专利名称：：一种荧光标记探针的pcr-ldr基因多态性检测测序方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术，具体涉及一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法。
背景技术：
：随着人类药物基因组学的发展，越来越多的研究成果将运用于临床诊断中，这就要求有大规模的基因多态性位点检测方法。近年来，将连接反应用于检测基因多态性位点越来越引起人们的重视，学者们已经做了大量的研究(FranceBaranyetal.，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA,88:189-93(1991)，TheLigaseChainReaction(LCR)inaPCR^World,PCRMethodsandApplications,1:5-16(1991))。连接酶链式反应(ligasechainreaction,LCR)是指在反应中设计两对探针，使连接反应可以指数扩增模板。连接酶检测反应(ligasedetectionreaction,LDR)是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。目前，出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术、测序技术关联用于基因多态性位点检测(NormanP.Gerry1etal.，J.Mol.Biol.(1999)292,251-262，U.S.Pat-Pub.No.2003/0032016A1),这些技术的出现大大方便了基因位点的检测，但在这些技术中，需要大量的荧光标记的探针，而这些标记的探针成本昂贵，为开发和应用造成不便，因而，限制了它们的应用。
发明内容本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计简便的PCR-LDR基因多态性测序检测方法。本发明提供了一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序检测方法。由于基因多态性包括单位点基因突变、基因缺失、插入以及微卫星等多种情况，本发明所述的基因多态性位点检测主要是针对基因单位点突变，即单碱基突变、插入和缺失，并且在突变位点周围大约20个碱基内没有其他单位点突变。利用本发明提供的一种荧光标记探针，在PCR和LDR关联利用测序仪进行基因多态性位点检测时，针对每一个突变位点，涉及到二种探针第一种探针是标记探针，包含三个部分，其中一部分为和模板配对部分，另一部分为和连接模板配对部分，同时在两部分序列中引入随机探针来调整探针的长度；第二种探针为检测探针，包含两个部分，其中一部分为和模板配对部分，另一部分则引入随机序列来调整LDR产物的长度。其中第二种探针，可以是两根也可以是三根或者四根，探针中3'端为检测位点。每组针对核酸单碱基变化的检测探针，通过设定检测探针的长度，实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。本发明主要是针对第一种标记探针进行改造，首先弓1入一个通用荧光标记探针和一个通用模板，通用模板部分的5'序列和通用荧光标记探针序列互补，而在上述第一种标记探针中也有部分序列是和通用模板互补的序列，在LDR过程中，通过通用模板的互补配对，实现通用荧光标记探针和标记探针的连接，实现对标记探针的标记。LDR反应结束后，将LDR产物放入测序仪，利用测序仪的genescan功能，通过结果中已知分子量的一系列内参来确认不同LDR产物的长度，从而判读位点的多态性。本发明PCR-LDR关联的单位点多态性测序检测，经过适当调整，也可以用于HPLC和微流芯片等高分辨率的核酸分离检测系统。具体的说，本发明方法包括以下步骤1.探针设计(1)针对检测的位点，设计一系列LDR产物的分子量系列，LDR产物的差异可从一个碱基到几百个碱基；(2)设计一个专有荧光标记探针，该探针具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；(3)设计一个专有模板，该模板具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；(4)在要检测的突变位点的前后各设计10-25碱基长度的检测探针和标记探针，检测探针的检测位点设计在3'端；(5)在标记探针的3'端引入模板配对序列和随机序列，以及检测探针5'端引入随机序列(与PCR产物的序列没有同源性的任何序列)，一般标记探针和检测探针具有相近的分子量。2.PCR取待检测的DNAlpl(5ng/|il)以上，PCR引物各10-30pmol，高温聚合酶，高温聚合酶的相应混合液，相互混合。PCR反应条件为94°C30秒，40-68°C30秒-2分钟，60-72°C45秒國2分钟，循环25-40次。3.LDR取PCR产物lpl，探针各40fmol-10pmo1，连接酶，相应的连接酶缓冲液，相互混合。LDR反应条件为94°C30秒，40-70°C1-10分钟(以45-60。C为最好)，循环l-40次。4.结果检测取LDR产物l-5pl，混合测序系统的loadingbuffer,测序仪上样，进行LDR产物分离鉴定。步骤(一)(3)在标记探针的3'端引入模板配对序列和随机序列以及检测探针5'端引入随机序列，所述随机序列为与PCR产物的序列没有同源性的任何序列。步骤(一)(4)在要检测的突变位点的前后各设计10-25碱基长度的检测探针和标记探针，标记探针检测位点设计在3，端，检测探针的检测位点设计在5'端。标记探针和检测探针具有相近的分子量。(一)(4)所述一般标记探针包含三个部分，第一部分为和目的模板配对部分，第二部分为和连接模板配对部分，第三部分为同时在第一和第二部分序列中引入的随机序列，用来调整探针的长度，长度为40-80bp;所述检测探针包含两个部分，第一部分为和目的模板配对部分，第二部分为引入的随机序列，用来调整LDR产物的长度，长度为40-80bp;检测探针可以是两根、三根或四根，探针中3'端为检测位点，每组针对核酸单碱基变化的检测探针，通过设定检测探针的长度，实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。本发明有以下效果1.由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性问题。2.测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测，而芯片技术则无法同时进行多样本的检测。3.位点的高通量，利用测序仪的5色荧光检测系统，同时利用4种荧光，测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测。大大加速检测的速度。4.与现有基因多态性位点检测及测序技术相比，大幅降低了应用成本，并且检测结果正确。图l-2是HBV1896突变检测结果图。图1的结果表示只有82bp的连接产物，即只有HBV1896的野生型。图2的结果表示有82bp和87bp的连接产物，既有HBV1896野生型也有HBV1896突变型。图3-4表示HBV1896和HBV的YIDD/YVDD的联合检测结果。图3有82bp和92bp两个连接产物，表示HBV1896检测结果是只有野生型产物，HBV的YIDD/YVDD检测结果是只有YIDD产物。图4有82bp、92bp和97bp的连接产物，表示HBV1896检测结果只有野生型产物，HBV的YIDD/YVDD的检测结果是既有YIDD产物也有YVDD突变产物。图5-7表示对5个SNP位点rs4652678、rsl99930、rs7043268、rs6424820和rs4133072进行联合检测的结果。图5的结果表示rs4652678有82bp和87bp两个连接产物，是杂合子C/T;rsl99930有92bp的连接产物，是纯合子C;rs7043268有102bp和107bp两个连接产物，是杂合子G/A;rs6424820有112bp和117bp两个连接产物，是杂合子C/G;rs4133072有122bp的连接产物，是纯合子A。图6的结果表示rs4652678有82bp连接产物，是纯合子C;rsl99930有92bp的连接产物，是纯合子C;rs7043268有107bp连接产物，是纯合子A;rs6424820有117bp连接产物，是纯合子G;rs4133072有122bp的连接产物，是纯合子A。图7的结果表示rs4652678有82bp和87bp两个连接产物，是杂合子C/T;rsl99930有92bp的连接产物，是纯合子C;rs7043268有102bp连接产物，是纯合子G;rs6424820有112bp连接产物，是纯合子C;rs4133072有122bp的连接产物，是纯合子A。图8-10表示6个SNP位点rs348475、rs499776、rs2161811、rs561712、rs4646580和rs4646642联合检测的结果。图8的结果表示rs348475有82bp和85bp两个连接产物，是杂合子A/G;rs499776有91bp的连接产物，是纯合子G;rs2161811有94bp连接产物，是纯合子A;rs561712有100bp连接产物，是纯合子A;rs4646580有106bp和109bp两个连接产物，是杂合子C/T;rs4646642有112bp和115bp两个连接产物，是杂合子C/T。图9的结果表示rs348475有82bp和85bp两个连接产物，是杂合子A/G;rs499776有88bp和91bp的连接产物，是杂合子A/G;rs2161811有94bp连接产物，是纯合子A;rs561712有100bp和103bp两个连接产物，是杂合子A/G;rs4646580有106bp和109bp两个连接产物，是杂合子C/T;rs4646642有112bp和115bp两个连接产物，是杂合子C/T。图10的结果表示rs348475有85bp连接产物，是纯合子A/G;rs499776有91bp连接产物，是纯合子G;rs2161811有94bp连接产物，是纯合子A;rs561712有100bp连接产物，是纯合子A;rs4646580有109bp连接产物，是纯合子T;rs4646642有115bp的连接产物，是纯合子T。具体实施方式下面结合本专利实施例及其附图对本发明做进一步的说明。实施例一对单位点突变的DNA多态性进行检测以乙型肝炎病毒(HBV)DNA1896位点突变举例，突变位点间隔是5个碱基。HBV1896位点附近序列为<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反应混合液为200pMdATP，200|liMdTTP，200|aMdCTP，200pMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，lpl基因组模板(浓度大于5ng^1)。反应条件为94"30秒，60°C30秒，72"45秒，循环30次。3.LDR反应反应混合液为20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探针各0.01pM，Taq连接酶15U，l^ilPCR模板DNA。反应条件为94°C30秒，60°C2分钟，循环30次。4.上测序仪器进行检测结果见图，图1显示只有1896G野生型病毒株，图2显示不仅有1896G野生型病毒株，还有1896A突变型病毒株。实施例二对两个点突变的DNA多态性进行检测以HBV1896位点和YIDD/YMDD突变为例对单位点DNA多态性进行检测，每个突变位点间隔是5个碱基。HBV1896突变5，GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3，HBV的YIDD/YMDD突变5，CTGTCTGGCTTTCAGTTATATG/TGATGATGTGGTATTGGGGG3'1.引物和探针设计(1)普通PCR引物设计<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>下游引物ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG30HBVYIDD/YMDD弓1物序列(5'—3')长度(nt)上游引物CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC30下游引物GG(CT)A(AT)AAAGGGACTCA(AC)GATG30(2)荧光标记探针GCATCACTCAGAGGG模板CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG荧光标记探针要进行5，磷酸化和3'探针标记(本例用FAM)。(3)标记探针探针名称HBV1896(G/A)标记探针序列(5'—3')长度(nt)和模板配对部分AAAGCCACCCAAGGCACA18和通用模板配对部分CGCAAACCTGTACTC15随机序列ACCTACCT8探针总序列*AAAGCCACCCAAGGCACAACCTACCTCGCAAACCTGTACTC41探针名称HBVYIDD/YMDD(G/T)标记探针序列(5'^3')长度(nt)和模板配对部分ATATAACTGAAAGCCAAACAG22和通用模板配对部分CGCAAACCTGTACTC15随机序列ACCTACCTA9探针总序列*ATATAACTGAAAGCCAAACAGACCTACCTACGCAAACCTGTACTC46注*表示探针要进行5'磷酸化(4)检测探针一探针名称HBV1896—G探针序列(5，~3')长度(nt)和模板配对部分GGTCAATGTCCATGCCCC19随机序列ACCTACCTACCTACCTACCTA22探针总序列GGTCAATGTCCATGCCCCACCTACCTACCTACCTACCTAC41探针名称HBVYIDD/YMDD—G探针序列(5'—3')长度(nt)和模板配对部分GCCCCCAATACCACATCATCC22随机序列ACCTACCTACCTACCTACCTACC24探针总序列ACCTACCTACCTACCTACCTACCGCCCCCAATACCACATCATCC4613(5)检测探针二<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.PCR反应反应混合液为200|iMdATP，200pMdTTP，200|aMdCTP，200|iMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，基因组模板(浓度大于5ng/nl)。反应条件为94°C30秒，60°C30秒，72°C45秒，循环30次。3.LDR反应反应混合液为20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探针各0.01iiM，Taq连接酶15U，PCR模板DNA。反应条件为94"C30秒，6(TC2分钟，循环30次。4.上测序仪器进行检测结果见图3-4。实施例三对人基因组多个位点(SNP)同时进行多态性检测同时对5个SNP位点(rs4652678、rsl99930、rs7043268、rs6424820和rs4133072)进行SNP分型，每个SNP突变位点间隔是5个碱基。1.引物和探针设计(1)普通PCR引物设计rs4652678引物序列(5，43，)长度(nt)上游引物CTTCTGTAGAATGAGGTATAGTGAGGAGGC30下游引物GTCAGCAGAGCCCAGATAATGTTGTCGTAG30rsl99930引物序列(5，~>3，)长度(nt)上游引物GAGGGCTGGCAGGAGATTATGCTGTCATGC30下游引物GGTAAAAGCACAATGTTGCTCACCAAGAAG30rs7043268引物序列(5'—3')长度(nt)上游引物CTCTGGATTTGACATTGCTTTTCAGGAGTG30下游引物TTAGTGAGAGGGATCAGGAAACCAAGGAAG30rs6424820引物序列(5'卄3，)长度(nt)上游引物AGGACGGGACCTGATGTAGTGTGAACAGTC30下游引物ACCTCCTCCCACACTGGCACCAACACACCA30rs4133072引物序列(5，—3，)长度(nt)上游引物AAGAACTGTAACAACAAAGCAGCAATATGA30下游引物CGATGGAAAATGTTTTACAAAATGGAAGAC30(2)荧光标记探针GCATCACTCAGAGGG模板CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG荧光标记探针要进行5'磷酸化和3'探针标记(本例用FAM)。(3)标记探针探针名称rs4652678(C/T)标记探针序列(5，~>3，)长度(nt)和模板配对部分CTACATAGTTGCCTCTAAAAC20和通用模板配对部分CGCAAACCTGTACTC15随机序列GTACGT6探针总序列*CTACATAGTTGCCTCTAAAACGTACGTCGCAAACCTGTACTC41探针名称rsl99930(C/T)标记探针序列(5'—3')长度(nt)和模板配对部分TTCTCGTTCTGCCCTGATGGTGCGG25和通用模板配对部分CGCAAACCTGTACTC15随机序列GTACGT6探针总序列*TTCTCGTTCTGCCCTGATGGTGCGGGTACGTCGCAAACCTGTAC46<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注*表示探针要进行5'磷酸化(4)检测探针一<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>TCAATATGTACTTC探针名称rs4133072—G探针序列(5，—3，)长度(nt)和模板配对部分TCAACTACAGTATCTAGAACAGTGAC25随机序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACG41探针总序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTCAACTACAGTATCTAGAACAGTGAC662.PCR反应反应混合液为200^iMdATP，200jiMdTTP，200|liMdCTP，200|iMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，基因组模板(浓度大于5ng/pl)。反应条件为94°C30秒，56°C30秒，72'C45秒，循环30次。3.LDR反应反应混合液为20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探针各0.01fxM，Taq连接酶15U，PCR模板DNA。反应条件为9fC30秒，60'C2分钟，循环30次。4.上测序仪器进行检测结果如下表:rs4652678(C/T)rsl99930(C/T)rs7043268(G/A)rs6424820(C/G)rs4133072(A/G)图5C/TcG/AC/GA图6CcAGA图7C/TcGCA实施例四对人基因组多个位点(SNP)同时进行多态性检测同时对6个SNP位点(rs348475、rs499776、rs4646642、rs2161811、18rs561712和rs4646580)进行SNP分型，每个SNP突变位点间隔调整为3个碱基。1.引物和探针设计(1)普通PCR引物设计<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(2)荧光标记探针GCATCACTCAGAGGG模板CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG荧光标记探针要进行5'磷酸化和3'探针标记(本例用FAM)。(3)标记探针<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>探针名称rs348475—G探针序列(5'—3')长度(nt)和模板配对部分GTGTTCCTATAATATATTAATATAC25随机序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTC19探针总序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTGTTCCTATAATATATTAATATAC44探针名称rs499776_G探针序列(5，—3，)长度(nt)和模板配对部分CATGCCTTTGACCCCCACACAGC25随机序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT22探针总序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCATGCCTTTGACCCCCACACAGC47探针名称rs21618U—G探针序列(5，—3，)长度(nt)和模板配对部分CAGACAGGAAGCCAAACACAAAGGC25随机序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGT25探针总序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTCAGACAGGAAGCCAAACACAAAGGC50探针名称rs561712—G探针序列(5'~>3')长度(nt)和模板配对部分GATTACAGGCATTTCCCAAGTCAAC25随机序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCG28探针总序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGGATTACAGGCATTTCCCAAGTCAAC53探针名称rs4646580—T探针序列(5，~>3，)和模板配对部分CTCAGAAGATTATCTGATACCCCGA25随机序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTC31探针总序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCCTCAGAAGATTATCTGATACCCCGA56探针名称rs4646642—T探针序列(5，~3，)长度(nt)和模板配对部分GATAATTTGGCTTTACAACCTTGA25随机序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT34探针总序列TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTGATAATTTGGCTTTACAACCTTGA592.PCR反应反应混合液为200(iMdATP，200pMdTTP，200|iMdCTP，200pMdGTP，2mMMgCl2，2UTaqDNA聚合酶，各lpM的上下游引物，221^1基因组模板(浓度大于5ng/|nl)。反应条件为94°C30秒，62°C30秒，72'C45秒，循环30次。3.LDR反应反应混合液为20mMTris-HCl，pH8.3(at25。C)，50mMKCl，10mMMgCl2，lmMEDTA，lmMNAD+，10mMDTT，0.1%(v/v)TritonX-IOO，探針各0.01iliM，Taq连接酶15U，l|ulPCR模板DNA。反应条件为94'C30秒，6(TC2分钟，循环30次。4.上测序仪器进行检测结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>权利要求1、一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法，其特征在于该方法包括以下步骤(一)探针设计(1)针对检测的位点，设计一系列LDR产物的分子量系列；(2)设计一个专有荧光标记探针，该探针具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；(3)设计一个专有模板，该模板具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；(4)在标记探针的3’端和检测探针的5’端引入随机序列来调整探针长度；(二)PCR检测取待检测DNA1μl，PCR引物各10-30pmol，高温聚合酶，高温聚合酶混合液，相互混合，PCR反应条件为94℃30秒，40-68℃30秒-2分钟，60-72℃45秒-2分钟，循环25-40次；(三)LDR检测取PCR产物1μl，探针各40fmol-10pmol，连接酶，连接酶缓冲液，相互混合，LDR反应条件为94℃30秒，40-70℃(优选45-60℃)1-10分钟，循环1-40次；(四)结果检测取LDR产物1-5μl，混合测序系统的loadingbuffer，测序仪上样，进行LDR产物分离鉴定。2、根椐权利要求1所述的一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法，其特征在于其中步骤(一)(3)在标记探针的3'端引入模板配对序列和随机序列，以及检测探针的5'端引入随机序列，所述随机序列为与PCR产物的序列没有同源性的任何序列。3、根椐权利要求1所述的一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法，其特征在于其中步骤(一)(4)在要检测的突变位点的前后各设计10-25碱基长度的检测探针和标记探针，标记探针检测位点设计在3'端，检测探针的检测位点设计在5'端。4、根椐权利要求1所述的一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法，其特征在于其中步骤(一)(4)标记探针和检测探针具有相近的分子量。5、根椐权利要求1所述的一种通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法，其特征在于其中步骤(一)(4)所述一般标记探针包含三个部分，第一部分为和目的模板配对部分，第二部分为和连接模板配对部分，第三部分为同时在第一和第二部分序列中引入的随机序列，用来调整探针的长度，长度为40-80bp;所述检测探针包含两个部分，第一部分为和目的模板配对部分，第二部分为引入的随机序列，用来调整LDR产物的长度，长度为40-80bp;检测探针可以是两根、三根或四根，探针中3，端为检测位点，每组针对核酸单碱基变化的检测探针，通过设定检测探针的长度，实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。6、一种如权利要求1所述的PCR-LDR基因多态性检测测序方法在HPLC或微流芯片高分辨率的核酸分离检测系统中的应用。全文摘要本发明提供一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法。本发明利用荧光标记探针进行PCR关联LDR和测序技术来进行基因多态性位点检测。本发明方法包括以下步骤引物和探针设计、PCR检测、LDR检测、测序仪结果检测。本发明的方法由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性；测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测；位点的高通量，利用测序仪的5色荧光检测系统，同时能利用4种荧光，使测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。文档编号C12Q1/68GK101329250SQ20071004225公开日2008年12月24日申请日期2007年6月20日优先权日2007年6月20日发明者肖君华,炯陆,陈轶群申请人:上海翼和应用生物技术有限公司