专利名称：一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及细胞工程和生物制药领域，具体涉及一种用于动物细胞无血清结 团灌流培养的工艺。
背景技术：
当前，在生物技术制药方面，利用动物细胞的大规模培养来生产的基因工程 药物己占70%。因此如何改进细胞大量培养的技术，已是增加产量、降低成本的 关键。其中之一是争取用灌流培养技术替代传统的批次和批次一补料的工艺，提 高反应器内细胞密度，延长培养周期。要进行灌流培养，除了要有有效的细胞截 留设备外，如何使细胞团体积增大，也将有助于细胞和培养基的分离。采用微载 体培养已证明是一个很好的方法。但微载体较贵，操作及处理也很麻烦。为此， 如何使细胞结团，采用结团培养已越来越引起人们的兴趣和重视。通常，贴壁细胞，尤其是某些肿瘤传代细胞系，在较低速度搅拌培养时，都 会结成小团。1980年美国圣路易斯Monsanto公司的Tolbert首先报告了多种细 胞，包括KNIH， SV3T3的自然结团培养，尽管他用的反应罐已达到60L，但由 于他当时未采用较好的灌流系统，细胞密度仅在l 2X106/ml的水平。接着， 瑞典的Litwin (1992)，葡萄牙的Moreira(1994)禾卩日本的Yamamoto(2000)等也都 分别用Vero细胞、BHK细胞和重组的CHO工程细胞进行了结团培养试验，由 于同样的原因，细胞密度仅l~2X106/ml左右。但他们都已提出，结团培养的 优点是便于细胞和培养基的分离。2006年我国刘兴茂等(LiuXM,2006)在国外 杂志上发表了 HEK 293细胞的自然结团培养制备腺病毒的文章，他们采用了旋 转滤器进行灌流培养，连续17天，细胞密度达到1.2X10々m,取得了较好的成绩。为了促进细胞的结团，文献报告中大致有如下一些方法1.加入一些小颗粒诱导细胞结团。早期如美国明尼苏达大学的Goetghebeur 等(1991)在培养基中加入直径较小的约23jam的葡聚糖Sephadex20-50载体， Vero细胞可成圆形贴附在载体周围形成结团，他们(Perusich等，1991)还用以 试生产了水泡口炎病毒(VSV)。近期如韩国Hanyang大学的Ryu等(2003)则
利用纳米技术将PLGA(poly (lactic~co -glycolic acid)制备成更小的颗粒(直径约 696 907nm)来诱导细胞结团。他用30ml的搅拌瓶培养HEK293，结果细胞结 团比不加纳米颗粒的快和大，细胞密度也高，前者为1.2X106/ml,后者为2.2X 106/m。 2005年他们进一步对纳米颗粒进行加工，在培养前先让它在血清中吸附 一些贴壁因子，如纤维结合蛋白等，可促进细胞的结团，并提高重组抗体的产量。2. 加入某些生物的或化学的物质促进细胞结团。该类物质已报告的有① 钙离子(<^++),如美国明尼苏达大学的Peshwa等(1993)比较了不同的氯化钙浓 度对细胞结团和成活的影响，结果表明加入lOO^M的氯化钙就可促进细胞的结 团，而高于lmM，细胞结团因过于紧密可造成结团中心的细胞死亡。近来我国 华东理工大学的赵亮等(2005)也有观察钙离子对细胞结团和生长影响的报告。② 刀豆球蛋白A，如早期法国的Capo等(1982)从研究免疫反应的机制出发， 观察了刀豆球蛋白A对胸腺细胞结团的影响。近期美国Wisconsin- Madison大学 的Gestwichi等(2002)进一步研究了它引起结团的机制在于细胞表面的糖原。③ 植物血凝素L，如日本Kanazawa大学医学院的Takamatsu等(1999)在培养基 中加入l 2pg/ml PHA-L，细胞可形成50-80pm的结团，加入5pg/ml PHA-L时， 结团可增大至100-150 pm，他门用搅拌瓶以半连续地方式培养杂交瘤细胞10天 以上，由于换液时可令细胞结团自然沉降，故细胞密度可保持在lX106/ml以上， 抗体浓度保持在10吗/ml左右。④聚乙醇及RGD等小肽结合物，如Dai等U996) 报告，用聚乙醇和精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸合成小肽的复合物可促使IN-8A 成纤维细胞结团，有利于人造器官的制备。⑤甲基丙稀酸一甲基丙稀酸共聚物 Eudragit S100，如日本Nagoya大学的Yamada等(1998,1999)先后报告了用 EudragitS100，以及含有内酯(lactone)的Eudragit S100对肝细胞的结团促进作 用，并对肝细胞功能的发挥和制造人工肝脏都有很好的作用。3. 利用培养设备促使细胞结团。如德国Leipzig大学的Rothermel等(2005) 设计制备的摇床可使视网膜细胞良好地结团，有利于组织工程和药物的研究。又 如美国航空航天部Johnson航天中心设计的微重力细胞培养系统，可用于细胞的 3相结团培养，但设备容积很小，目前主要用于人造器官的研究和生产(Duke 等，1996)。另外，1995年加拿大SonoSep生物技术公司的Pui等用超声波使杂 交瘤细胞结团，并用以进行了批次和半连续的培养。
从上面国内外在结团方法和结团培养的工艺方面的研究中可以看出，一方面 结团培养有很大优越性，它可以使细胞的生长环境更接近体内，便于细胞之间的 信息交换，更好地发挥细胞的生理功能和提高表达量。还可以像微载体培养那样， 便于和培养基分离，进行灌流培养，提高细胞密度。由于不用微载体还可节省生 产成本，减少微载体处理的麻烦。另一方面也可看出，在结团方法和结团培养的 工艺方面还都处在摸索和研究阶段。在结团方法方面主要靠细胞自然形成，而研 究的添加物有的很贵如纳米颗粒，有的会影响产品的纯化如植物血凝素、刀豆球 蛋白A等，有的还会影响产量如EugragitS100,而美国航天部的微重力细胞培养 设备很小，放大可能会带来不少问题。看来在结团培养工艺方面，关键要解决好 结团的方法和结团培养的灌流系统问题。由于这些问题没有很好解决，所以至今 还没有真正在生产中实际使用的报告。发明内容本发明的目的在于提供一种用于动物细胞无血清结团灌流培养工艺，使结团 培养能替代微载体培养工艺，充分发挥结团培养的优点，实际使用于生物药品的 生产中，达到降低生产成本、提高细胞密度，延长生产周期长，增加产量的目的。本发明的目的通过采取以下技术方案予以实现一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，包括以下步骤(l)动物细 胞在无血清培养基的搅拌培养中驯化；(2)动物细胞在无血清培养基的培养中初 步结团；(3)动物细胞在反应罐中用超声-沉降双结合灌流系统进一步结团和进 行灌流培养；(4)不定期抽去部分动物细胞，使罐内动物细胞保持合适的高密度， 并直接用以扩大生产。上述技术方案中，所述的步骤(1)中动物细胞需在无血清培养基的搅拌培 养下进行驯化，驯化过程是将培养基中血清浓度从5%逐渐下降至0%。所述的步骤(2)中动物细胞在进入反应罐前，需在方瓶、转瓶和搅拌瓶内 进行初步结团，结团靠细胞在无血清培养基中自然结团。所述的步骤(3)中的超声-沉降双结合灌流系统由超声-沉降二合一灌流柱、 可正反转的蠕动泵、可定时和定向地控制蠕动泵转动的自动控制器以及控制超声 波发生功率和时间的超声波控制器组成；所述的蠕动泵包括抽液蠕动泵和进液蠕 动泵，抽液蠕动泵连接有收液罐，进液蠕动泵连接有贮液罐；所述的超声-沉降
二合一灌流柱置于反应罐中；所述的超声-沉降二合一灌流柱由超声室和沉降柱 组成，超声室外面设有外套，外套的顶部和侧面设有压縮空气进口和压縮空气出 口，侧面设有接线与超声波控制器连接，超声室顶部设有抽液管，抽液管与抽液 蠕动泵相连，超声室的下部设有下管；沉降柱的顶部设有小管，该小管用于固定 在反应罐的顶盖，侧面设有接口，接口通过软管与超声室的下管连接。所述的步骤(4)中根据细胞密度和营养条件，不定期抽去部分细胞，使罐 内细胞长时间保持合适的高密度，然后将结团细胞作为种子，转种于3 5倍大 的反应罐内扩大生产。本发明的技术特点是(一) 采用细胞在高速搅拌的、血清浓度逐渐递减的培养基中驯化，可使细 胞在适应无血清培养的同时，也适应了搅拌中剪切力的影响。(二) 采用细胞在无血清培养基中低速搅拌培养结团法，以及用方瓶或转瓶 从有血清培养转化成无血清培养结团法，方法简单，结团可靠，成活率高。特别 是在进入反应罐后可直接进行无血清培养，直接收获上清产品。(三) 采用超声-沉降双结合灌流系统，不仅可有效地截留细胞，提高罐内 细胞密度，还可以通过超声的空穴作用，促进细胞的结团。由于有沉降柱的协助， 可大大减轻超声室的负荷，提高超声的结团和分离细胞的效率。 一旦细胞结团在 95%以上，结团多数大于200pm，细胞密度高于107/ml时，还可考虑停止超声， 单独采用沉降柱截流细胞。(四) 采用不定期地抽去部分细胞，有利于保持细胞良好的培养环境，包括 营养和氧的供应，使细胞处于良好的生理状态和成活率，有利于延长灌流培养周 期至100天，甚至更长。同时也可用此方法方便地直接扩大生产规模3 5倍。总之，采用本发明工艺，极大地提高了细胞的结团效率，极大地提高了灌流 时细胞的截留效率，使超声灌流系统充分发挥了细胞结团和截留的双重作用，从 而使细胞的结团培养真正能用于生产实际，达到降低生产成本、提高细胞密度， 延长生产周期长，增加产量的目的。
图1为本发明的超声-沉降二合一灌流柱的结构示意图；图2为本发明的超声-沉降双结合灌流系统的具体实施流程示意图。
具体实施方式
实施例l在无泡通气下进行CHO工程细胞A2株的结团无血清灌流培养生产溶栓药 TOK-tPA1、细胞驯化生产细胞为基因重组的CHO工程细胞A2细胞株，先用搅拌 瓶补加5。/。小牛血清的DMEM/F12培养基培养，搅拌速度为150rpm。然后将血 清量降至3%,再降至2%， 1% ，此时在培养基中添加叶酸、柠檬酸铁、硫酸 锌、硫酸铜、亚硒酸钠、Vc、 VB6、蛋白胨和胰岛素等。以后进一步将血清减 少至0.5%，以至完全取消血清。待细胞的生长和增殖速度与有5%血清培养时相 当时即完成驯化过程，此时将其冻存。2、 细胞结团将已适应无血清培养的细胞分3种方式培养方瓶、转瓶和 搅拌瓶培养，前两者先用加2%血清的培养基培养，使细胞贴壁生长，搅拌瓶培 养用无血清培养基培养，搅拌速度为70rpm。方瓶和转瓶培养的细胞汇合成片后， 改用无血清培养，经2 3次换液后细胞即结团，并开始脱离瓶壁，此时即可将 其转入反应罐。搅拌瓶内细胞经2 3次扩增培养后，多数细胞也可结团(结团 直径一般较小)，此时即可与方瓶、转瓶的结团细胞一起转入反应罐。3、 灌流培养如图2所示，采用B.Bmun公司的5L反应罐4，工作体积平 均5L，细胞接种量为68万细胞/ml。培养条件控制在温度37°C， pH: 7.2，溶 氧40%，无泡通气，搅拌速度从50rpm逐渐增加至120rpm。灌流系统采用 超声-沉降双结合的灌流系统(如图1所示)，其中超声-沉降双结合灌流系统由 超声-沉降二合一灌流柱、可正反转的蠕动泵、可定时和定向地控制蠕动泵转动 的自动控制器6以及控制超声波发生功率和时间的超声波控制器7组成。蠕动泵 包括抽液蠕动泵3和进液蠕动泵9，抽液蠕动泵3连接有收液罐8，进液蠕动泵 9连接有贮液罐10。超声-沉降二合一灌流柱置于反应罐4中，超声-沉降二合一 灌流柱由超声室1和沉降柱2组成，超声室l外面设有外套ll，外套ll的顶部 和侧面设有压縮空气进口 12和压縮空气出口 13,侧面设有接线14与超声波控 制器连接，超声室1顶部设有抽液管15，抽液管15与抽液蠕动泵3相连，超声 室1的下部设有下管16;沉降柱2的顶部设有小管21，该小管21用于固定在反 应罐4的顶盖，侧面设有接口 22，接口 22通过软管5与超声室1的下管16连
灌流系统采用超声-沉降双结合的灌流系统，灌流量从0.1体积/天逐渐增大 至4个体积/天，由控制灌流量的电子数字自动控制器6控制抽液蠕动泵3的转 向和时间来实现。收液进入收液罐8。超声波功率随灌流量的增大也从5W增加 至IOW，它由超声波控制器7来控制，进液量则由反应罐4的液位计11控制进 液蠕动泵9，将贮液罐10内的培养基打入反应罐4内，使反应罐4内的液位保 持恒定。试验结果表明，通过超声-沉降灌流系统灌流培养，约半个月后90%细 胞都已结团，结团直径多数在260 380nm，最大的可达1045pm，成活率始终 保持在80%以上，细胞密度可达2X 107细胞/1111以上，生产率平均达89.2mg/L.d， 最高达175 mg/L.d， TNK-tPA活性平均为35137 IU/ml，最高达55289 IU/ml。灌 流培养持续77天(因遇到节日放假而停止)，总产量34克。 实施例2在先表面通气后无泡通气下进行CHO工程细胞A2株的结团无血清灌流培 养生产TNK-tPA1、 驯化细胞复苏将冻存细胞管从液氮罐取出，立即置于约40'C水温中融 化，将细胞液1500rpm离心3分钟，弃取保存液，换上添加2%小牛血清的 DMEM/F12培养基10ml，在T30方瓶中37'C培养，2天后用胰酶消化，按1 : 3 的比例逐步扩增，以后分别将部分细胞转入转瓶2%血清培养，部分细胞转入搅 拌瓶无血清培养，进一步扩增。2、 细胞结团同实施例1之(2)所述方法，将有血清培养的细胞待细胞贴 壁成片后换以无血清培养基，使细胞结团，然后与搅拌瓶中初步结团的细胞一起 转入反应罐。3、 灌流培养用实施例1之(3)所述的设备、灌流工艺和控制条件。为了 观察采用表面通气的可能性，在培养的前一阶段，将罐内的培养体积降至3.8 4L，细胞接种量为42万细胞/ml，搅拌速度从70rpm逐渐增加至220卬m。结果 表明，细胞的结团情况和成活率与无泡通气相同，细胞密度达到1422万细胞/ml， 生产率平均为68.2mg/L.d，最高为115.7 mg/L.d，活性平均为21944 IU/ml，最高 为33931 IU/ml。培养周期为46天。由于控制液位计的高度无法随意调节，故无 法通过调节液位高度来满足细胞密度增加后的溶氧要求，不得不在第47天后再
4、延长培养周期当细胞培养至47天时，我们抽去了374体积的细胞，继 续在无泡通气的条件下进行灌流培养。细胞密度在5天内就从455万细胞/ml迅 速上升至2000万细胞/ml以上。活性最高达46207 IU/ml，平均为21807 IU/ml， 生产率平均为101.5 IU/ml,，最高为216.6 mg/L.d。通过抽去部分细胞的方法，这 次灌流培养的时间一共持续了 110天，总产量达37克，取得了比原先用微载体 培养更好的结果。总之，本发明例举了上述优选实施方式，但是应该说明，显然本领域的技术 人员可以进行各种变化和改型。因此，除非这样的变化和改型偏离了本发明的范 围，否则都应该包括在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特征在于该工艺包括以下步骤(1)动物细胞在无血清培养基的搅拌培养中驯化；(2)动物细胞在无血清培养基的培养中初步结团；(3)动物细胞在反应罐中用超声-沉降双结合灌流系统进一步结团和进行灌流培养；(4)不定期抽去部分动物细胞，使罐内动物细胞保持合适的高密度，并直接用以扩大生产。
2. 根据权利要求1所述的用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特 征在于所述的步骤(1)中动物细胞需在无血清培养基的搅拌培养下进行驯化， 驯化过程是将培养基中血清浓度从5%逐渐下降至0%。
3. 根据权利要求1所述的用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特征在于所述的步骤(2)中动物细胞在进入反应罐前，需在方瓶、转瓶和搅拌瓶内进行初步结团，结团靠细胞在无血清培养基中自然结团。
4. 根据权利要求1所述的用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特 征在于所述的步骤(3)中的超声-沉降双结合灌流系统由超声-沉降二合一灌流柱、可正反转的蠕动泵、可定时和定向地控制蠕动泵转动的自动控制器以及控 制超声波发生功率和时间的超声波控制器组成。
5. 根据权利要求4所述的用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特征在于所述的蠕动泵包括抽液蠕动泵和进液蠕动泵，抽液蠕动泵连接有收液罐， 进液蠕动泵连接有贮液罐；所述的超声-沉降二合一灌流柱置于反应罐中。
6. 根据权利要求5所述的用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特 征在于所述的超声-沉降二合一灌流柱由超声室和沉降柱组成，超声室外面设 有外套，外套的顶部和侧面设有压缩空气进口和压缩空气出口，侧面设有接线与 超声波控制器连接，超声室顶部设有抽液管，抽液管与抽液蠕动泵相连，超声室 的下部设有下管；沉降柱的顶部设有小管，侧面设有接口，接口通过软管与超声 室的下管连接。
7. 根据权利要求1所述的用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，其特 征在于所述的步骤(4)中根据细胞密度和营养条件，不定期抽去部分细胞， 使罐内细胞长时间保持合适的高密度，然后将结团细胞作为种子，转种于3 5 倍大的反应罐内扩大生产。
全文摘要
本发明公开了一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的工艺，该工艺包括(1)工程细胞在无血清培养基的搅拌培养中驯化；(2)工程细胞在转瓶、方瓶和搅拌瓶的无血清培养基培养中初步结团；(3)细胞在反应罐中用超声-沉降双结合灌流系统进一步结团和进行灌流培养；(4)不定期抽去部分细胞，使罐内细胞保持合适的高密度，并可直接用以扩大生产。采用本发明工艺，极大地提高了细胞的结团效率，极大地提高了灌流时细胞的截留效率，使超声灌流系统充分发挥了细胞结团和截留的双重作用，从而使细胞的结团培养真正能用于生产实际，达到降低生产成本、提高细胞密度，延长生产周期长，增加产量的目的。
文档编号C12N5/06GK101113431SQ20071002885
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月27日 优先权日2007年6月27日
发明者智 李, 琴 杨, 梁倩茹, 肖成祖, 郑敦武, 陈小飞, 陈晓铭, 黄小乐 申请人:广州铭康生物工程有限公司