCR缓冲液2.5uL 四种脱氧核糖核苷酸0.5uL 浓度为20umol/L所有型引物F: 浓度为20umol/L所有型引物R: TaqDNA聚合酶0.5uL-轮PCR,在PCR管中加入25uL0. 25uL 0. 25uLDNA模板0.5 5uL 余者为超纯水；其中所有型引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT 所有型引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGc、 将PCR管放入PCR仪，条件如下cl、 94°C 5分钟 c2、 94'C 30秒 c3、 57'C 30秒 c4、 72°C 30秒 c5、重复29次步骤c2 c4 c6、 72'C 15分钟 c7、降到4'C 得到第一轮PCR的产物为扩增的目标基因溶液；d、 以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL 下列物质-IOXPCR缓冲液5uL 四种脱氧核糖核苷酸luL 浓度为20umol/L第二轮PCR引物F: 0.5uL 浓度为20umol/L第二轮PCR引物R: 0.5uL TaqDNA聚合酶luL 扩增的目标基因溶液0.1 0. 5uL 余者为超纯水；其中第二轮PCR弓I物F为TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二轮PCR引物R为生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、 将PCR管放入PCR仪，条件如下el、 94°C 5分钟e2、 94'C 30秒e3、 60。C 30秒e4、 72 。C 30秒e5、重复29次步骤e2 e4e6、 72'C 15分钟e7、将温度降到4'C; 这样就将生物素加到扩增的目标基因的一端，得到第二轮PCR的产物为带有生 物素标记的目标基因溶液；f、 把所有型探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释， 使得每微升含有100个微球，其中所有型探针的序列为NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG ;g、 在棕色容器中加入TE缓冲液12uL带有生物素标记的目标基因溶液5uL 微球33uL ;h、 将棕色容器置于94°C 5分钟，再移至57'C温育15分钟，然后移到冰上， 加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57'C温育5分钟，得到荧光标记的目标基 因与探针结合的产物；i、 用Luminex仪器读取给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合 的产物的荧光检测值；j、荧光检测值为732.2,大于200，确定样品中含有乙肝病毒DNA;用下 列步骤作进一步的检测；k、分别用八种基因型的第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R,以步骤a 中提取的DNA为模板分别进行第一轮PCR，各引物对序列如下 基因型A引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG 基因型A引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT 基因型D引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAAC A A 基因型D引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG 基因型G引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT 基因型G引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCC1、在PCR管中加入25uL下列物质 IOXPCR缓冲液2.5uL四种脱氧核糖核苷酸0.5uL浓度为20umol/L所有型引物F: 0. 25uL浓度为20umol/L所有型引物R: 0. 25uLTaqDNA聚合酶0.5uLDNA模板0. 5 5uL余者为超纯水； m、将PCR管放入PCR仪，条件如下cl、 94°C 5分钟c2、 94。C 30秒c3、 57。C 30秒c4、 72'C 30秒c5、重复29次步骤c2 c4c6、 72°C 15分钟c7、降到4。C 得到第一轮PCR的产物为扩增的目标基因溶液；n、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL 下列物质IOXPCR缓冲液5uL 四种脱氧核糖核苷酸luL 浓度为20umol/L第二轮PCR引物F: 0.5uL 浓度为20umol/L第二轮PCR引物R: 0.5uL TaqDNA聚合酶luL 扩增的目标基因溶液0.1 0.5uL 余者为超纯水；其中第二轮PCR引物F为TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二轮PCR引物R为生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG o、将PCR管放入PCR仪，条件如下-el、 94°C 5分钟 e2、 94 。C 30秒 e3、 60°C 30秒 e4、 72。C 30秒e5、重复29次步骤e2 e4e6、 72°C 15分钟e7、将温度降到4'C; 得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液；p、把与步骤n相同基因型的探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用 杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；八种基因型的探针序列如下 基因型A探针NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC基因型C探针NH2-TTTTTTTTTTTTRGGCAAGACCTGGYGGGC 基因型D探针NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC基因型G探针NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTCq、在棕色容器中加入TE缓冲液12uL带有生物素标记的目标基因溶液5uL 微球33uLr、将棕色容器置于94'C 5分钟，再移至57'C温育15分钟，然后移到冰上， 加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57'C温育5分钟，得到荧光标记的目标基 因与探针结合的产物；s、用Luminex仪器分别读取八种给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与 探针结合的产物的荧光检测值；t、荧光检测值的结果为当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型A引物F及基 因型A引物R，步骤p的探针为基因型A探针时，荧光检测值为1197.2,确认 样品含有基因型A乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型B引物F及基 因型B引物R，步骤p的探针为基因型B探针时，荧光检测值为53.5,确认样 品不含基因型B乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型C引物F及基因型C引物R，步骤p的探针为基因型C探针时，荧光检测值为57.8,确认样 品不含基因型C乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型D引物F及基 因型D引物R,步骤p的探针为基因型D探针时，荧光检测值为81.4,确认样 品不含基因型D乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型E引物F及基 因型E引物R，步骤p的探针为基因型E探针时，荧光检测值为40.1,确认样 品不含基因型E乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型F引物F及基 因型F引物R，步骤p的探针为基因型F探针时，荧光检测值为42.6,确认样 品不含基因型F乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型G引物F及基 因型G引物R,步骤p的探针为基因型G探针时，荧光检测值为25.6,确认样 品不含基因型G乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型H引物F及基 因型H引物R,步骤p的探针为基因型H探针时，荧光检测值为47.4,确认样 品不含基因型H乙型肝炎病毒。该检测结果与样品己知的结果完全一致。实施例2已知样品中含有基因型B乙型肝炎病毒，按本发明的基因分型的方法进行 检测，具体步骤与实施例l相同，荧光检测值的结果为当引物F及引物R为所有型引物F及所有型引物R，探针为所有型探针时， 荧光检测值为649. 5,确认样品含有乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型A引物F及基 因型A引物R，步骤p的探针为基因型A探针时，荧光检测值为59.2,确认样 品不含基因型A乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型B引物F及基 因型B引物R，步骤p的探针为基因型B探针时，荧光检测值为1101.3,确认 样品含有基因型B乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型C引物F及基因型C引物R,步骤p的探针为基因型C探针时，荧光检测值为43.7,确认样 品不含基因型C乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型D引物F及基 因型D引物R,步骤p的探针为基因型D探针时，荧光检测值为46.4，确认样 品不含基因型D乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型E引物F及基 因型E引物R，步骤p的探针为基因型E探针时，荧光检测值为40.9,确认样 品不含基因型E乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型F引物F及基 因型F引物R，步骤p的探针为基因型F探针时，荧光检测值为50.8,确认样 品不含基因型F乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型G引物F及基 因型G引物R，步骤p的探针为基因型G探针时，荧光检测值为40.3,确认样 品不含基因型G乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型H引物F及基 因型H引物R,步骤p的探针为基因型H探针时，荧光检测值为44.1,确认样 品不含基因型H乙型肝炎病毒。该检测结果与样品已知的结果完全一致实施例3已知样品中含有基因型C乙型肝炎病毒，按本发明的基因分型的方法进行 检测，具体步骤与实施例l相同，荧光检测值的结果为当引物F及引物R为所有型引物F及所有型引物R,探针为所有型探针时， 荧光检测值为583.6,确认样品含有乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型A引物F及基 因型A引物R，步骤p的探针为基因型A探针时，荧光检测值为57.4，确认样 品不含基因型A乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型B引物F及基 因型B引物R，步骤p的探针为基因型B探针时，荧光检测值为51.3,确认样 品不含基因型B乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型C引物F及基因型C引物R，步骤p的探针为基因型C探针时，荧光检测值为733. 5，确认样 品含有基因型C乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型D引物F及基 因型D引物R,步骤p的探针为基因型D探针时，荧光检测值为41.7，确认样 品不含基因型D乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型E引物F及基 因型E引物R，步骤p的探针为基因型E探针时，荧光检测值为58.2,确认样 品不含基因型E乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型F引物F及基 因型F引物R，步骤p的探针为基因型F探针时，荧光检测值为30.7,确认样 品不含基因型F乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型G引物F及基 因型G引物R,步骤p的探针为基因型G探针时，荧光检测值为33.8,确认样 品不含基因型G乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型H引物F及基 因型H引物R，步骤p的探针为基因型H探针时，荧光检测值为51.5,确认样 品不含基因型H乙型肝炎病毒。该检测结果与样品己知的结果完全一致实施例4已知样品中含有基因型D乙型肝炎病毒，按本发明的基因分型的方法进行 检测，具体步骤与实施例l相同，荧光检测值的结果为当引物F及引物R为所有型引物F及所有型引物R,探针为所有型探针时， 荧光检测值为781. 0,确认样品含有乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型A引物F及基 因型A引物R,步骤p的探针为基因型A探针时，荧光检测值为59.3,确认样 品不含基因型A乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型B引物F及基 因型B引物R,步骤p的探针为基因型B探针时，荧光检测值为55.1,确认样 品不含基因型B乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型C引物F及基因型C引物R，步骤p的探针为基因型C探针时，荧光检测值为40.4,确认样品不含基因型C乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型D引物F及基 因型D引物R，步骤p的探针为基因型D探针时，荧光检测值为1063.8，确认 样品含有基因型D乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型E引物F及基 因型E引物R,步骤p的探针为基因型E探针时，荧光检测值为74.6,确认样 品不含基因型E乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型F引物F及基 因型F引物R，步骤p的探针为基因型F探针时，荧光检测值为37.4，确认样 品不含基因型F乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型G引物F及基 因型G引物R，步骤p的探针为基因型G探针时，荧光检测值为30.7,确认样 品不含基因型G乙型肝炎病毒；当步骤1第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为基因型H引物F及基 因型H引物R,步骤p的探针为基因型H探针时，荧光检测值为30.9,确认样 品不含基因型H乙型肝炎病毒。该检测结果与样品已知的结果完全一致由于待测样品可能含有多种基因型乙肝病毒DNA,因此，即使已检测到某 一种基因型乙肝病毒DNA，还需要检测其是否还含有其它基因型的乙肝病毒 DNA,即要完整地做完实施例l中的所有步骤，除非已确认样品不含乙肝病毒 DNA。
权利要求
1、一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行a、提取样品中的DNA；b、以步骤a中提取的DNA为模板进行第一轮PCR，在PCR管中加入25uL下列物质10×PCR缓冲液2.5uL四种脱氧核糖核苷酸0.5uL浓度为20umol/L所有型引物F0.25uL浓度为20umol/L所有型引物R0.25uLTaqDNA聚合酶0.5uLDNA模板0.5～5uL余者为超纯水；其中所有型引物F为CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT 所有型引物R为TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGC、将PCR管放入PCR仪，条件如下c1、94℃5分钟c2、94℃30秒c3、57℃30秒c4、72℃30秒c5、重复29次步骤c2～c4c6、72℃15分钟c7、降到4℃得到扩增的目标基因溶液；d、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL下列物质10×PCR缓冲液5uL四种脱氧核糖核苷酸1uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物F0.5uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物R0.5uLTaq DNA聚合酶1uL扩增的目标基因溶液0.1～0.5uL余者为超纯水；其中第二轮PCR引物F为TACAGTCGGTCGCGTGCCTC 第二轮PCR引物R为生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、将PCR管放入PCR仪，条件如下e1、94℃5分钟e2、94℃30秒e3、60℃30秒e4、72℃30秒e5、重复29次步骤e2～e4e6、72℃15分钟e7、将温度降到4℃得到带有生物素标记的目标基因溶液；f、把所有型探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球，其中所有型探针的序列为NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG；g、在棕色容器中加入TE缓冲液12uL带有生物素标记的目标基因溶液5uL微球33uL；h、将棕色容器置于94℃5分钟，再移至57℃温育15分钟，然后移到冰上，加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57℃温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；i、用Luminex仪器读取给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；j、当荧光检测值＜100时，说明样品中基本不含乙肝病毒DNA，停止检测；k、当100≤荧光检测值＜200时，样品中是否含乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值≥200时，确定样品中含有乙肝病毒DNA；对这两种情况都用下列步骤作进一步的检测；l、分别用八种基因型的第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R，以步骤a中的提取的DNA为模板分别进行第一轮PCR，八种基因型的引物序列如下基因型A引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG基因型A引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT基因型D引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAACAA基因型D引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG基因型G引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT基因型G引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT基因型B引物F、基因型C引物F、基因型E引物F、基因型F引物F、基因型H引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT基因型B引物R、基因型C引物R、基因型E引物R、基因型F引物R、基因型H引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCCm、在PCR管中加入25uL下列物质10×PCR缓冲液2.5uL四种脱氧核糖核苷酸0.5uL浓度为20umol/L所有型引物F0.25uL浓度为20umol/L所有型引物R0.25uLTaq DNA聚合酶0.5uLDNA模板0.5～5uL余者为超纯水；n、将PCR管放入PCR仪，条件如下c1、94℃5分钟c2、94℃30秒c3、57℃30秒c4、72℃30秒c5、重复29次步骤c2～c4c6、72℃15分钟c7、降到4℃得到扩增的目标基因溶液；o、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中再加入50uL下列物质10×PCR缓冲液5uL四种脱氧核糖核苷酸1uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物F0.5uL浓度为20umol/L第二轮PCR引物R0.5uLTaq DNA聚合酶1uL扩增的目标基因溶液0.1～0.5uL余者为超纯水；其中第二轮PCR引物F为TACAGTCGGTCGCGTGCCTC 第二轮PCR引物R为生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGp、将PCR管放入PCR仪，条件如下e1、94℃5分钟e2、94℃30秒e3、60℃30秒e4、72℃30秒e5、重复29次步骤e2～e4e6、72℃15分钟e7、将温度降到4℃；得到带有生物素标记的目标基因溶液；q、把与步骤n相同基因型的探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；八种基因型的探针序列如下基因型A探针NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC基因型B探针NH2-TTTTTTTTTTTTGGGCAGGTTCCIGTGGGC基因型C探针NH2-TTTTTTTTTTTTRGGCAAGACCTGGYGGGC基因型D探针NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC基因型E探针NH2-TTTTTTTTTTCCTTGGGCAAGATTTGGTGGG基因型F探针NH2-TTTTTTTTTTTGTTGGCAAACTCCAGGGGGC基因型G探针NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTC基因型H探针NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGGCAAGTTCCAAGGGGCr、在棕色容器中加入TE缓冲液12uL带有生物素标记的目标基因溶液5uL微球33uLs、将棕色容器置于94℃5分钟，再移至57℃温育15分钟，然后移到冰上，加入10uL荧光染料藻红蛋白，再移到57℃温育5分钟，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；t、用Luminex仪器分别读取八种给定颜色微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；u、当目标基因荧光标记是由步骤m所使用引物及步骤q所使用探针的基因型得到，则当该目标基因荧光标记的荧光检测值＜100时，说明样品中基本不含该基因型的乙肝病毒DNA；v、当100≤该目标基因荧光标记的荧光检测值＜200时，样品中是否含该基因型的乙肝病毒DNA不确定；当荧光检测值≥200时，确定样品中含有该基因型的乙肝病毒DNA。
全文摘要
本发明公开了一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，涉及病毒分类。该方法基于MASA液相芯片技术对乙肝病毒基因进行分型，主要根据乙肝病毒八种基因型的特点设计基因型特异的引物及探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex仪器进行检测，根据检测值的大小来确定乙肝病毒属于八种基因型的哪一种。对病人体内的乙肝病毒进行基因分型，将有利于对疾病的进程进行预测，也可用于研究乙肝病毒的进化与发展。与现有技术相比，本发明具有操作简单，特异性高，假阳性少，灵敏度高，结果明确，对目前已知的所有8种基因型乙肝病毒都可进行明确的区分，且费用较低，适合大范围的推广应用。
文档编号C12Q1/70GK101402993SQ20071005376
公开日2009年4月8日 申请日期2007年11月5日 优先权日2007年11月5日
发明者丘志娟, 王华林, 胡志红, 丽 袁, 菲 邓 申请人:中国科学院武汉病毒研究所