专利名称：：耐高温酒精酵母的优化方法
技术领域：
：本发明涉及一种耐高温酒精酵母的优化方法，及利用该方法获得的耐高温酒精酵母菌株。
背景技术：
：耐高温酒精酵母的研究已经成为当前国内外酒精行业的热门课题，使用耐高温酵母不仅能够配合作用于纤维素原料的纤维素酶的最适作用温度；降低生产水耗、电耗，充分利用现有设备，縮短生产周期，提高生产率，而且能够保证夏季的正常生产。自80年代后期，我国相继有耐高温酒精酵母问世，并成功的在生产中应用。1980年底至1985年，北京酒精厂从白酒出池的酒醅(出池温度39—4rC)中初筛出5株发酵力强的菌株，然后从中复筛出在38—39'C发酵成绩好的两株酵母，再在40。C下定向驯化，经4年1428次传代、分离、培养，获得了能在4(TC下正常繁殖和发酵的菌株。1987年中科院武汉病毒所报导了耐高温酵母的选育。该所的WVHY8菌株适宜生长温度范围广(25-42°C)，一年四季均可使用，尤其保证夏季高温正常发酵；生产快、发酵能力强，平均出酒率比其它生产菌株提高1.2%。1989年宜昌酵母基地从国内收集到6株耐高温酵母菌株，从中筛选出耐高温，发酵性能良好的酒精酵母WT。它们在40'C下发酵成绩与3(TC时的一样优良。目前，筛选耐高温酵母大多采取长期高温驯化的方法，但普遍存在高温驯化周期长(几年不等)，出酒率增幅小(1.2%)，耐受温度低(40°C)等缺点。
发明内容本发明的目的是为了克服现有优化手段单一，周期长，耐受温度低的不足，提供一种新的优化耐高温酵母菌株的方法，同时还提供了利用该方法筛选获得的耐高温酒精酵母菌株。本发明提供了一种耐高温酒精酵母的优化方法，将高剂量率脉冲电子束对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)进行辐照，辐照剂量为半致死剂量至临界致死剂量，结合高温驯化，最终获得耐高温4rc以上的酿酒酵母菌株。较佳的，高剂量率脉冲电子束对酿酒酵母辐照的剂量率范围为109Gy/s-2.5X109Gy/s。较佳的，高温驯化条件为在36。C的培养温度下培养三天，挑出生长良好，形状圆实饱满的菌落，转接培养温度提高0.5。C的培养条件下再培养三天，重复上述步骤，直至温度提高到菌株无法生长为止。由此获得最高培养温度。高剂量脉冲电子束是指由高能脉冲电子加速器产生的每2ns发射电流2A的电子束，即每秒能发射10v能量。本发明的方法，不仅可以对普通酿酒酵母进行优化，也可对用本方法或其它方法获得的耐高温酿酒酵母进一步优化。高温驯化是指根据酵母在自然不同气候条件下的适应性原理，人为地创造热刺激以驯化酵母的耐热性，使之适应高温条件。本发明另一方面提供了一种耐高温酿酒酵母菌株，经由上述优化方法获得，在4FC下能正常繁殖和发酵。上述耐高温酒精酵母菌株，产酒精量高于出发菌株。较佳的，上述菌株能在43.5'CYPD固体培养基正常生长，36'C的发酵温度下酒精产量较之出发菌株提高近一倍。本发明的有益效果在于利用本发明的优化方法筛选耐高温酒精酵母耐高温在4rc以上，可重复性好。用该优化方法获得的耐高温酒精酵母性能稳定，活性较高，发酵力强，耐高温酒精酵母可以配合作用于纤维素原料的纤维素酶的最适温度，使纤维素酶的作用充分发挥；且能保证酒精工业的酵母菌株在夏季高温正常生长，降低水耗，电耗；并且高产酒精耐高温的酵母能在相等原料的基础上产出更多的酒精，显著提高企业的经济效益。图1高能脉冲电子束不同剂量辐照酵母存活曲线图2出发酵母菌株在36C和43.5'C的生长情况左图为36。C，右图为43.5°C图3优化的酵母菌株在36。C和43.5'C的生长情况左图为36。C，右图为43.5。C图4出发酵母菌株乙醇产量HPGC分析图5优化的酵母菌株乙醇产量HPGC分析图6高能脉冲电子束辐照选育的耐高温酵母酯酶同工酶谱及模式图比较左图泳道2，4，6为出发菌株，点样量为20，30，25ii1，泳道1，3，5为优化的耐高温酿酒酵母菌株，点样量分别为20，30，25ul，右图l为出发模式图，右图2为优化的耐高温酿酒酵母菌株模式图具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例1利用高剂量率脉冲电子束处理酿酒酵母菌株辐照样品制备将出发菌株Saccharomycescerevisiaewo(购自Sigma公司)接种于100ml液体YPD培养基，经36i:培养温度，活化18小时后，取0.5ml菌液加入EP(印pendorf)管中，离心5000r/min，重复三次。分别采用冷冻干燥，常温真空干燥预处理样品。分别设定不同的辐照剂量(0—200Gy)，测定酵母菌的生存曲线(图1)，酵母辐照并稀释涂平板后，24小时后记录各平皿中的菌落数量。结果如图l所示，从图上可以看出，随着辐照剂量的增大，酵母菌落存活数量有总体下降的趋势，但在70Gy到100Gy存活曲线下降趋于平缓，100Gy之后菌落数迅速减少，从图中可以看出，该酵母菌株的辐照半致死剂量为120Gy。(因为空白即未经辐照的酵母菌株的存活数为720，所以半致死剂量的存活菌落数大约为360，所以120Gy也是估算的)临界致死剂量为200Gy左右。采用由高能脉冲电子加速器产生的高剂量率脉冲电子束辐照酵母样品，辐照时间分别为10s，15s,20s，25s，辐照剂量率分别为109Gy/s、1.5X109Gy/s、2X109Gy/s和2.5X109Gy/s的电子束辐照酵母样品，对应获得四组辐照后的酵母样品。实施例2辐照后样品的高温驯化将实施例l获得的四组辐照后酵母样品，分别在YPD液体培养基中36'C培养4h，然后分别接种到100mlYPD液体培养基中，4rC富集培养48h，稀释后涂YPD平板，置41'C培养，以未经辐照处理的酵母菌为对照，每天记录菌落生长情况。并经多次高温驯化筛选(即在36'C的培养温度下培养三天，挑出生长良好，形状圆实饱满的菌落，转接培养温度提高o.5t:的培养条件下再培养三天，重复上述步骤，直至温度提高到菌株无法生长为止。)最终，每组分别获得耐高温43.5°C、43°C、42.5°C、42'C的菌株，其中，辐照剂量率为109Gy/s的组获得了耐高温在43.5'C的耐高温酿酒酵母菌株，该菌株在43.5'CYPD固体培养5基中仍能正常生长，命名该菌株为YE2。(参见图2和图3)实施例3重复实验采用实施例1和2的方法，对出发菌株Saccharomycescerevisiae进行辐照时间分别为10s、12s、15s、17s、20s、22s、25s，辐照剂量率分别为109Gy/s、1.2X109Gy/s、1.5X109Gy/s、1.7X109Gy/s、2X109Gy/s、2.2X109Gy/s和2.5X109Gy/s的辐照处理及高温驯化筛选，每种剂量率各设两组，结果每组在4rCYPD固体培养基平皿中能正常生长的均超过20个单菌落，即均可获得耐高温4rc以上的菌株。这说明本发明的方法优化酿酒酵母耐高温，可重复性好，且至少可获得耐高温4rc的酿酒酵母。实施例3出发菌株与优化的耐高温酿酒酵母菌株发酵乙醇含量分析将出发菌株和实施例2获得的耐高温酿酒酵母菌株以2X的接种量接种于100ml不同的葡萄糖浓度(葡萄糖浓度2%—8%)的YPD液体培养基置于36r发酵96h，取适量发酵醪液蒸馏后，供气相色谱分析。乙醇含量分析采用高压气相色谱(HPGC)色谱仪汽化室温度170。C，柱温150。C。N220ml/ml，H260ml/min，02300ml/min.进样量lul，内标物为甲乙酮。结果表明，优化的菌株与出发菌株相比，乙醇产量明显提高，四组菌株平均提高85.9%。其中出发菌株接种于100mlYPD培养基36。C发酵96h酒精产量0.77%，菌株YE2接种于100mlYPD培养基36t:发酵96h酒精产量1.49%(参见图4和图5)，产量提高了近1倍。下表列出了出发菌株和诱变菌株YE2在不同葡萄糖浓度的YPD培养基36C发酵96h酒精产量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例4酯酶同工酶分析出发菌株和菌株YE2在相同条件培养48h后，酯酶同工酶酶谱电泳照片和模式图见图6，点样量为30ta时条带较清晰，两个菌株均可见6条典型酶带，其Rf值分别为0.45，0.52，0.64，0.69，0.74，0.86，但突变株0.74和0.86两条带明显增强，表明出发酵母菌株经优化所得的耐温菌株有两种小分子量的酯酶活性明显增强。权利要求1.一种耐高温酒精酵母的优化方法，将高剂量率脉冲电子束对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)进行辐照，辐照剂量为半致死剂量至临界致死剂量，而后高温驯化，最终获得耐高温41℃以上的酿酒酵母菌株。2.如权利要求1所述的耐高温酒精酵母的优化方法，其特征在于，所述高剂量率脉冲电子束对酿酒酵母辐照的剂量率范围为109Gy/s-2.5X109Gy/s。3.如权利要求1所述的耐高温酒精酵母的优化方法，其特征在于，所述高温驯化条件为在36。C的培养温度下培养三天，挑出生长良好，形状圆实饱满的菌落，转接培养温度提高0.5。C的培养条件下再培养三天，重复上述步骤，直至温度提高到菌株无法生长为止。4.如权利要求1所述的耐高温酒精酵母的优化方法，其特征在于，所述酿酒酵母为普通酿酒酵母或耐高温酿酒酵母。5.—种耐高温酿酒酵母菌株，由权利要求1—4中任一权利要求所述方法优化获得，在4rc下能正常繁殖和发酵。6.如权利要求5所述的耐高温酿酒酵母菌株，其特征在于，所述耐高温酿酒酵母菌株在43.5'C下能正常繁殖和发酵。7.如权利要求5所述的耐高温酿酒酵母菌株，其特征在于，所述耐高温酒精酵母菌株产酒精量高于出发菌株。8.如权利要求6所述的耐高温酿酒酵母菌株，其特征在于，所述耐高温酒精酵母菌株在36r的发酵温度下酒精产量较之出发菌株提高近一倍。全文摘要本发明涉及一种耐高温酒精酵母的优化方法。将高剂量率脉冲电子束对酵母菌株进行辐照，结合高温驯化，筛选获得耐高温酒精酵母菌株。本发明还公开了用上述该方法筛选获得的耐高温酒精酵母菌株。利用本发明提供的方法优化耐高温酒精酵母，可重复性好。用该方法获得的耐高温酒精酵母性能稳定，活性高，发酵力强，工业使用可保证酒精工业夏季高温正常生长，降低水耗，电耗，提高酒精产量，带来显著经济效益。文档编号C12N13/00GK101328466SQ20071004222公开日2008年12月24日申请日期2007年6月19日优先权日2007年6月19日发明者姚思德,孙晓宇,虹朱,朱融融,汪世龙,许竞早申请人:同济大学