专利名称：小麦体细胞杂种来源的低分子量谷蛋白亚基1-62的编码序列与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及到小麦体细胞杂种小麦低分子量谷蛋白 亚基1-62编码序列及其推导的氨基酸序列与该基因在转基因小麦优质育种中的应用。
技术背景小麦是我国的主要粮食作物之一，近年来我国的小麦育种不仅重视小麦产量而且开 始重视小麦的品质。小麦面粉的品质主要决定于谷粒中的谷蛋白多聚体，它的大小与性 质影响了小麦面粉的粘弹性(Shewry and Tatham, 1990; Shewry et al， 2003)。成熟 小麦种子的贮藏蛋白主要由麦谷蛋白和醇溶蛋白组成。麦谷蛋白又可以分为高分子量麦 谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunit, H丽-GS)和低分子量麦谷蛋 白亚基(Low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS)，分别占10%和40%，对 小麦品质起着主导作用。有研究证明，不同LMW -GS组成对面包加工品质有不同影响， 而且LMW-GS能够形成大聚合蛋白，与面团筋力有显著关系(PognaandKautran, 1990; Rui et al, 1993 ; Shewry and Tatham， 1997; Shewry et al， 2003 )。 因此，低 分子量麦谷蛋白亚基是影响面团加工品质的重要因素之一。研究表明，大部分低分子量麦谷蛋白亚基与大部分的Y -,全部的"-醇溶蛋白亚基 以相互紧密连锁的方式存在于第一同组群的1A， 1B， ID染色体短臂末端(Shewry et al， 2003 )，与各自的染色体基因相对，标记为A, ^/"-&, W"-ft，。Lew et al (1992)建议根据LMW-GS的氨基酸序列相似性进行小麦的LMW-GS命名。 迄今，根据对其N-端测序和基因推导的氨基酸序列，L丽-GS可以分为s-型，m-型和i 型。随着基因组PCR和RT-PCR在这一领域的应用，近几年人们得到了更多LMW-GS基因 序列 (see Mcintosh et al， s ' Catalogue of Gene Symbols for Wheat'， http:〃wheat. pw. usda. gov/ggpages/wgc)。低分子量麦谷蛋白的氨基酸序列除了信号 肽以外可以分为3个区域N-端保守区、N-端重复区和C-端保守区。 一般含有8个半 胱氨酸残基。除了第一位和第七位的半胱氨酸残基以外，其他6个半胱氨酸残基位置相 对保守并形成分子内二硫键，第一位和第七位的半胱氨酸残基可形成分子间二硫键。在 它们之间以及它们与高分子量麦谷蛋白之间可以形成聚合物，由此产生小麦麦谷蛋白之 间的网状结构，影响小麦面粉的弹性和延伸性，进而影响小麦的品质。Xuetal (2006) 用实验证实具有额外半胱氨酸残基的低分子量谷蛋白亚基对大面团的形成有贡献。 一般 认为，可以形成2个以上的分子间二硫键或/和含有较长的重复区的LMW-GS与优质相关。栽培小麦中的优质蛋白资源毕竟是有限的，而在长穗偃麦草等许多小麦的近缘种当 中包含多种不同于小麦的蛋白亚基。长穗偃麦草(^ro/^/W7 e^/7卵^/z , StStStStEeEeEbEbExEx， 2n=70)，由于具有蛋白质含量高和抗逆性强的优点，已经成 为小麦育种中十分重要的野生资源之一(Xia et al， 2003)。通过普通小麦与长穗偃麦 草的远缘有性杂交，我国科学家已经育成了一系列优质品种，例如小偃6号(Zhouetal， 1995)和小偃54 (Liu et al， 2001)。本实验室已经成功获得小麦与长穗偃麦草的属
间体细胞杂种植株，并且产生大量株系， 一些体细胞杂交系已经自交到了Fs代(Xiaet al， 2003; Liu et al， 2006)，从杂种后代中已获得蛋白质含量在20%以上的优质强筋 小麦新种质和新品系及耐盐(〉0. 5%)的小麦新品种"山融3号"。基因组原位杂交(GISH) 分析表明，长穗偃麦草染色体小片段渐渗到小麦基因组并且在后代稳定遗传(Wang et al， 2005);通过蛋白电泳、基因克隆与序列分析表明体细胞杂交获得的普通小麦与长穗偃 麦草后代株系中，出现了不同于双亲的优质H丽-GS基因及组合如类似小麦的 他W脚7ft 7^r"+75y^(赵同金等，2003; Fengetal， 2004a，b; Liu et al， 2007)。 初步研究表明，这些优质杂种中也含有长穗偃麦草的或不同于双亲的LMW-GS基因(Chen et al， 2007)。对体细胞杂种小麦LMW-GS基因初步的序列分析表明，存在额外半胱氨 酸，有形成3-4个分子间二硫键的分子基础，因而有可能对面粉品质有正向作用(Xuet al， 2006)。因而推测，杂种的优质不仅与新的HMW-GS有关，而且与新的LMW-GS相关。 发明内容本发明是提供小麦体细胞杂种LMW-GS 1-62的编码序列及其推导的氨基酸序列与其 在小麦品质改良方面的应用。本发明所提供的小麦体细胞杂种LMW-GS 1-62的编码基因来源于杂种株系11-12， 包括下列核苷酸序列1) 列表中SEQ ID NO. 1的DNA序列;2) 码序列表SEQ ID N0.2中蛋白质序列中的多核苷酸；3) 与序列表中SEQ ID NO. 1限定的DNA序列具有98%以上同源性，且编码相同功能 的DNA序列。上述小麦低分子量谷蛋白亚基基因，优选的编码序列是序列表中的SEQ ID NO.l。 本发明还提供了含有上述小麦低分子量谷蛋白亚基基因的质粒。 本发明还提供了含有上述小麦低分子量谷蛋白亚基基因的表达载体。 本发明所提供的小麦体细胞杂种低分子量谷蛋白亚基1-62的氨基酸序列指的是具 有SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列。 本发明所述基因结构特征本发明通过同源序列克隆技术，从11-12的基因组中鉴定分离得到的一个新的低分 子量谷蛋白基因。序列分析表明，该基因由启始密码ATG开始到双终止密码TGATAA结 束，包括一个无内含子的924 bp开放阅读框(编码306个氨基酸残基，去除两个终止 密码)，该基因的编码序列和由DNA序列推导的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示。推导的氨基酸序列显示典型的LMW-GS—级序列结构特点 一个由20个 氨基酸残基组成的信号肽序列、N-端保守区、N-端重复区和C-端保守区。该序列由9 个半胱氨酸残基组成，其中三个可以形成分子间二硫键，参与谷蛋白大聚体的形成，与 优质及其相关。该基因与克隆自小偃6号的亚基AY263369在DNA序列上有86%的相似性，其开放阅 读框DNA的长度为918 bp,比基因7-&短，已经证明AY263369能明显促进面粉面筋品 质(Xu et al， 2006，theor appl genet)。 AY263369的推导序列有9个半胱氨酸残基， 分布位置与1-62相似，因此推测具有类似Y17845结构的1-62很可能是对面粉面筋品 质有重要作用。
本发明所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因在转基因小麦优质育种中具有极其广 阔的应用。
图1为小麦体细胞杂种II-12低分子量谷蛋白亚基基因7-62的PCR扩增 l或2:小麦体细胞杂种I1-12; M: Marker (入DNAAfcoR I。图2为小麦体细胞杂种11-12低分子量谷蛋白亚基基因7-^"的原核表达 1，未转化的菌体蛋白；2， IPTG诱导表达转化菌体蛋白；3，未经IPTG诱导表达的转化 菌体蛋白；M，蛋白质分子量标准；箭头指示表达蛋白位置。
具体实施方式
实施例i小麦体细胞杂种n-12低分子量谷蛋白亚基基因7-^ 的分离、鉴定n-12的种子在黑暗条件下室温萌发，使用CTAB法对萌发15天的幼苗进行基因组DNA 的提取。LMW-GS基因特异性简并引物序列为Pl，5， -GCATCAA/GACCAAGCAAA/CAC-3'; P2, 5， -TTATCAGTAGG/CCACCAACTC-3，。 PCR反应程序95。C预变性5min， IO个循环；然 后以94'C/30 s，68。C/1 min(每个循环降l度)，72°C/90 s;进行35个循环；进一步在94 °C/30 s,58。C/30 s， 72°C/90 s;最终在72。C延伸7min。 PCR产物在2. 0%琼脂糖凝胶上 进行电泳并回收(TIANGEN DNA回收试剂盒)。将PCR回收产物连到pMD18-T载体上，然后转化f co7i DH10B感受态细胞。克隆转化 方法参照分子克隆实验指南(Sambrook et al， 1989)，鉴定出的阳性克隆进行双向两 次测序，序列如SEQ ID NO. 1。利用MEGA 3. 1软件以及NCBI和EBI等网站中的相关软件进 行序列分析和性质鉴定，推导的氨基酸序列见SEQ ID NO. 2。含有基因7-6J的质粒命名 为pMD18-7-6么并储存于实验室超低温冰箱中。实施例2小麦体细胞杂种11-12低分子量谷蛋白亚基基因fi^的原核表达 原核表达引物的设计选用的原核表达载体为pET-24a(Novagen)。根据克隆自小麦杂种 11-12的基因7-fi 的序列的信息设计引物，这些引物去除信号肽并且在产物两端引入了 酶切位点以便于克隆到表达载体pET-24a中去。正向引物(下划线为y\^W) : 5' - GCA CAT ATG ATG GAG ACT AGC TGC A -3，；反向引物(下划线为fcc^/) :5'- CTA GAA TTC TTA TCA GTA GGC ACC AAC-3'。原核表达载体的构建(1) PCR反应体系及反应程序2XGC buffer I (50ul) ; 10mM dNTPs (4ul); 50uM表达引物各2yl; 质粒DNA (50ng) ; 5U/ul LA Taq (0.5p1); ddH20补充至100 p 1。 PCR扩增反应程序与实施例1。(2) 基因表达片段的克隆PCR扩增的基因表达片段经过1.0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切割回收包含目的片段 的凝胶，用凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen公司)回收目的片段，回收的目的片段与pUCm-T 载体进行连接。连接转化以及阳性克隆的筛选参照Sambrook et al (1989)方法进行。(3) 基因表达片段的酶切及回收 10 X buffer H ( 5ul) ; Nde I (5U/ul， 2ul); EcoR I (5U/ul， 2ul);质粒DNA (20ug) ; ddH20补充至50ul，反应体系配制完成后37。 C水浴4hr;酶切产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，-20° C保存。(4) 表达载体的制备表达载体pET-24a保存在DH10B菌株里，用前在含卡那霉素(30 P g/ml)的平板上划线过 夜活化，然后摇30ml菌液，提质粒。表达载体的双酶切10Xbuffer H (5ul ) ; Nde I (5U/ul， 2ul) ; EcoR I (5U/ul， 2ul) ; pET-24a (10ul) ; ddH20补足至50pl。酶切反应体系配完后于37° C水浴4hr，酶切产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段，-20° C保存。(5) 基因表达片段与pET-24a载体连接连接反应体系为10 XT4 buffer ( 2 u 1) ; T4连接酶(1 y 1) ; pET-24a载体片段(6 n 1); 基因表达片段(6u 1) ; ddH20 (5ul);反应体系配制完成后16° C水浴连接过夜，连 接产物的转化到大肠杆菌DH10B及阳性克隆的筛选使用EcoR I和Nde I进行双酶切鉴 定阳性克隆，方法同Sambrook et al (1989)。小麦体细胞杂种II-12低分子量谷蛋白亚基基因J-fi^的原核表达(1) 表达受体菌的制备及转化表达受体菌为大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS (Promega)。大肠杆菌BL21感受态细胞的制 备方法按Sambrook et al (1989)的DH10B感受态细胞的制备方法进行。取5ul阳性 表达质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，转化时所用平板含有30ix g/ml的卡那霉 素，方法同Sambrook et al (1989)。(2) 蛋白的诱导表达取带有阳性表达质粒的表达菌落接种于5ml含有30 P g/ml卡那霉素的LB液体培养基中， 37° C振荡培养到0D6。。约为1.0时，吸出2ml菌液作为对照，在其余的培养液中加入IPTG 使其终浓度为1. OmM,然后继续培养4hr诱导蛋白的表达。(3) 表达蛋白的提取及电泳分析未诱导和诱导的菌液都加入1. 5ml离心管中，10000rpm离心lmin收集菌体，弃上清， 加入100u 1蛋白提取液，旋涡振荡混匀，沸水浴10min, 13000 rpm离心15min，上清 备用。表达蛋白的电泳分析按照文献赵同金等(2003;山东大学学报理学版)的方法进 行。 序列表〈110>山东大学<120>小麦体细胞杂种来源的低分子量谷蛋白亚基卜62的编码序列与应用<141> 2007-9-24<160〉2<210〉1<211〉924〈212〉GenomicDNA〈213〉小麦体细胞杂种来源的低分子量谷蛋白亚基1-62的可以表达的编码DNA〈400〉13tg朋g3CCttcctcgtctttgcccttcta gccgttgtggcgacatctgccattgcacag60gctgcatccctggtttggagagaccatggc3gC3CC犯CCat tacaacaa120aaagagacatttcca>caaca<accaccatcttcacaacaacaacaacagcttctgcaacaB180caacaacaaccatttcctcaacaaccacca tttttgcagcaacaaccttcattttcgcag240caaccactatccagttctaccax^ccaa^ccagcattttcg300C3gC^C^Caaacagttctaccacaacaa ccagcattttcgcagcaaca360cttctgcaacaacaacaacaaatccctattgttcatccatccattttgca gcagctaaac420ccatgcaaggtattcctccagcagcagtgcatccctgtggcaatgcagcgatgtcttgct480aggtcacaagtgttgcagcagagcatttgccatgtgatgcagcaacaatgttgccagcaa540ttgcggcaaatccccgagcaatcccgccatgagtxaatccgtgctatcgtctactctatc600atcctgcagcacaacaacaacaacaacaac3gCgtC卿gtatcatccaa660t3tC3gC犯Caacaaccccaacagttgggccaatgtgtctcccaacccca acagcagttg720cagcagcaactcgggcaacaacctc已acaa caacaattg已cacatggtgcctttttgcag780cc3cacc3g3tagctcgccttg鄉tgatgacttccattgcactccgtaccctgccaacg840atgtgC3gtgtc犯tgtgccgttgtacagctccaccacta gtgcgccattaggcgttggc900acccgagttggtgcct已ctgat aa924<210>2〈211>306〈212>PRT<213>人工序列<400〉2Met Lys Thr Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Ala Val Val Ala Thr 5 10 15Ser Ala lie Ala Gin Met Glu Thr Ser Cys lie Pro Gly Leu Glu 20 25 30Arg Pro Trp Gin Gin Gin Pro Pro Gin Gin Gin Pro Pro Ser Phe Ser Pro Val Leu Pro Val Leu Pro Gin Leu Leu Gin Gin Leu Gin Gin Leu lie Pro Val Ala Gin Gin Ser lie Leu Arg Gin lie lie Val Tyr Ser Gin Gin Gin Gin Pro Gin Gin Leu Gin Gin Gin Leu Gly Ala Phe Leu Thr Ser lie Ala Val Pro Leu Tyr Thr Arg Val GlyHis35 Ser50 Phe65 Gin80 His95 Gin 110 Gin 125 Asn 140 Met 155 Cys 170 Pro 185 lie 200 Arg 215 Gly 230 Gly 245 Gin 260 Leu 275 Ser 290 Ala 305Gin Pro Leu Gin Ser Gin Gin Gin Pro Gin Gin Pro Gin Pro Leu Phe Gin Pro Ala Phe Pro Ala Phe Ser Gin Gin lie Pro Pro Cys Lys Val Gin Arg Cys Leu His Val Met Gin Glu Gin Ser Arg lie Leu Gin Gin Gin Ser lie lie Gin Cys Val Ser Gin Gin Pro Gin Pro His Gin lie Arg Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser TyrGin40 Gin55 Pro70 Ser85 Ser 100 Gin 115 lie 130 Phe 145 Ala 160 Gin 175 His 190 Gin 205 Gin 220 Gin 235 Gin 250 Ala 265 Thr 280 Ala 295Lys Glu Thr Phe Gin Leu Leu Gin Phe Leu Gin Gin Gin Lys Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin His Gin Val His Pro Ser Leu Gin Gin Gin Arg Ser Gin Val Gin Cys Cys Gin Glu Ser lie Arg Gin Gin Gin Gin Tyr Gin Gin Gin Pro Gin Gin Gin Gin Gin Leu Thr Arg Leu Glu Val Met Cys Ser Val Pro Leu Gly ValPro45Gin60Gin75Gin90Thr105Gin120lie135Cys150Leu165Gin180Ala195Gin210Gin225Leu240His255Met270Asn285Gly300
权利要求
1.小麦体细胞杂种低分子量谷蛋白亚基1-62的编码序列，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；2)编码序列表SEQ ID NO.2中蛋白质序列中的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有98％以上同源性，且编码相同功能的DNA序列。
2. 根据权利要求1所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因，其特征在于所述的小麦低 分子量谷蛋白亚基的编码序列是序列表中的SEQ ID NO. 1。
3. 含有权利要求1所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因的质粒。
4. 含有权利要求1所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因的表达载体。
5. 小麦体细胞杂种低分子量谷蛋白亚基1-62的氨基酸序列，指的是具有SEQIDN0.2 的氨基酸残基序列。
6. 权利要求1所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因在转基因小麦优质育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了小麦(Triticum aestivum)体细胞杂种来源的低分子量谷蛋白亚基1-62的编码序列与应用。本发明所提供的小麦低分子量谷蛋白亚基1-62的编码序列包括1)序列表中SEQID NO.1的DNA序列；2)编码序列表SEQID NO.2中蛋白质序列中的多核苷酸；3)与序列表中SEQID NO.1限定的DNA序列具有98％以上的同源性，且编码相同功能的DNA序列。小麦低分子量谷蛋白亚基氨基酸序列是基于其编码序列推导的氨基酸序列，指的是具有SEQID NO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。该基因可用于转基因小麦优质育种工作。
文档编号C12N15/29GK101157926SQ200710017098
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月25日 优先权日2007年9月25日
发明者夏光敏, 峰 赵, 陈凡国, 陈梦竹 申请人:山东大学