利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法

专利名称：利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法
利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法技术领域 本发明涉及一种运用基因工程技术培育甘蔗抗花叶病 种质材料的方法，包括高粱花叶病毒Pi蛋白(SrMV-P》的氨基酸和核酸 序列，利用该序列构建的载体及培育的转基因植株，属于植物基因工程技 术领域。
背景技术：
近年来，随着全球气温的升高，带毒种苗的大量种植， 我国的闽、台、粤、桂、滇、浙等省蔗区花叶病非常严重。目前除通过培 育抗性品种外，主要是茎尖和愈伤组织培养脱除感染的病毒，恢复品种特 性，提高产量和糖分。但是脱毒苗易退化而重新感病导致花叶病的爆发流 行。因此，选育与利用抗病品种是控制甘蔗花叶病发生的根本措施。从1986年，美国Powel-Abel最先报道了将TMV-CP基因转入烟草获 得了对TMV具有抗性的转CP基因烟草植株以来，利用病毒的CP基因获 得抗病植株的可行性己在多种病毒、多种植物中得到证实。但由于转CP 基因的专化性很强，只对同一株系的病毒有很强的抗性。当接种不同属的 病毒或是同一属不同株系的病毒，其抗病性就会下降，甚至消失。故许多 育种工作者正利用病毒的其它蛋白进行抗病育种。P,位于SrMV基因组的5，端，是丝氨酸型的蛋白酶，可自身进行剪切 从多聚蛋白前体中分离出来，其蛋白分子量为30~60 kDa不等。在Potyvims 属中，Pt除了 C端Potyvims属中P,保守区及蛋白酶的结构域外，其保守 性很低，这表明它可能与特异的病毒和寄主互作有关。对Potato virus Y (PVY) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)的Pi分离物进行聚类分析 发现，其多态性很高，且根据分离物的病症及地理位置聚类。Yam mosaic vims(YMV)分离物的核酸序列同源性分析表明，Pj勺同源性仅为65%，而 HC-Pro同源性达80%。 P,蛋白的C端147个氨基酸残基为水解功能， His214、 Asp223 、 Asp288是水解酶最大活性所必需的氨基酸残基，这在 Potyvirus中非常保守，只有在少数病毒中发现Asp被替换成Glu。但是，
在丝氨酸水解残基(即Phe或Tyr后)与切点之间这段氨基酸序列的同源 性却很低。近年来通过突变或部分碱基的缺失方法对P,的功能进行了大量 的研究。1994年，Klein分别构建两个突变体， 一个是在P！的C-端水解 酶活性区Asp和Ser中插入一个片断，另一个是突变N端区域，结果发现， C端突变会使病毒致死，而突变N端对病毒生活力没有太大影响。但在将 C端突变体中的P,/HC-Pro的切点替换成NIa的切点后病毒又可生存，表 明P,蛋白酶活性不仅决定其自身，同时NIa也会延时或恢复其活性。1998 年Jelena et.al发现去除P,的病毒突变体对病毒的传播长距离运输影响不 大，但会明显抑制基因放大，证明了 Pi与病毒复制有关。P!参与RNA结 合也得到了证实。P,与CI同时参与病毒在细胞间的运动，同时Pi与HC-Pro 协作具有抑制寄主抗性及转入后基因沉默的作用(posttranscriptkmal gene silencing ,PTGS)。本发明就是针对以上背景技术，通过分离克隆SrMV的Pt蛋白基因， 并利用其构建无筛选标记基因的高效植物表达载体，通过共转化的方法， 以及快速、高效的转基因检测和抗病评价技术，大幅度提高甘蔗抗花叶病 育种效率，为甘蔗抗花叶病品种的培育奠定良好的技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SrMV-P基因培育抗花叶 病甘蔗品种的方法。所解决的技术问题是一种利用转基因技术改良甘蔗抗 花叶病的方法。具体地说，从高度感染甘蔗花叶病毒亚组中髙粱花叶病毒 株系SrMV的甘蔗品种"福农91-4621"中分离克隆SrMV-Pi基因，构建 植物表达载体，利用基因枪转导将其插入到甘蔗品种"福农95-1702"的 基因组中，培育抗花叶病转基因甘蔗品种，以提高其抗病性。所述的SrMV (Sorghum Mosaic Virus)指甘蔗花叶病毒亚组中高粱花叶病毒株系；所述 的SrMV-Pi基因指编码甘蔗花叶病毒亚组中高粱花叶病毒株系的P蛋白 基因。本发明利用SrMV-P,基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-Pt 基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P,基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病 转P1基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其
特征在于1 、 SrMV-P,的核苷酸序列为序列表中SEQ.ID.NO. l所示的碱基序列；2、 SrMV-P,的核苷酸序列所推演的氨基酸序列为序列表中SEQ. ID. NO. 2所示的氨基酸序列；3、 构建的植物表达载体为pUbi-SrMV-P,;所述的pUbi-SrMV-P,指以 SrMV-P,为目的基因，Ubi为启动子，Nos为终止子，无筛选标记基因的植 物表达载体；4、 利用基因枪转导获得转基因甘蔗品种，其外源SrMV-Pi基因插入基 因组的拷贝数为2 4个。 '根据上述培育方法获得的转SrMV-P,基因品种，其抗病性优于甘蔗受 体品种"福农95-1702"及其组培后代。已获得的转SrMV-Pi基因的甘蔗无 性系分别为福农5、福农37、福农50、福农51，福农53和福农64。本发明的序列与已报道的其它病毒Pi基因有明显不同，SrMV-P,全长 699bp。病毒采用翻译后修饰进行蛋白编译，整个病毒核酸序列只有一个 大的ORF，由一个起始密码子ATG决定氨基酸编码的起始位置，Pt为于 病毒的N端，所以所得基因序列的ORF始于ATG，但没有终止密码子。 P,的C端147个氨基酸残基为水解功能，His214、 Asp223、 Asp^是水解酶 最大活性所必需的氨基酸残基。P,与CI同时参与病毒在细胞间的运动， 同时P！与HC-Pro协作具有抑制寄主抗性及转入后基因沉默的作用。本发明的转基因甘蔗品种具有以下优点甘蔗花叶病发病率为0，且 不同无性世代间基本保持稳定，而受体品种发病率达82.7%，组培后代发 病率也高于66.8%。本发明的转基因甘蔗品种在温室和大田生长均快于受 体品种。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合 实施例加以说明。实施例利用SrMV-P,基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括以下
歩骤1、 甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因(SrMV-P。的克隆通过GENBANK己经公布的甘蔗花叶病毒亚组基因序列，并对其所编 码的多聚蛋白氨基酸序列进行多重序列分析后，根据保守氨基酸序列，设 计合成1组特异引物(1) FP11: 5' -ATTGGATCCATGGCAGGAGCATGGAAC-3，(2) RP1" 5， -GGGAGATCTAAAATAAGTTATTTCATT-3，利用上述特异引物，以Trizol方法提取的感病叶片总RNA为模板， 使用反转录酶合成cDNA第一条链，其反应按照如下进行取1 ^总RNA 样品(约1吗)，分别加入下列成分l^d的lOxRT-RNA缓冲液，3.25pl 的无RNase的水，l^il的dNTPs，加入0.5 (il的Oligo(dT)l5，0.25^1的RNase 抑制剂以及0.5^1的AMV反转录酶。轻轻混匀，稍离心，于42'C温育30 min。然后将反应混合物加热至95'C，温育5 min终止反应，冰上冷却并 稍离心，-2(TC保存备用。然后采用上述设计的RT-PCR引物进行PCR扩 增，其反应组成如下10)^1的5xPCR缓冲液，35.5^1的灭菌超纯水，0.5^1 的TaKaRa Ex Taq酶以及FCP和RCP引物各1^1以及2^1的cDNA模板。 PCR按如下反应条件进行94。C变性5min，然后94。C变性30sec、 52。C退 火45sec、 68"延长45sec， 35个循环，最后72'C延长5 min， 4。C保存备 用。PCR扩增结束后，以新鲜的TAE Buffer为电泳缓冲液，在1%的琼脂 糖凝胶上进行电泳，采用PCR Fragment Recovery Kit的方法回收RT-PCR 产物，然后连接到pMD-18-T载体上进行酶切验证和测试，以pMD-18-T 载体通用引物，在ABI PRISM 377XL型DNA测序仪上对pMD-18-T-CP 质粒进行测序分析，结果见SEQ.ID.NO. 1。采用BLAST、 DNAMAN4.0、 OMIGA2.0软件进行序列分析，上述这些方法都是常规分子生物学技术。2、 抗甘蔗花叶病转SrMV-P,基因植物表达载体的构建用Sg///和双酶切T-P,质粒和pZMLR14表达载体，将切下的目 的基因P,片段和载体片段通过琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收，连接目的 基因和载体片段，转化DH5a并进行PCR和酶切鉴定后得到Ubi启动子驱 动的Pi基因植物表达载体pUbi-SrMV-Pi 。将载体pUbi-SrMV-Pi和 pZMLR14以l: l的比例混合，采用基因枪的方法共转化甘蔗。操作过程 中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和 PCR鉴定为分子生物学的常规方法。 3、抗甘蔗花叶病转SrMV-P,基因材料的培育(1) 受体材料预处理在基因枪轰击前先将受体材料转入JDA培养 基中预培养2d，然后转入含渗透剂0.2 mol/L甘露醇和0.2 mol/L山梨醇 的JDA培养基中预处理4 6 h。(2) 基因枪轰击将预先准备好的装有愈伤组织的小培养皿放入基因 枪室的托盘上，关闭基因枪门，利用气压1100psi和射击距离6cm直接轰 击甘蔗胚性愈伤组织。(3) 过渡培养轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基(MS+2,4-D2 mg/L+Sorbitol 0.2 mol/L+Mannitol 0.2 mol/L)上继续处理18h，其后接入 MS+2,4-D 2 mg/L的培养基上25。C暗恢复培养5 8 d。(4) 筛选继代培养恢复后的愈伤组织转移至总糖为10.0g/L，内含 5.5g/L甘露糖的JDA培养基上筛选继代培养，15 d继代一次；(5) 筛选分化培养选择继代三次后仍存活的愈伤组织，转接入正常 培养基进行筛选分化。(6) 筛选促根培养抗性苗长到2 4cm后，转入SG培养基上筛选 和生根培养。(7) 炼苗和移栽当幼苗的根长至2.5cm长时，移到室外炼苗2d， 然后将小苗取出，用流水洗净附着的培养基，移栽到小花盆中(草木灰: 砂子:耕作土=1:1:1，混合后高压灭菌)定时喷浇稀释10倍的MS无机盐液。(8) 转基因植株的分子检测根据所转导的甘蔗花叶病病毒蛋白基 因序列设计特异引物，分别进行PCR、 Southern和RT-PCR，对转基因植 株进行目的基因分子检测，经Southern杂交证实，转基因抗花叶病品种的
外源P,基因的拷贝数福农5为2个拷贝，福农37为4个拷贝，福农50、 福农51和福农53和福农64为3个拷贝。Southern杂交采用Roche公司 DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitI的试剂盒，操作过 程严格按照试剂盒提供的指南方法。RT-PCR按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0，产品编号为DRR0194。经氯酚红检测上述几个转Pi基 因无性系均没有pmi标记基因。4、抗病转基因甘蔗无性系的筛选鉴定 根据国家转基因安全管理条例，将获得的转基因植株及相应的对照 (空载体轰击获得的植株以及受体原种福农95-1702)分别在人工气候箱、 大棚温室以及大田进行抗病性的筛选鉴定，评价转基因无性系。抗病性鉴定 *接种鉴定病毒液粗提参照周仲驹等(1987)方法，取严重感染相同花叶病的 病叶加3倍量的(v/w) 0.1 mol/LpH7.2含NaS03的磷酸缓冲液，经高速组织 捣碎机捣碎5 min，双层纱布过滤榨汁或12,000 g离心10 min，取上清。汁 液用于田间或温室病毒接种。接种方法用上述病毒汁液磨擦接种生长至7-8片叶的转基因甘蔗植 株。接种时，接种叶片大小一致，先用镊子轻轻划伤嫩叶，然后沾取少量 病毒液涂抹伤口处。重复接种3次，每次间隔6d。发病率调查首次接种7d后开始调查发病率，以后每周调查一次，直 至发病率稳定。 *自然诱发接种鉴定以空载体转化植株、受体原种作为对照，每隔两个转基因甘蔗无性系， 种植一行原种作为诱发行。田间自然发病在甘蔗齐苗后开始调查发病率， 每周调查一次，直到发病率稳定。 结果在人工接种条件下，受体品种(原种)的发病达82.7%，组培无 性系发病率达66.8%，福农95-1702通过组培后其发病率虽然也大幅度降低， 但是还极易感病，而转基因甘蔗均无发病，说明转入外源SrMV-P,基因后提高了甘蔗抗花叶病的能力。SEQUENCE LISTING<110〉福建农林大学<120〉利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法<130〉 〈160〉 4<170> Patentln version 3. 1<210〉 1〈211〉 699<212〉 薩〈213〉 Sorghum Mosaic<400〉 1Virus (SrMV)atggcaggagcatggaacactgtgacttacaagtggagaccgaatttggacaatgcaagg60gatgttcgaaaagtgatggaacactttgcagcaaagcaccaagtttacgacgcaaagcga120gcagcggagcataacagtagaatccttcgaaggacttttgtgc犯gaaatC3taaa犯cs180cctgaagagaagattcagcgceiaatctcaggtgtgggtcgcaacEiatcc3240acaattcatctgcactatgttaggttcaaaaac犯ggagaagaaggcatcacctgaaatt300scttcaggatcagttgcaaagttgacgcgacaggtacttgaactcagcaaaatcacaaag360cttg犯gtagaactcattggcaagaagaggtgca33tca^Ct犯3Ct3gC420aagagtatctacattgtg貼accagacacgagacaaataaattcaagcgc480attgatatcaacttagaacggcactggtttccacttgtgaag犯gaXtacaaagtgttat540ggtcacataccaccaagaatgttttgga胆atgagcaaaggtgatagtgggttaacgttc600Pit tcas肌tggtgagttgttcataattcgagga認cgagatggcgtcctacttaatagt660atcactagtgaaactcgaattaatgaaataacttatttt699<210〉 2<211〉 233<212〉 PRT<213> Sorgh咖Mosaic<棚〉2Virus (SrMV)Met Ala Gly Ala Trp Asn Thr Val Thr Tyr Lys Trp Arg Pro Asn Leu 15 10 15Asp Asn Ala Arg Asp Val Arg Lys Val Met Glu His Phe Ala Ala Lys 20 25 30His Gin Val Tyr Asp Ala Lys Arg Ala Ala Glu His Asn Ser Arg lie 35 40 45Leu Arg Arg Thr Phe Val Gin Glu lie Met Lys Thr Pro Glu Glu Lys 50 55 60lie Gin Arg Lys Ser Gin Val Trp Val Glu Lys Gin Asp Asn Asn Pro 65 70 75 80Thr lie His Leu His Tyr Val Arg Phe Lys Asn Lys Glu Lys Lys Ala 85 9b &Ser Pro Glu lie 丁hr Ser Gly Ser Val Ala Lys Leu Thr Arg Gin Val 100 105 110
Leu Glu Leu Ser Lys lie Thr Lys Leu Glu Val Glu Leu lie Gly Lys 115 AO 125Lys Arg Cys Lys Ser Thr Lys Leu Ala lie Lys Lys Arg Ser Asn Lys130135140G]u Tyr Leu His Cys Glu Thr Arg His Glu Thr Asn Lys Phe Lys Arg145150155 160lie Asp lie Asn Leu Glu Trp His Trp Phe Pro Leu Val Lys Lys lie165170 175Thr Lys Cys Tyr Gly His Met Pro Pro Arg Met Phe Trp Lys Met Ser180185 190Lys Gly Asp Ser Gly Leu Thr Phe lie Gin Asn Gly Glu Leu Phe Met195200205lie Arg Gly Lys Arg Asp Gly Val Leu Leu Asn Ser lie Thr Ser Glu210215220Thr Arg lie Asn Glu Met Thr Tyr Phe 225 230 '<2K)〉 3 <211> 27 〈212〉 DNA<213> Sorghum Mosaic Virus(SrMV)〈400〉 3attggatcca tggcaggagc atggaac<210〉 4 <211〉 27 〈212〉 隱〈213〉 Sorghum Mosaic Virus (SrMV) 〈400〉 4gggagatcta aaataagtta tttcatt272权利要求
1、一种利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P1基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P1基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P1基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于(1)SrMV-P1的核苷酸序列为序列表中SEQ.ID.NO.1所示的碱基序列；(2)SrMV-P1的核苷酸序列所推演的氨基酸序列为序列表中SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列；(3)构建的植物表达载体为pUbi-SrMV-P1；(4)利用基因枪转导获得转基因甘蔗品种，其外源SrMV-P1基因插入基因组的拷贝数为2～4个。
2、 根据权利要求1所述的一种利用SrMV-P,基因培育抗花叶病甘 蔗品种的方法，其特征在于设计合成的特异引物为(1) FP11: 5' -ATTGGATCCATGGCAGGAGCATGGAAC-3，(2) RP11: 5， -GGGAGATCTAAAATAAGTTATTTCATT-3，
3、 根据权利要求1或2的方法培育的转SrMV-Pi基因甘蔗无性系，其抗病性优于甘蔗受体品种。
全文摘要
一种利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P₁基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P₁基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。已获得的转SrMV-P₁基因甘蔗无性系，其抗病性优于甘蔗受体品种及其组培后代。
文档编号C12N15/82GK101126089SQ20071000922
公开日2008年2月20日 申请日期2007年7月19日 优先权日2007年7月19日
发明者张木清, 莺 郭, 阮妙鸿, 陈如凯 申请人:福建农林大学