专利名称：：一种新的巴氏葡萄球菌lf-2及其应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)的新菌株及该菌株在制备降解植物毒素药物中的应用。
背景技术：
：疯草(Locoweed)是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物的总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛分布于西北、华北和西南的广大草原，危害面积达1100万hm、近年来，国内外在疯草的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展，但迄今还没有控制疯草蔓延的特效方法，致使疯草中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。冰川棘豆(Oxytropisglacialis)是疯草的一种，也是青藏高原特有草种之一，主要分布在西藏阿里地区，遍及措勤，改则，革吉，日土，咯尔，普兰等县。它具有很强的抗逆性，在荒漠中生长旺盛，蔓延速度明显高于当地的其它植物，容易形成优势群落。它可以引起多种动物发生慢性中毒，使其出现以中枢神经系统功能紊乱为特征的中毒症状(杨小平.动物棘豆属疯草中毒的临床症状.武汉科技学院学报，2002，15(3):25-28;席琳乔，马丽萍.草地毒草棘豆的研究现状及进展.草原与草坪，2003，(3):19-22)，严重的发生死亡。据1996年调査统计，措勤县11个乡实际放牧草场面积9.30万hm2，冰川棘豆危害严重的有5.40万hm2，19781993年的15年中因中毒导致牲畜死亡达25万头(只)，直接经济损失约2205万元，年均死亡约1.7万头(只)，每年经济损失150250万元改则县有166.67万hm2草地冰川棘豆危害比较严重，19871995年牲畜中毒死亡21.28万头(只)，直接经济损失达2562万元，9年中，年均中毒死亡牲畜约2.4万头(只)，经济损失达350多万元；革吉县冰川棘豆蔓延较重的草场48.87万hir^，每年中毒死亡牲畜7500头(只)以上，经济损失120150万元。到1995年为止，阿里东部三个牧业县因冰川棘豆中毒死亡的牲畜总数在53万头以上，损失超过6172万元(李勤凡，王建华.冰川棘豆生长的生态环境特点.家畜生态，2004，25(1):42-44;王建华，张志恒，高巨星.西藏阿里地区动物"醉马草"中毒病调査报告.动物毒物学，1998，13(12):22-27;张志恒，高巨星，沈颂东，关于对西藏阿里地区"醉马草"调査情况的报告.动物毒物学，1998，13(1-2):11-13);此外，采食冰川棘豆中毒未致死的牲畜，其性能和品质显著下降，不能骑乘或驮运，皮毛质量低劣，体重下降，奶肉减产、繁殖能力减弱，出现畸胎、流产和死胎等，其损失超过雪灾或疫灾。而且冰川棘豆耐干旱、抗寒冷，与优良牧草竞争草地，导致大批优良牧草产量降低和草场退化。在牲畜冰川棘豆中毒经常发生的地区，牧民不敢放牧，致使这些草场得不到充分利用(吴达，司红丽，王建华.疯草研究现状.草业科学，2003，20(2):43-47)。由此可见，冰川棘豆对西藏南部地区家畜的危害非常严重，给西藏畜牧业带来很大损失。目前国内外对冰川棘豆的防除主要采取人工挖除、化学灭除和生物防除的方法。冰川棘豆虽是毒草，但其属于豆科植物，营养全面，如能合理利用，变废为宝，将会取得很好的经济效益，这方面国内外学者已经进行了许多有益的探索，主要包括合理轮牧、间歇饲喂和日粮搭配、脱毒利用等方法。其中，在有毒植物的脱毒方面，其方法有物理脱毒、化学脱毒、免疫预防及微生物降解等。近年来，应用微生物降解有毒物质一直是国内外研究的热点，但在微生物降解植物毒素方面的研究较少，不过也取得了一定的成果，周斌从菜籽饼中分离到能够降解芥子甙的多种微生物70多株，经鉴定这些菌是白色球拟酵母(rww/o戸"ca"ofe/fl)、华根霉^/7/加/wsc/n》ew^s)、总状毛霉(她corracemo雄')、米曲霉(A戸g/肠wyzae)，通过发酵试验确定其脱毒率为80%(周斌，分离筛选脱菜籽饼中芥子甙毒素菌株的研究，云南大学学报，1996，18(2):122-125)。谭蓓英等从广西涠洲岛的黄牛瘤胃中，分离出4株厌氧细菌，经鉴定为乳杆菌属(丄"cto6a"7/"s)(2株)、牛链球菌(Srr取ococcws6ov&)禾口生孢梭菌(C/o欲诚M附s/orage腦)，上述菌株对含羞草素和二羟基吡啶类毒素具有降解活性，这些脱毒菌生活在瘤胃中，可以保护宿主动物免受银合欢的毒害(谭蓓英，王旭明，汪儆，降解有毒的含羞草素和二羟基吡啶化合物的瘤胃细菌.微生物学报，1994，34(5):379-384)，其研究方法可用于冰川棘豆研究，以求彻底解决冰川棘豆的毒害问题，使动物利用冰川棘豆的丰富营养而不中毒。2，2，6，6-四甲基哌啶酮(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidone，TMPD)是从冰川棘豆地上部分提取、分离出来的一种主要毒性生物碱(谭远友，王建华，李勤凡等，西藏阿里地区冰川棘豆毒性生物碱的鉴定，畜牧与兽医，2002，34(5):12-13)。目前，尚无有效方法使冰川棘豆中的TMPD毒性降低。如能应用微生物降解TMPD，将对彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。
发明内容针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明目的在于提供一种新的巴氏葡萄球菌LF-2菌株，该菌株能够有效的降解，2，6，6-四甲基哌啶酮(简称TMPD的毒性，彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下一种新的巴氏葡萄球菌LF-2(Step/y^ococc"spasz^/n'LF-2)，其保藏号为CCTCCNO:M206127。已于2006年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO:M206127，保藏单位地址中国武汉武汉大学。本发明还有一目的是巴氏葡萄球菌LF-2(5^ap/y7ococci;spa"ewi^')在降解植物毒素中的应用。本发明还有一目的是巴氏葡萄球菌LF-2(5&*_Zococ萍te"ri)在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。本发明还有一目的是巴氏葡萄球菌LF-2(5"tap力jiococc^;astew^)在制备降解植物毒素药物中的应用。本发明还有一目的是巴氏葡萄球菌LF-2(5T^々rAcocc"5"pas""/7')在制备降解植物毒素2，2,6，6-四甲基哌啶酮中的应用。该株TMPD降解菌均来自于西藏、内蒙、青海等地疯草生长的环境土壤中，经人工分离、筛选而得，具体的分离、筛选见后边的具体实施例。以下是本发明巴氏葡萄球菌(5^p/y^ococcwspastei/ri)LF-2的特征描述。1、形态学特征LF-2菌株的菌体为球状，0.81.0um，其在透射电镜下的形态见图1，其在扫描电镜下的形态见图2;革兰氏染色阳性，单个、成对和不规则堆状存在，无荚膜，无芽孢，无运动性；菌落呈圆形，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，灰白色，半透明；葡萄糖发酵产酸不产气，兼性厌氧，不产生刚哚，M.R试验阳性，V.P试验阴性，水解淀粉，还原硝酸盐，接触酶阳性，氧化酶阴性，尿素酶阳性，在5XNaCl和7XNaCl中生长。2.生理生化特征具体生理生化特征见表l。表l.LF-2菌4昧的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"f"表示生长或反应阳性；"一"表示不生长或反应阴性。3、16SrDNA序列同源性分析取LF—2菌株单菌落接种于10mlLB液体培养基中，37C过夜振荡培养后取1.5ml菌液离心去上清，按照U-Gene公司的细菌基因组DNA提取试剂盒中所示的提取方法制备PCR模板DNA，一20。C保存备用。用于16SrDNA的PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物BSF8/20:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系(50ML)为Taqmix25Mi，引物BSF8/20(10,1/L)2叱，引物BSR1541/20(lOMmol/L)2叱，模板DNAlML，重蒸水2(HC。PCR反应条件为94。C预变性2min;94。Clmin，56。Clmin，72。C2min，循环29次；72'C10min。经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像如图3所示，Ml为D謂O，LF—2为PCR产物，M2为200bpLadder。PCR产物用U-Gene公司的凝胶回收试剂盒回收纯化。测序由上海博亚生物技术有限责任公司完成，测序用引物为引物BSF8/20。LF-2菌株16SrDNA的GenBank登录号为EF127830,16SrDNA序列如序列表中序列所示。将LF-2菌株的16SrDNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，利用DNAStar软件构建系统进化树，见图4。由图4得出，LF-2菌株的遗传进化距离与葡萄球菌属最近，巴氏葡萄球菌(5^sp/y^x^co/spa5^e〃ri)同处于一个最小的分支，与己知菌株5Ysp/y7ococciAs/as^e〃ri(AJ717376)的同源性达到99.80%，说明该菌在分子系统发育分类学上属于巴氏葡萄球菌。经16Sri)NA序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《伯杰细菌学手册(第八版)》，最终确定LF-2菌株为巴氏葡萄球菌(6Y邵力/Acocc"spa^ewri)。该菌能以TMPD为唯-碳源，可降解TMPD的毒性。所述的LB液体培养基的组分及配比为蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，蒸馏水1L，pH为7.07.2，121。C高压灭菌15min。本发明的TMPD降解菌可降解冰川棘豆的主要毒素TMPD，为彻底解决冰川棘豆的毒害奠定基础。图1是LF—2菌株的透射电镜照片；图2是LF—2菌株的扫描电镜照片；图3是LF—2菌株的1%琼脂糖凝胶电泳图；图4是利用DNAStar软件构建系统进化树；图5是不同培养时间TMPD降解率曲线；具体实施例方式下面结合附图和发明人给出巴氏葡萄球菌LF-2的分离筛选办法及其巴氏葡萄球菌LF-2在降解TMPD试验来进一步说明本发明的有益效果。实施例l:产酸克雷伯氏菌LF-1的分离、筛选方法1、土样釆自西藏、内蒙、青海等地疯草生长的环境土壤；2、菌株的分离筛选分别取20g30g疯草生长环境中的4个来源的土.、壤接种于普通肉汤，37。C扩菌培养48h后在普通琼脂上进行划线接种，37。C培养24h，挑出单个菌落接种于含50mg/LTMPD的普通肉汤中，37'C培养48h，保存菌种；将上一步保存下来的菌种接种于含100mg/LTMPD的普通肉汤中，置37。C培养48h;重复以上过程，每次培养均增加頂PD含量，降低培养液中有机营养成分的含量，保存菌种。经5次培养，当培养基中TMPD含量增加到300mg/L时，4。C保存菌种备用；将上述保存的菌种接种于普通肉汤中，37i:'培养48h进行活化和扩菌，7500r/min离心15min，弃去上清液，沉淀的菌体用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后用灭菌磷酸盐缓冲液制成20mL的菌悬液，分别接种于含150mg/LTMPD培养基和无营养培养基上，37。C培养48h后，挑出TMPD培养基上生长良好的菌株，再划线分别接种于TMPD培养基和无营养培养基，重复培养，挑纯，得到一株降解菌，命名为LF-2菌株。所述的普通肉汤培养基的组分及配比为牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KHTOlg,蒸馏水1L，pH为7.47.6，121。C高压灭菌20min。所述的普通琼脂培养基的组分及配比为牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，K,1.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.47.6，121。C高压灭菌20min。所述的无营养培养基的组分及配比为NaCl1.0g，fc跳l.Og，肌C11.Og，MgSO，7化00.4g，FeCl:,0.Olg，琼脂20g，溶于1000mL双蒸水中，pH为7.27.4，12rC灭菌30min。所述的TMPD培养基根据不同需要，向无营养培养基中加入TMPD，调节pH7.27.4，121。C灭菌30min。试验例1:巴氏葡萄球菌LF-2的降解TMPD效果试验采用紫外一可见分光光度计法测定该菌对TMPD的降解率。将该降解菌分别接种于普通肉汤中，37i:培养48h进行活化和扩菌，7500r/min离心15min，弃去上清液，沉淀的菌体用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后用灭菌磷酸盐缓冲液制成20mL的菌悬液，分别接种于含150mg/LTMPD培养液中，每隔3天测定培养液的吸光度，测定结果带入回归曲线，计算其浓度。具体TMPD的降解率见表2。从表2可以看出，经30天培养，LF-2菌株的TMPD降解率为71.24%。不同培养时间TMPD降解率曲线见图5，从图5可以看出各菌种在接种后15d内降解速度最快，培养18d后，降解速度降低，说明三株降解菌接种TMPD培养液培养15天后，TMPD能被很好的降解。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)LF-2，简称CCTCCNOM206127。2.权利要求1所述的巴氏葡萄球菌LF-2(5YapAWococc"sA3^e〃ri)在降解植物毒素中的应用。3.权利要求1所述的巴氏葡萄球菌LF-2(Staphylococcuspasteuri)在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。4.权利要求1所述的巴氏葡萄球菌LF-2(St邻hylococcuspasteuri)在制备降解植物毒素药物中的应用。5.权利要求1所述的巴氏葡萄球菌LF-2(St邻hylococcuspasteuri)在制备降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种新的微生物巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)LF-2，已于2006年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏号为CCTCCNOM206127。该巴氏葡萄球菌LF-2，能有效的降解植物毒素，特别是对从冰川棘豆地上部分提取、分离出来的毒性生物碱2，2，6，6-四甲基哌啶酮(简称TMPD)的毒性，能彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。文档编号C12R1/44GK101100649SQ200710017249公开日2008年1月9日申请日期2007年1月18日优先权日2007年1月18日发明者李勤凡,王岚峰,王建华,耿果霞申请人:西北农林科技大学