专利名称：单链引物-启动子-选择子构建体的ivt的应用的利记博彩app
单链引物-启动子-选择子构建体的IVT的应用 相关申请
本专利申请要求2005年9月21号提交的60/719063号美国临时申请 的优先权。
潜在政府利益声明
本发明开发的部分资助来源于美国军队实施的一个项目下的SBIR(小 型商业创新研究)，授权号为DAMD17-03-C0047 C。政府可能拥有本发明中 的一些权利。
背景技术：
利用体外转录(即IVT )进行mRNA或基因组DNA的线性扩增，是公知 的分子生物学方法(参见Krieg & Melton， 1984; Melton， 1984)。对于 每一个輩巴标，IVT产生与该把标起始拷贝数成比例的RNA产物数，所以它 可以用于相对信-使丰度的确定(5, 545, 522、 5, 716, 785、 5, 891,636号美 国专利，Van Gelder等，1990 ),并且由此已广泛应用于基因表达分析 (5, 514, 545号美国专利)。IVT也是某些能够检测低水平病原体RNA或 mRNA的靶标指数扩增的等温方法中的一个中心环节(5,399,49号美国专 利，0368 906 B2号欧洲专利，Guatelli等，1990 )。
根据现有才支术，如6,291,170号和5，514， 545号美国专利，以及 2005/0130194号和2005/0123943号美国专利申请所公开的技术，常规的 步骤顺序如下进行cDNA合成，多用一个与RNA聚腺苷酸3，末端互补 的引物，所述RNA的5，末端包括T7启动子序列(非模板链)；可选地， 序列或基因特异性引物可以置于除5，末端以外的位置。在RNA酶H消化
13RNA模板或热变性RNA-DNA杂合体之后，进行第二链DNA的合成 (Goubler, U., 1983 )，产生全长或部分长度的双链DNA (依赖于引物力文 置)，该双链DNA中引入了一个双链T7启动子序列(以及相邻区域)。在 该方法的实际实现的过程中，必须向反应物加入DNA聚合酶或RT以有效 催化第二条链的合成(参见5,545,522号美国专利，描述了大肠杆菌(￡. Cb//) DNA聚合酶的使用；Kwoh等，1989)。反义RNA ( aRNA)通过 体外转录从第二条链合成，aRNA产物通过例如与捕获寡核苷S吏探针杂交 来检测，包括变式如分子信标(Vet, J.A.M., 2002;也可见BioArray Solutions 的专利申请，序号11/218838,提交日期2005年2月9曰，如下)或杂交 保护试验(参见6,004,745号美国专利，Amold等)，或者探针延伸。该领 域的所有这些方法都需要从最初的mRNA靶标合成双链cDNA，以及插入 RNA降解步骤。这些方法复杂而费时的步骤实际上将它们局限在实验室研 究中。在临床条件下，运用如此复杂的实验方法需要对有资格操作如此复 杂的(神秘的)分析的实验室技术人员进行特殊训练，并通常要认证。
核酸检测和序列分析一IVT还可以用于DNA分析，包括突变或多态 分析。通常，这些应用需要对基因材料(即基因组DNA)进行指数扩增， 多采用聚合酶链式反应(Syvanen,A.C.,2005;参见，例如4,683,202号美国 专利，Mullis)或多种变式的全基因组扩增(参见，例如USCD关于连接 介导的全基因组扩增的专利，美国专利号为5,686,243 )。 IVT提供了一种 PCR扩增之后的链选择的方法(参见，例如BioArray Solutions在2005年2 月9日提交的专利申请，序号11/218838,提交(IVT)),该方法尤其具有 下述优点容许该步骤和随后在IVT反应中产生的RNA链的多重检测相 结合。
简化和加速可信的多重扩增和检测反应，用适合临床条件的更筒单更 稳健的实验方法替换基因表达分析(5,514,545号美国专利)和其它核酸分 析任务的复杂过程，将非常有用。尤其在那种情况下，开发整合多个分析 步骤的整合实验方法也会有用，所述整合优选以允许实现相同测定形式 (homogeneous assay format)的方式。为了缩短完成测定需要的时间，尤 其是实际操作的时间，通过多个扩增产物的4企测以整合扩增和分析过程将特别有用。并且，步骤的整合，最好是以与实现相同测定形式相容的方式， 将推进小型化，这反过来将减少试剂的消耗和以及样品和实验室设备的污染。
IVT反应，特别是本文所描述的利用单链模板(而非双链模板)的IVT 反应，具有上述优势中的许多优势。
事实上，T7 RNA聚合酶利用单链启动子模板链并且催化单链模板 (sst)转录产生感兴趣的母链DNA拷贝的能力，已经在文献中有过报道 (Kukarin， A.等，2003; Korencic D.等，2002; Temiakov D.等，2002 )。然而，
在(一般的)IVT的实际实施中，这个反应被认为是体外转录的一个不利
副作用。
目前，sst-IVT反应还没有完全应用于复杂分析实验方法的开发和实 现，主要因为某些通常不期望的特征。首先，与常规利用双链(ds) DNA 模板的IVT模式相比，它保守的产量限制了以需要大量靶分子的常规配置 进行的实验方法的灵敏度；它较差的表现，即使在合适离子强度的緩冲液 中也如此，使其与现有测定方案中采用的其他上游和下游的酶反应不相 容。然而，如下所述，以一种整合多产物扩增以及同时检测和分析的方式 解决这些问题之后，sst-IVT得到优化进而适合多种核酸分析应用。
背景参考材料(所有都通过引用并入)
以下可以作为背景参考，以帮助理解后面某些术语和表述。这些参考 材料在下文中有时以作者、序号和其它指示来提及。
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*美国专利申请((BioArray Solutions,以下文中有时称为"eMAP"), "Multiplexed Aanlysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection (同时测量和酶介导的4企测进行多态性 位点的多重分析)"，提交日期2002年10月15日，序歹'J号10/271,602。
*美国专利申请(BioArray Solutions,以下文中有时称为"多重表达谱绘 制")"Optimization of Gene Expression Analysis using Immobilized Capture Probes (利用固定的捕获探针进行的基因表达分析的优化)"， 提交日期2004年10月26日，序列号10/974,036 (其中包括消减差 异基因表达分析相关的讨论，在本发明的公开部分中，有义和反义链 由引入的RNAPoll启动子序列产生)。
*美国专利申请(BioArray Solutions ):"利用专利特有的随机颗粒芯片 进行多组分分子分析"，提交2001年12月28日，序号10/032,657 ("编 码》兹性颗粒库")。
美国专利申请(BioArray Solutions ):"多重检测相整合的核酸扩增"， 提交日期2005年9月2日，序号11/218838;也可参考临时申请"与多 重检测相整合的转录扩增系统，探针、扩增和检测的功能整合，提交
18日期2004年9月2日，序号为60/606666; "IVT-RT eMAP试验，利
用IVT进行编码cDNA随机库的合成、包被和筛选"，提交日期2004
年9月2日，序号为60/606666。 *美国专利申请(BioArray Solutions ):"利用专利特有的随机颗粒芯片
进行多组分分子分析"，提交2002年8月23日，序号10/204,799 (讨
论随机编码阵列检测，READ )。 *美国专利申请(BioArray Solutions ):"利用专利特有的随机颗粒芯片
进行多组分分子分析"，提交2001年12月28日，序号10/032,657。 *美国专利申请(BioArray Solutions):"微颗粒芯片以及其的制备方法"，
提交日期02年7月9日，序号10/192,352。
美国专利申请(BioArray Solutions有时这里会称为"PARSETM"):"程
序化照明模式产生的系统和方法"，提交日期2001年1月24日，序号
09/768,414。
* 6,251,691号美国专利(BioArray Solutions,有时这里会称为"LEAPS"): "颗粒表面附近光控电动装配"，尤其参考图8。
* 6,291,170号美国专利。
* 5,686,243号美国专利。
* 2005/0130194号和2005/0123943号美国专利申请。
* 5,283,174和5,639,599号美国专利申请Arnold。
* 6,291,170号美国专利。
* 6,004,745号美国专利。
* 4,683,202号美国专利。
* 6,797,524号美国专利BAS。
* 10/973700号美国专利申请。
* 10/348123号美国专利申请。
* 60/628464号美国临时申请。
发明内容
所公开的是单链的引物-启动子-选择子构建体和体外转录介导的方法，该方法利用一个前面提及的单链引物-启动子-选择子构建体(这里筒
便称为单链模板IVT (sst-IVT))确定信使丰度和等位基因拷贝数，用于 多重基因表达分析、多重等位基因计数、基因拷贝数多态性分析；以及鉴 定突变和多态性的等位基因区分。这种单链的引物-启动子-选择子构建体 由三个功能独立的部分组成，它们的连接方式确定IVT的方向与任何可能 的引物3'延伸相反，目的是仅扩增选择子序列。
通常，所有靶标扩增的方法开始于构建体引物部分的靶标特异性退 火，随后为延长，反转录，或引物与其它寡核苷酸的连接。该构建体一般 包含一个序列特异性靶标引物子序列， 一个T7(或T3、 SP6、其它合适启 动子)启动子子序列(模板链)和一个选择子子序列，所述选择子序列假 定独特地与特定的引物子序列相关。在sst-IVT反应中，设计T7(或其它)
模板，更普遍是延长，见图1)。因此，与常规IVT方法相反，这里公开的 sst-IVT扩增的序列不是起始靶标的任何部分序列，这也是该设计的目的。 sst-IVT的RNA模板可以是信使RNA (mRNA)或病毒基因组RNA,或 者更普遍为之前IVT反应产生的RNA产物。本发明的方法也可以用于分 析gDNA,如变性(目的是产生单链靶标)和/或片段化之后(ManiatisT., 1982)。 sst-IVT反应的执行和效率可以提高，方法是利用选择子作为单链 DNA模板且带有双链(ds) T7启动子子序列(一条链引入到引物(模板) 中，另一条与其退火(非模板)。
为了产生sst-IVT反应的模板，可以进行延长或反转录(RT)反应以 使引物在与靶标链退火后得到延伸。为了促进随后分离延伸产物和未利用 的引物，该反应可以利用修饰的dNTP，如生物素或其它半抗原修饰，这 样在比如RT反应完成之后，含修饰dNTP的cDNA产物可以捕获至固相。 还可以使用柱纯化来进行分离，而不需要修饰的dNTP。
在一个实施方案中，sst-IVT可以用RNA-DNA异源双链体作为模板， 其中利用引物-启动子-选择子构建体反转录产生的cDNA,保持与完整的 起始mRNA的退火。在一个变体中，可以利用与固相基质连接的RNA-DNA 异源双链体进行sst-IVT反应。sst-IVT反应产生许多等长且与选择子子序列互补的RNA片段。优选 地，所述选择子子序列(以及其互补序列)被设计为与反应中存在的或期 望存在的任何其它序列不同。它可以作为独特的捕获序列用于随后的固相 反应，优选在编码微颗粒("微珠，，)上以随机编码阵列检测(READ ) 的方式进行(参见6,797,524号美国专利)。展示在编码固相载体上的探针 的捕获允许通过掺入修饰的NTP而标记的RNA产物的光学检测，或者 通过模板介导的反转录催化探针延长("eMAP"，参见序号10/271,602和 11/218838的美国申请)、使用修饰dNTP形成的延长产物的检测，图1。
如以下进一步描述的，这里公开的方法(如图2、 3、 4所示)能够大 大简化并加快复杂的应用。这些方法具有以下优势(其中关于RNA靶标 和RT的陈述，做必要》务改，适用于DNA和引物延伸)
在一个实施方案中需要消化mRNA模板且需要引入第二引物和DNA 聚合酶的实践中，仅使用一个功能引物，而第二链DNA的合成不是必需 的并因此可以被省略；
RNA酶一般为实现第二链合成所需要的，利用RNA酶H的RNA消 化步骤也可以忽略；mRNA-cDNA异源双链体的存在不会影响sst-IVT,因 为该反应仅用T7和选4奪子序列，而它们不是该异源双链体的一部分；
耙标特异性引物可以置于沿感兴趣mRNA靶标的任何位置，而不会影 响转录物的序列和长度，转录物的序列和长度由选择子序列的序列和长度 决定；如下所述，为了最大化编码樣i颗粒对转录物的捕获，转录物是短的 (序号为10/974,036申请)；转录物具有不同的序列，从而实现不同基因 以及表现出明显序列相似性的基因家族内基因的检测和计数；
方法的相对简单性允许若干个步骤的整合，正如这里更加详细阐述 的，包括在"单个试管"中或以相似方式同时进行靶标捕获、扩增和多重检 测，优选使用READ方式。如这里所述，这种整合反过来促进微型化。
图l描述这里阐述的引物-启动子-选择子构建体的RT (或引物延长)
21和体外转录的方向，^ 测。
图2描述利用这里阐述的构建体和方法进行的多重基因表达分析的方法。
图3描述利用这里阐述的构建体和方法进行的SNP或突变的检测。
图4描述利用这里阐述的构建体和方法进行的SNP或突变的连接介导 的4全测。
图5显示，根据检测之后产生的信号，sst-IVT反应依赖于所述构建体 的浓度和序列。
图6显示不同起始浓度的构建体IL-2R RT/T7/Sel + T7启动子的NT部 分不同起始浓度下，sst-IVT反应的时间过程。
图7显示利用这里阐述的构建体测定的剂量响应，用于检测不同的 mRNA (卡那霉素mRNA)浓度。
图8显示在不同浓度的构建体的柱纯化之前Exol处理的效率。
图9显示从过量构建体磁性捕获-流式(flow-through)纯化和膜纯化测 定产物的装置和方法。
图IO显示利用图例所示不同模板-构建体IVT反应(有或没有增加的 T7启动子NT部分，以及有和没有mRNA的RNA酶H消化)之后，暴露 100毫秒和500毫秒时产生的相对信号。
图11显示利用这里阐述的构建体^r测和扩增卡那霉素mRNA的试验， 其中包括柱纯化步骤，但省略了 mRNA的RNA酶H消化步骤。
图12显示利用固定于链霉亲和素包被的微^Ji的引物-T7-选择子构 建体的固相sst-IVT之后，RT eMAP检测的结果。
图13描述利用这里阐述的构建体，针对高产IVT (配对连接-sst-IVT 反应)扩增方法的多轮扩增。
图14显示一些具有粗体字显示的多态性位点的高度同源玉米序列。
图15gDNA的片断化以及随后引入引物的延伸。
22图16显示共装配微珠阵列，其中利用这里阐述的固定化引物-T7-选择 子构建体或双链DNA的sst-IVT反应以整合方式进行，通过捕获介导的延 长斗企测产生的RNA。
DNA的同时发生的IVT/RT反应结果。
图18显示连接介导的RNA病毒检测的方案。
详细描述
正如上面所指出的，这里所公开的方法中使用的引物-启动子-选择子 构建体包含达三个不同的子序列，各自为指定长度，即基因特异性引物 序列；T7 (或其它)启动子才莫板链序列，用于引导向构建体5，方向的体外 转录；和独特的"选择，，或"选择子"序列。本发明的方法指导IVT进行，以 产生选择子序列的RNA拷贝。该RNA转录物通过捕获至编码微颗粒("微 珠")而被检测，该编码微颗粒展示与选择子特异序列匹配的探针。独特 的选择子序列赋予反应产物独特性，从而能够从一系列(最初)相似序列 的靶标中选出特定扩增子(也可参照等位基因计数，2.2章)。所有信使都 被"计数"，无论它们在其中作为模板的RT反应产生全长还是仅部分长度 的cDNA产物，后者反映了中断的RT反应。优选地，为了检测相似信使 背景中的特定信使，以及为了4企测突变或多态性，使用成对的等位基因特 异性构建体，以使只有构建体中的匹配引物序列介导延伸和扩增转录物的 形成。该方法特别有用于检测和分析指定的mRNA亚群、病毒基因组 RNA/DNA、等位基因和基因。
1.利用引物-启动子-选择子构建体的体外转录-一般性质
实施例I说明相关反应条件下的sst-IVT性能，使用包括序列特异性 RT引物、T7启动子和与RT引物独特相关的选"^子子序列的构建体。如 示，sst-IVT表现出一种序列特异性剂量响应，且在模式系统中的检测限为 1 fmol引物/rxn(这里和其它处一样，除非另有说明，否则反应体积("rxn") 为10 ^ )。在有效的靶标浓度范围内，非模板链的加入使信号强度提高至~10倍，但对检测限没有影响(图5 )。因此，试验中获得的信号强度使sst-IVT 可以在加或不加T7启动子非模板链的条件下进行，而这取决于具体应用 的需要。
sst-IVT反应的时间过程示于图6，以产生短RNA的/丄-2i i r/77/fe/ #
遂DAC4+iv:rr7为例。反应开始时非常快，并且大部分在^2小时内完成，
尽管低浓度模板(lfinol /rxn)在4h孵育后可以观察到产量有进一步提高。 2. RNA分析
2.1mRNA计数信使丰度确定
本发明的方法能够实现基因表达谱的快速绘制，即，同时确定一系列 指定信使(通常存在其它信使)各自的丰度。这将特别有利于包含下述的 应用监测或表征一组特定基因在响应外部刺激(如治疗物质或传染物质) 时的基因表达模式。
该方法包括4个步骤(图2):
1. 利用RT引物-T7-选择子构建体合成cDNA (通过反转录)
2. 清除未用的构建体一在一种模式中，通过捕获cDNA
3. 线性扩增相应于个体cDNA的选择子序列
4. 通过反转录/杂交进行RNA产物的芯片上检测 可选择地，将第3步和第4步合并
3.利用微颗粒共装配阵列同时进行扩增和检测，如以下详细阐述。
实施例II说明利用卡那霉素mRNA模型在1300 fmol/rxn至0.1 fmol/rxn的輩巴标浓度范围内试验的灵敏度。这一改变的试验使用了柱纯化
(而非磁性分离)，这样cDNA合成就不需要生物素化的(或其它修饰) dNTP。这种方式进行的试验呈现一种剂量响应，且4企测限为0.1 fmol/rxn
(图7)。
除去未被利用的引物("清除") 一未被利用的引物-启动子-选择子构 建体必须在开始sst-IVT之前仔细清除以防止由单独的未使用引物形成转 录物。也就是说，根据携带量，sst-IVT可以产生不依赖靶标的信号，其强度可能会制约试验的灵敏度。
另外，使用生物素化的(或其它半抗原化的)dNTP合成cDNA，需 要在捕获至链霉亲和素(或半抗原-抗体)包被的磁性或非磁性颗粒上之前 除去未被利用的核苷酸。
为了提高下游的芯片上RT-eMAP反应过程中引入荧光标记dNTP的程 度(否则其将被排斥而优选利用未标记dNTP)，进而加强试验信号强度， 还需要除去dNTP。
这里提供几种纯化方法。在一个标准方法中，核酸外切酶处理以消化 过量的RT引物，并且结合使用碱性磷酸酶处理以便在IVT反应之前除去 dNTP (如4吏用ExoSap-IT, #78200， USB )。
在另外一种方法中，可以通过柱纯化清除反应中过量引物和NTP (也 可参考实施例II)。为了确保从cDNA或延长产物中有效清除引物，引物 应该大大短于产物。
在第三种方法中，柱纯化可以结合所述构建体的Exol消化。结合使 用核酸外切酶I处理和柱纯化清除未利用引物的效率如实施例III所示。结 果表明在这种测定方案中的最佳引物浓度不应超过100 finol/rxn。 Exo I处 理提高了信/噪比(通过进一步降低剩余RT引物的浓度)，但未提高允许 的引物浓度。
另一种除去过量构建体的方法是通过捕获至磁性微珠上，接着利用磁 性吸引力将微珠分离出来。这种方法还有一个优点就是以"芯片上，，模式促 成IVT和延长的整合。
》兹分离可以以至少3种不同的流式离心方式进行，如图9所示，即 使用"磁体头，，(tip on magent )、纳米分离装置(Nanosep device) (Pall，见 目录)或纳米反应器(如图9所述)。利用磁分离的sst-IVT方法使用生物 素化和未修饰dNTP的混合物进行cDNA的合成，接着使用链霉亲和素包 被的磁性超微颗粒捕获生物素化产物。另外一种(第四种)清除磁性微珠 的方法是在常规1.5ml试管中离心lml洗脱緩沖液收集微珠，接着将该试 管放在磁体旁边，以使沉淀沿着试管壁上升，然后从试管底部除去所有洗涤緩沖液，重复该过程2-3次，直至完成引物清除。
利用本发明方法合成cDNA后，cDNA连接至包括微珠和微颗粒的固 相基质，从而允许小体积cDNA的分离、纯化和有效浓缩，这样可能会提 高试验的灵敏度。
颗粒可以是任何合适的类型(参见，例如美国专利申请序号10/937,700 和10,348,123，两者都通过引用结合入本文)，包括^t性捕获颗粒(参见， 例如10/032,657号美国申请)，这样结合至该磁性捕获颗粒的延长产物可 以通过施加磁场而被聚集在基质表面上或附近。
本发明的试^r方式具有以下所述优点
设计灵活性一通过允许引物序列沿mRNA的任何位置放置，这里公开 的sst-VIT反应不要求靠近感兴趣mRNA的5'末端的引物放置一目的是限 制产物的大小以便芯片上检测，如10/974,036号美国申请所阐述的，或者 不要求如传统基因表达方法所需要的靠近3，末端，因此提高了设计的灵活
多重分析的特异性也大大增强了 。
特异序列的短转录物一靶标特异性引物可以^:在感兴趣mRNA靶标 的任何位置而不影响转录物的序列或长度，转录物的序列或长度由选择子 序列的序列和长度确定；如下所述，为了^f吏捕获转录物至编码樣么颗粒上的 效率最大化(10/974,036号美国申请)，转录物优选是短的。
所述构建体中sst-IVT选择子序列的特异和独特序列以及引物设计和 连接构建体(如这里所阐述的)的运用，可以在同源信使中引入显著的序 列差异，以区分相似基因的表达。这个设计特征特别有利于基因家族中 特异基因的分析；如基因拷贝计数；区分一系列细胞因子信使或玉米基因 家族信使。
省略第二链的合成一当前基因表达分析方法的一个麻烦之处在于需 要合成第二链DNA,这反过来需要消化(或去除)RNA模板。虽然某些 反转录酶的DNA聚合酶活性可以催化DNA的合成，然而操作中mRNA 降解之后必须加入DNA聚合酶。 一个广泛使用的方法(5,545,522号美国
26专利，5,514,545号美国专利；Gubler, V., 1983 )依赖于随机引导，但需要 添加连接酶，这样就使需要的酶达到3个(在加入用于IVT的RNA聚合 酶之前)。但是本发明的方法允许方案大量简化，尤其当给定一系列感兴 趣信使时。
RNA聚合酶的结合以及其向构建体5，方向的前进，即使在没有双链启 动子序列存在的情况下，也能够高效发生。也就是说，在第一链(cDNA) 合成和未利用引物清除之后一优选通过捕获cDNA至固相的方式或柱纯化 的方式，IVT反应产生数个拷贝的选择子序列。优选地，加入非模板(NT) T7链做为IVT緩沖液的一个组分，以提高扩增所得至 10倍，这也可能提 示RNA聚合酶在遇到双链启动子序列时结合亲和力提高。
省略RNA酶H消化一在该基因表达分析的方法中，sst-IVT的模板形 成RT引物构建体的一部分，并且在cDNA合成之后保持单链形式存在。 实施例IV示例了为确定常规RNA酶H消化RNA的步骤-或者在通常的双 链IVT反应中允许第二链cDNA合成所需要的其他步骤-能否被省略而进 行的实验。利用sst-IVT反应的模型构建体(图IO)和完整的方案(图11 )， 实施例IV的试验表明，与T7启动子相邻的RNA/DNA杂合双链体的存在 不会影响NT链与模板启动子的退火和RNA的合成，这提示方案中可以省 略RNA酶H消化，更进一步充分简化试验。
固相IVT—如这里所述，固相IVT允许在反转录(或更普遍为引物延 长)之后执行磁性"清除"步骤，以便清除未被利用的引物。另外，如利用 适合设计的磁陷阱(如三种微机械制感应器，即，螺旋型，Ahn等，J. Mkromech. Microeng. 3, 1-9， 1993;螺线管型，Ahn等，正EE Transactions Comp， Packag. Manufact. Technol. H, 463-4的，I"4;以及螺旋管状弯曲型， Ahn等,IEEETrans. Indus. Elec 45, 866-875， 1998，全部通过引用并入)的 -磁性捕获可以将转录物限定在最小体积溶液里。在生物素化cDNA (以及 与之一起的退火的RNA靶标)被捕获到链霉亲和素包被的磁性颗粒之前， 优选将没有并入的生物素化dNTP清除(如碱性磷酸酶处理或柱纯化)以 提高捕获效率，否则捕获效率受到生物素化dNTP竟争的影响。
实施例V是利用生物素化单链DNART引物模型化合物，在溶液中和在固相上进行的sst-IVT反应效率的对比。发现在所选条件下，固相sst-IVT 的产量大约是液相反应的一半(图12)。然而，以浓度为10 fmol/pl的模 型化合物获得的固相反应的信号强度表明，该反应足够有效作为整合方案 的一部分。
两阶段IVT扩增一本发明的另一方面是在包含中间连接步骤的多轮 扩增中应用sst-IVT,进而可以跳过通常的cDNA合成(5,514,545号美国 专利)(图13 )。这种方法可以用于cDNA和第二链合成之后mRNA的检 测，以及基因组DNA的分析。这种方法中，起始的RCR用于扩增感兴趣 的序列，同时RCR产物的任一端引入T7启动子序列，任选在另一端引入 sel序列。
接着，通过常规IVT反应获得范围从102到103的RNA,利用含T7
(如11/218838号共同待决申请中描述的)。所获得的RNA接着可以作为 模板用于连接之后与启动子寡核苷酸和选择子寡核苷酸退火(图4所示第 一种方式)。得到的启动子-选择子构建体通过sst-IVT扩增，产生范围从 102到103的额外构建体。这样起始RNA可以被扩增105到106，并可以借 助通过相应的选择子序列检测。
差异"样品-对照，，的表达诿分析用于表达分析的标准方法基于感兴趣 样品"病变或患病的/变异的组织/细胞，，和一个参照"对照或正常"样品之间 的比较，或者基于转基因植物与正常植物的表达差异。本发明也可以利用 sst-IVT的优点确定相对基因表达。常规相对基因表达分析依赖于试验步骤 之后获得的"病变"和"对照，，样品不同信号比强度的确定(美国专利 6,110,426)。
同一策略可以用于相对基因表达监测。单独sst-IVT反应过程中在"病 变"RNA和"对照"RNA引入不同的荧光NTP而实现不同两种颜色的染色， 随后通过杂交捕获检测两种颜色的产物(图1)。也可以针对"病变"和"对 照，，RNA产物设计不同"选择子，，序列，这样单独sst-IVT反应就可以用单色检测。
相对基因表达语还可能利用单色消减检测方法(WO2005042763号美
28国专利，BAS)。为此目的，"病变"和"对照"选择子序列必须设计为反向互
补且能形成一个双链双链体。在RNA产物(即RNA和aRNA )检测的试 验阶段，病变和对照样品的独立反应在可以形成RNA-RNA双链体的条件
探针，可以捕获过量的RNA或aRNA产物，产物的检测可以通过RT eMAP 或杂交试验实现，如图1,显示"病变"样品中特定某基因或系列基因的缺 量或过量表达。
2.2等位基因计数
等位基因特异性反转录或等位基因特异性连接可以与sst-IVT整合用 于多重等位基因计数，比如选择性地确定在相似基因存在的情况下指定基 因的表达模式，以及检测等位基因多态性(Syvanen A. C" MO5 )。
2.2.1反转录介导的分析
等位基因特异性反转录与IVT整合的试验设计包含以下四个步骤(图
1. 等位基因特异性反转录引物与T7/选择子和反转录合成的cDNA退 火；(分析DNA时用DNA聚合酶进行引物延伸)
2. 清除未利用引物(使用这里所述的任一种方法)
3. 选择子序列的转录；和
4. 利用反转录或杂交进行所得RNA的芯片上检测。
本方法的原则类似于实施例II中描述的那些，除了靶标特异性引物的 3，末端针对特异等位基因进行设计，因此引物的延伸只有在引物和靶标在 引物序列的3，末端(或靠近3，末端)配对时才能发生。在一个优选实施方 案中，可以使用一对3，末端序列有差别的引物区分两个等位基因。
2.2.2连接介导的分析
利用RNA模板的等位基因特异性连接(5，686，243号美国专利和 2003/0082584 Al号美国专利申请)与IVT整合以确定等位基因特异性线 性扩增的试验设计包括以下四个步骤(图4):1. 两个寡核苷酸探针一"启动子"和"选择子"，与mRNA模板在指定的
感兴趣变异位点邻侧退火；
2. 连接探针产生一个完整的启动子-选择子构建体；
3. 选择子序列的转录；
4. 利用反转录或杂交进行所得RNA的芯片上检测
"启动子，，和"选择子"寡核苷酸一针对每一个感兴趣的靶标设计两个
与感兴趣位点的任一侧匹配的寡核苷酸。启动子和选择子寡核苷酸的连接 (利用T4连接酶或Taq DNA连接酶，New England Biolabs )得到一个完 整的启动子-选择子构建体。只有当启动子寡核苷酸序列的5'末端或选^^子 寡核苦S吏序列的3'末端与靶标序列在感兴趣位点匹配时，这种完整的构建 体才能形成。启动子-选择子构建体作为sst-IVT反应的模板，所述反应产 生选择子的RNA拷贝进而被检测。也就是说，不同于感兴趣等位基因的 耙标等位基因将不介导完整IVT启动子-选择子构建体的形成，所以不会 被计数。这样，这种方法能够在有其它mRNA序列存在的情况下计数特异 性mRNA序列，而这两种mRNA序列甚至可以相差一个核苷酸，例如实 施例VI中杂合玉米的某些基因家族(图14)以及更常见的其它基因家族。 相反，如果要计数所有的等位基因，可以提供多个简并引物寡核苷酸以在 指定位点与正常或变异的等位基因匹配。
通常在这种方式中，应该在开始sst-IVT之前清除或消化掉RNA模板 (利用标准方法)。计数mRNA时，加入启动子的非模板链(优选作为IVT 反应緩沖液的成分)可以提高反应的效率。本方法的一个主要优点是可以 省略纯化步骤未利用的引物不与选择子子序列连接，所以不能被检测。
另 一种选择是利用连接替代反转录，通过在引物-启动子-选择子构建 体上连接一个3，末端含捕获部分的第二"捕获，，寡核苷酸，以引入捕获部分 如生物素至sst-IVT模板链上(如图4,第二种方法)。用于mRNA计数时， 这种方法需要清除未利用的引物。
所得的生物素化构建体方便用于连接后的小体积浓缩或者将其与检 测微珠一起放入共装配阵列。3. DNA分析
本发明的方法容易适合用于gDNA或PCR产生的扩增子的分析。在 优选实施方案中，引物-启动子-选择子构建体可以根据感兴趣DNA子序列 延伸。这样，在构建体与单链DNA退火的条件下(如双链DNA靶标加热 变性)，当该构建体在3'末端或附近匹配时其在DNA聚合酶催化的反应中 得到延伸(图3 )。
另一种选择，为了在gDNA(或DNA扩增子)中引入T7序列，首先化 学方法(Maniatis T., 1982)降解双链靶标产生3，粘末端，可能与靶标特异性 构建体退火。接着，通过DNA聚合酶的链置换，引物得到延伸并由此引 入T7序列(图15)。在清除未利用靶标特异性引物之后，延长的产物用于 选择子子序列的sst-IVT扩增，之后进行检测，如图3所示。
3.1基因拷贝数多态性分析
已知染色体和基因的多拷贝的存在与一些失调有关，如唐氏综合症 (Dutta S.,2005 )和脊髓性肌萎缩症(SMA) ( Ogino S.,2004 )以及一些类 型的癌症乳腺癌(Seo, M. Y.,等，2004 )、皮肤癌(Sellers, W. R. 2005)和其 它。基因拷贝数可以预测患者对某个药物治疗的反应，如肺癌治疗用吉非 替尼(Hirsch F. R. 2005 )。因此常规临床应用需要迅速而方便的分析方法。
当仅对单个或少数等位基因感兴趣时，实践中经常如此，本发明的方 法优选与溶液中RNA的检测联合使用。为此可以使用多种标准方法，包 括杂交保护方式(Arnold等5,283,174和5,639,599号美国专利)或利用分 子信标的荧光能量转移(Veet等，2002)或者"环状"构型的探针，其在 转录退火时转化产生荧光变化(11/218838号美国专利申请，提交时间 9/2/2005 ).
在一个优选实施方案中，在预定量的感兴趣临床样品中加入含有递增 量参考样品(已知拷贝数)的小份样品，由强度和参考样品量做出的曲线 在强度轴的截距表示临床样品中基因的拷贝数。
当分子信标或"环状"探针(也见提交日期为11/16/2004序号为 60/628464美国申请中的相关"环状探针，，)展示在固相载体如微颗粒时，可
31以提高检测的灵敏度；磁性微颗粒可以提供额外的优势。与这些检测方法 整合后，本发明方法也可以实时监测扩增反应。
3.2等位基因区分
DNA聚合酶催化的延伸使用等位基因特异性引物，利用这里阐述的等 位基因特异性分析的方法，可以分析代表多个突变或多态性位点的DNA 序列的变异位点。同样地，以上阐述的用于RNA分析的由连接介导的分 析方法，以单链DNA作为连接模板很容易适合DNA的分析。与传统的连 接介导的等位基因和SNP区分方法(Schouten JP., 2002 )的主要差别是， 在连接之后运用IVT反应替代PCR扩增所述构建体。在RNA分析时，连 接介导的方法具有不需要清除寡核苷酸探针和引物的显著优点，这样有利 于实现类似方案。当本发明方法用于包含病毒病原体检测在内的病原体筛 选，尤其是与病毒RNA的浓缩以及其后的扩增和检测整合时，就特别需 要这个显著优点，如下更详细描述。
4.方案步骤的整合
4.1 IVT和同时的产物检测共装配微珠阵列
这里还阐述了利用平行的检测方式，优选随机编码阵列检测 (READ ),将产生RNA产物的gDNA、 cDNA或RNA的线性扩增和这 些产物的4企测进行整合的方法。
sst-IVT产生的a-sel RNA短转录物可以在其产生时就,皮4企测，例如通 过固相反转录延长捕获探针或通过分子信标捕获(同上)或"环状"构建体 的〗果针，其在转录退火的改变产生荧光变化(Vet, J.A.M., 2002)。为了增 强低离子强度条件下的捕获效率以进行有效的IVT，可以使用肽核酸 (PNA)捕获探针(见申请号No. 10/227,012)使其优点突出。
如上面所提及的，sst-IVT和其后多重检测的整合将省略方案中的多余 步骤，从而提高速度，减少试剂消耗，并且减少样品污染的可能和样品处 理的错误。分析和检测直接整合至芯片上，优选在闭合空间中，更为满意。 为此，本发明提出了反转录产生的RNA的IVT扩增和检测在芯片上上同 时发生的模式。
32在一个实施方案中，共装配编码微珠形成包含展示模板捕获探针和产 物分析探针的随机阵列。如图16所示，这种共装配阵列可以包含中性亲 和素包被的微珠(或磁性微珠)，以捕获生物素化CDNA (或展示其它捕获
成分，如抗体，由相应的引入cDNA靶标链的半抗原结合)，和展示带有 选择子序列的寡核苷酸探针的编码微珠，以检测sst-IVT反应产生的特异 RNA链(如引入标记核酸的延长之后)。
实施例VH是同时扩增和芯片上检测的一种可能实施方法。如图17所 示，这个同时发生的反应呈现一种剂量响应，芯片上模型生物素化双链 DNA的检测限为lfinol/|Lil。前面我们已经表明，固相IVT也可以利用单链 模板进行。这些结果表明整合sst-IVT和RT介导的探针延长用于检测是可 行的，且以一种使反应缩小放置在一个封闭空间的方式。这个共装配方式 使sst-IVT和同时发生的产物分析在一个总反应体积小于1毫升的体系中 进行(捕获cDNA或其它IVT或sst-IVT模板如连接的寡核苷酸探针对之 后)，优选小于50纳升(例如，利用一种构建体如序号为11/218838,提交 曰期9/2/2005的美国申请中所示)
4.2RNA捕获、扩增和多重检测
方法的相对简化允许其它步骤的整合，尤其是根据标准方法进行的磁 性颗粒对mRNA的捕获(5,759,820号美国专利)与sst-IVT以及多重检测 的整合。连接介导的RNA分析(这里特指病毒基因组RNA的检测，也可 见上文)，如图18所示，启动子-选择子构建体的两个组分与被捕获mRNA (或病毒RNA)链的匹配子序列退火，接着在编码微珠上进行与前面所述 的共装配阵列方式相似的连接-扩增和同时检测，而不需要除去未使用的启 动子。实际上，连接、sst-IVT和RT介导的延长可以在同一种緩冲液中进 行。
在溶液中用磁性颗粒捕获靶标，之后是编码微颗粒阵列的共装配，或 在一个已装配的编码微珠阵列上磁场介导的磁性捕获颗粒的沉淀进行产 物分析，可以将起始RNA浓缩到小体积中，其后的sst-IVT扩增产物也被 限定于此体积中。
以下实施例进一步阐述和说明本发明的方法和设备。实施例I. ssIVT反应的特征剂量响应和时间过程
两个不同的构建体，用作加或不加T7启动子非模板链的sst-IVT的模 板，这两个构建体长64 nt和62 nt,分别包含IL-2R和IL-4R mRNA的引 物序列，以及T7启动子模板链和一个独特的sel序列。为了说明这种方法 的潜在灵壽丈度，这两个引物的浓度在100-0.1 fmo1/10 pl rxn范围内变化。 37。C温育2h获得的RNA( MEGAshortscript T7试剂盒，Amion， cat#1354) 用于芯片上反转录，之后为编码微珠上产生信号的检测，该编码微珠功能 的实现通过其上与IL-2R和IL-4R选4奪子匹配的捕获探针(图5 )。在37°C 温育2、 4、 6和18h, IL-2R单链DNA的IVT反应的时间过程试验以同 样方法进行(图6)。
实施例II.柱纯化试验的灵敏度卡那霉素mRNA
试验第一步是cDNA的合成。RT引物构建体包含RT/T7/Sel序列，长 64nt,可以产生大约500nt长度的cDNA。使用如下试剂
附m4- (Promega, Cat.#C 1381)
Swpe^cn^TM-—链合成',賓凝(Invitrogen,Cat.#C 18080-051 )
M￡a4s/wrtoc">f r7试有盆(Ambion Cat#C1354)
Qv3 #右记dC7P(Amersham, Cat.#PA53021)
5&4 5eadC7nJ7 (BioArray Solution, Ltd)
i C7 ##试^/盒(Qiagen, #28104 )
所有反应在热循环器中进行。
为了解决剂量响应，用RNA酶处理过的DEPC处理的水(40U/|al RNA 酶14 |ul+DEPC水266 )il)制备下述mRNA稀释液1300、 100、 10、 1 和O.l fmol/(i1.
通过组合Mixl进行cDNA合成0.1 ^MRT/T7/Sel构建体1 |^1、 RNA (不同浓度)1 |il、 5xFS緩沖液2 |Lil、 DEPC水6 pl。试管在65。C温育5分钟，之后4°C温育10分钟。在温育过程中每个试管中加入以下Mix2: 5xFS 緩沖液2 |ul、 0.1 M DTT 2 |il、 10 mM dNTP混合物1 |til、 SuperscriptIII酶 (200U/|nl) 1 |^1、 DEPC处理的去离子水4 pl。 RT反应在50。C进行60分 钟，85。C温育5分钟使酶失活，接着4。C温育10分钟。根据产品说明，10 W最终的cDNA混合液利用QiagenPCR纯化试剂盒进行柱纯化。
加入1 |ul纯化的cDNA至10 (il IVT混合液，其中包含每种75 mM NTP
1 |al、 T7 10x反应緩冲液1 |ul、 T7酶混合液1 )il、 0.1 ^MT7NT成分1 |ul、 DEPC水2 pi, 37。C温育2h。
RNA产物的检测通过一个芯片上反转录标记的步骤，如下
10 pi所得IVT反应与10 |il RT混合液混合Superscrip皿酶(200 U/jul )1 |ul、 5xFS反应緩沖液2 )uil、 0.1 M DTT 1 pl、 10 dNTP(无dCTP )
2 |ul、 25 |aM Cy3-dCTP 1 |iil、 DEPC处理的去离子水3 由此得到的20 (il 产物放置到含Sel序列探针检测微珠的装配微珠阵列的顶端。然后将阵列 置于50。C温育15分钟，用20lalDEPC处理的去离子水洗涤三次。结果如 图7所示。
实施例m:纯化
试验确定最佳RT构建体浓度的范围，方法是不同浓度的构建体利用 柱纯化和Exo I消化整合进行试验。具体是，将ExoI处理或不处理的反 应混合液方欠在柱子上(Qiagen, Cat.#28104)。柱纯化之后，2 pi的部分洗 脱液直接用于sst-IVT反应，RNA产物通过芯片上RT介导的探针延长进 行检测(图8 )。 10 pi反应混合液包含1 pi构建体(不同浓度)、1 pi Exo I (New England Biolabs, NEB Cat.#M0293S )、 2 fil 5xFS反应緩沖液(参见 实施例II ), 37°C Exo I处理30分钟，接着80。C处理20分钟使Exo I失 活。虽然消化的最佳緩冲液是ExoI lOx緩沖液，但是FS緩沖液也可重现 Exo I处理试-验的真实环境。
实施例IV:省略RNA酶H消化步骤
35首先在模型系统中测定是否需要RNA酶H,其中假设退火至RNA的 寡核苷酸的配置与实际试验中的配置类似。RT/T7/Sel构建体与50 nt长的 IL-2R RNA退火产生该构建体，其中仅有构建体中的RT部分与RNA退火。 sst-IVT反应之后，产物通过反转录芯片上检测。图10的图例显示了不同 条件。RNA酶H(2U4d ljul,Invitrogen,Cat弁18021-014)37。C处理20分钟。
第二步，在整个试验(实施例II )柱纯化步骤之后，检测RNA酶H 消化或其不存在时的效果。为此，在10 |Lil纯化的cDNA中加入2 |Lil 5xFS 反应緩冲液、2 )il 0.1 M DTT和2 |ul RNA酶H 10 |iil。在没有RNA酶H消 化的对照反应中,加入4^il緩沖液。结果在图11中显示。
实施例V:固相sst-IVT反应
针对构建体的某一种浓度进行该反应，其中包含对照。在10 iil磁性 微珠(0.2 |um超樣i颗粒，Molecular probes, Cat# C-21476 )加入1 |til浓度 为100 fmol/|ul的3，末端生物素化的RT/T7/Sel单链DNA,孵育15分钟， 之后用10 mM PH值为8的Tris HC1充分洗涤。调整终体积至10 pi,其 中孩&朱中构建体的浓度为10fmol/iul(图12,第一列)。在固定构建体中加 入10 pi IVT混合液(参见实施例II ),反应混合液在37。C温育2h。利用 RTeMAP方法检测产物。第二列是同样条件只是没有洗涤的步骤，第三列 也是同样试验只是没有磁性微珠，即溶液种的IVT反应。三种反应中构建 体的浓度都调整至10 fmol/pl。
实施例VI:高度同源mRNA序列的区分-玉米近交品系
某些实施方案需要在成百或成千的靶标群中检测特异性靶标，且这耙 标群与感兴趣靶标有显著的序列同源性。通常这些实施方案需要除由杂交 介导的分析之外的一定程度的序列特异性。以上两种设计用于检测玉米醇 溶蛋白基因家族中高度同源成员的mRNA序列。在两个近交玉米品系B73 和BSSS53中，玉米醇溶蛋白基因的某些mRNA序列在945nt的全长序列 中呈现95%至99%的同源性。利用常规方法实现这些序列的检测和各自表
36达水平的评估是一个非常繁重的任务，需要测序大量克隆。
然而，整合通过反转录或连接在多态性位点进行的序列特异性延伸以
及其后的特异"选择子"序列的sst-IVT扩增，将有助于区别mRNA的同源 序列，同时以一种高度平行的分析方式确定这些信使各自的丰度。
图14说明多态性位点的位置和构建体3，末端连接或放置的可能位置。 对于某些复杂的序列区分，包括两个序列拥有同一个突变，而其中一个还 有另一个特异性突变(如基因16和17具有同一个T/G突变，这将它们从 多个序列群中和其它所有序列区分开来，但是基因31有一个独特的C/G 突变)，以上所说的方法具有优势，可以针对每一个相近的多态性位点设 计特定选择子序列。
实施例vn:芯片上扩增和检测反应同时进行
含T7启动子和28 nt长的转录序列(等同于卡那霉素mRNA的5，末 端)，且非模板链(NT) 3，末端被生物素化的DNA，以不同浓度用于微珠 阵列，起始孵育10分钟以促进捕获，然后过量的DNA可以通过洗涤清除。 20 |il同时IVT/RT反应混合物放在芯片表面，该反应混合物包括75 mM NTP每种2 nl、 T7 10x反应緩沖液2 pl、 T7酶混合液2 |iil、 0.1 |uM T7启 动子DT成分2 |ul、 10 dNTP混合液(无dCTP ) 2 |ul、 25 |LiM Cy3-dCTP 1 |il、 Supe證iptIII酶(200U/|il) 1 |al和DEPC处理的去离子水2 |li1。反应 在封闭空间中芯片上进行，包括37。C温育lh(IVT)，接着50。C温育15 分钟(RT介导的探针延长)。图17和图16分别为试验的结果和试验方案。
应该理解这里所用的术语、表述和实施例仅为示例，而不是限制性 的，并且本发明的范围仅在随后的权利要求中限定，并包括权利要求的主 题的所有等同物。除非权利要求中另有说明，否则权利要求中的过程和方 法步骤可以以任何顺序进行，包括权利要求中描述的顺序。
权利要求
1.一种用于检测样品中靶标子序列的存在或相对量的引物-启动子-选择子构建体，其包括以下三个子序列与所述靶标子序列互补的引物子序列，其5’末端与启动子子序列3’末端相邻，所述启动子子序列能够引导选择子子序列的转录，所述选择子子序列3’末端与所述启动子子序列的5’末端相邻，其中所述选择子子序列和其互补序列被设计为不与所述样品中预期存在的任何子序列退火。
2. 如权利要求1的构建体，其中所述启动子不引导所述引物子序列 的转录。
3. 如权利要求1的构建体，其中所述启动子为T7或T3或SP6启动 子子序列。
4. 如权利要求1的构建体，其中所述引物子序列能与模板退火和延伸。
5. 如权利要求l的构建体，其包括可识别的标签。
6. 如权利要求1的构建体，其中所述选择子子序列作为体外转录的 模板。
7. —种试剂盒，其包括多种不同类型的引物-启动子-选择子构建体 和一组寡核香酸，其中所述构建体各自用于检测样品中不同靶标子序列的存在或相对 量，所述构建体各自包括以下三个子序列与所述靶标子序列互补的引物 子序列，其5，末端与启动子子序列3'末端相邻，所述启动子子序列能够引 导选择子子序列的转录，所述选择子子序列3'末端与所述启动子子序列的 5'末端相邻；其中具有不同序列的所述寡核苷酸展示在不同编码的微颗粒上，并且 其中所述寡核苷酸能够与所述选择子子序列的转录产物退火。
8. 如权利要求7的试剂盒，其中所述不同类型的构建体各自的引物子序列和选择子子序列不同。
9. 如权利要求8的试剂盒，其中每个类型的构建体有不同的引物子序列和相同的选择子子序列。
10. 如权利要求7的试剂盒，其还包括能够掺入所述转录产物的经标 记的NTP。
11. 如权利要求10的试剂盒，其中所述NTP是光学标记的。
12. 如权利要求7的试剂盒，其中所述启动子为T7或T3或SP6启动 子子序列(模板链)。
13. 如权利要求12的试剂盒，其还包括能够与所述T7、 T3或SP6启 动子子序列形成双链体的非模板T7、 T3或SP6启动子子序列。
14. 如权利要求7的试剂盒，其还包括一组不同编码的微颗粒，所述 微颗粒适合结合不同类型的与所述转录产物互补的寡核苷酸。
15. 如权利要求7的试剂盒，其还包括一组经标记的ddNTP或dNTP,伸产物。
16. 如权利要求7的试剂盒，其还包括半抗原标记的ddNTP或dNTP。
17. 如权利要求16的试剂盒，其还包括磁性颗粒。
18. 如权利要求7的试剂盒，其还包括能够与所述样品中子序列退火 的寡核苷酸，该寡核苷酸定位至引物的靶向子序列的3，端或定位至所述引 物。
19. 如权利要求18的试剂盒，其中所述寡核苷酸是经标记的。
20. 如权利要求18的试剂盒，其中所述寡核苷酸包括所述启动子子 序列。
21. —种检测样品中指定子序列的相对丰度的方法，该方法包括(i)独特地将至少一个表示为引物的指定靶标子序列连接到至少一个选 择子序列，其中两者形成引物-启动子-选择子构建体的部分，所述构建体 包含三个子序列与所述耙标子序列互补的引物子序列，其5'末端与启动子子序列3，末端相邻，所述启动子子序列能够引导选#^子子序列的转录，所述选4奪子子序列3'末端与所述启动子子序列的5'末端相邻，其中所述选择子子序列 和其互补序列被设计为不与所述样品中预期存在的任何子序列退火；(ii) 扩增所述选"t奪子子序列；以及(iii) ;险测扩增样品的相对量。
22. 如权利要求21的方法，其中所述引物子序列和所述靶标子序列 术被扩增。
23. 如权利要求21的方法，其中所述选择子子序列的扩增是通过体 RNA。
24. 如权利要求21的方法，其中所述指定序列为包括mRNA和病 毒RNA的RNA、基因組DNA或PCR产物。
25. 如权利要求24的方法，其中所述指定靶标序列以能够与所述引 物子序列退火的形式存在。
26. 如权利要求24的方法，其中所述指定靶标序列为特定基因的等 位基因。
27. 如权利要求24的方法，其中所述独特连接的步骤包括退火所述 引物-启动子-选择子构建体的引物部分至所述指定靶标子序列。
28. 如权利要求27的方法，其还包括将已经退火至所述指定子序列 的构建体与未退火至指定子序列的构建体分离的步骤。
29. 如权利要求27的方法，其还包括延伸所述引物-启动子-选择子构 建体的引物部分的步骤。
30. 如权利要求29的方法，其中包括延伸引物的构建体与未被延伸 的那些分离。
31. 如权利要求28的方法，其中所述未被退火和未被延伸构建体与 未使用的标记ddNTP或dNTP或寡核苷酸的分离通过柱(尺寸排阻或亲和)分离、包括^ 兹分离的固相分离、酶(如核酸外切酶I、焦磷酸酶)处理或 者这些方法的任何的组合来进行。
32. 如权利要求29的方法，其中所述延伸通过模板介导的延伸或模 板介导的连接进行。
33. 如权利要求32的方法，其中延伸掺入标记的dNTP、 ddNTP或标记的寡核苷酸。
34. 如权利要求24的方法，其中所述被延伸的构建体被捕获到固相上。
35. 如权利要求34的方法，其中所述固相是磁性颗粒。
36. 如权利要求32的方法，其中所述延伸和连接是等位基因特异性的。
37. 如权利要求21的方法，其中所述检测扩增产物相对量的步骤是 通过展示在编码微颗粒上的探针的RT-酶催化延长，并且其中所述扩增产 物作为延长的模板。
38. 如权利要求37的方法，其中检测与扩增同时进行。
39. 如权利要求38的方法，其中所述同时的扩增和扩增产物检测发 生在100 nl或更小的反应体积内。
40. 如权利要求23的方法，其中所述IVT反应将可检测的光学信号 引入到所述RNA产物中。
41. 如权利要求21的方法，其中T7或T3或SP6启动子的非模板部 分在扩增前加入。
42. 如权利要求23的方法，其中所述检测所述扩增产物的相对量的 步骤是通过扩增产物退火至编码微颗粒上展示的捕获探针。
43. —种确定基因组样品(通常与肿瘤或其它病理性病症相关)中杂 合性缺失的方法，该方法使用一对等位基因特异性的引物-启动子-选择子 构建体，所述构建体各自包括以下三个子序列一个与指定靶标子序列互补的独特引物子序列，该引物子序列5'末端与启动子子序列3，末端相邻，所述启动子子序列能够引导独特的选^^子子序列的转录，所述选择子子序列的3，末端与所述启动子子序列的5'末端相邻，其中所述选择子子序列和其互补序列被设计为不与所述基因组样品中预期存在的任何子序列退火； 所述方法包括将第一独特选择子序列与感兴趣基因的正常等位基因独特连接，并且 将第二独特选择子序列与所述基因的变异等位基因独特连接；扩增所述选 择子序列；和确定表明所述扩增等位基因的相对丰度的信号强度；和 确定是否存在杂合性缺失。
44. 权利要求21所述方法，其用于基因表达分析、等位基因计数或等位基因拷贝数测定。
45. —种为基因表达分析目的而测定mRNA样品中存在的指定子序列 的相对量的方法，所述方法包括a) 提供包括所述指定子序列的mRNA样品；b) 提供包含(从3，到5'末端)引物子序列(与所述指定子序列的至 少一部分互补)、转录启动子子序列和选择子子序列的构建体，其中所述 转录启动子如下定向该转录启动子在合适条件下引导所述选择子子序列 的转录；c) 提供用于所述引物子序列和所述mRNA的退火以及用于所述引物 子序列延伸的条件；d) 除去未与mRNA退火的构建体；e) 转录所述选择子序列，持续指定时段；f) 确定通过所述转录产生的RNA的量；和g) 使所述RNA的量与采用不同指定子序列和不同选择子的相同反应 步骤a)至f)所产生的RNA的量对比相关，以表明所述样品中包括所述 指定子序列的mRNA的相对数量以及所述指定子序列的相对量。
46. 如权利要求45的方法，其中所述mRNA是从细胞中分离出来的， 或产生于基因组DNA、 PCR产物或所述扩增产物。
47. 如权利要求45的方法，其中所述反转录引物-启动子-选择子构建 体包括T7或T3或SP6启动子子序列。
48. 如权利要求45的方法，其中所述选择子子序列及其反向互补子 序列都不与所述mRNA样品中的子序列互补。
49. 如权利要求48的方法，其中几种构建体用来测定所述mRNA中几种指定子序列的量，并且每种构建体具有与特定引物子序列相关的特定 选择子子序列。
50. 如权利要求45的方法，其中所述转录产生与所述选择子子序列 互补的标记或未标记RNA子序列。
51. 如权利要求45的方法，其中RNA通过与展示在微颗粒上的寡核 苷酸退火而被捕获。
52. 如权利要求51的方法，其中所述RNA的量通过记录与被捕获的 标记RNA寡核苷酸相关的光学信号来确定。
53. 如权利要求52的方法，其中在转录过程中使用标记核苷酸将能 够产生光信号的部分加入所述RNA。
54. 如权利要求53的方法，其中所述标记核苷酸含有荧光基团。
55. 如权利要求54的方法，其中所述标记核苷酸含有可以用含荧光 基团的抗体修饰的半抗原。
56. 如权利要求51的方法，其中所述寡核苷酸被展示在编码微颗粒上。
57. 如权利要求55的方法，其中在捕获后，延伸所述寡核苷酸并且 加入标记的或未标记的dNTP或ddNTP。
58. 如权利要求51、 55或56任一项的方法，其中通过使所述被捕获 RNA寡核苦酸相关联的光信号强度与所述不同指定子序列相关联的光信 号强度相关联，来确定所述RNA的相对量。
59. 如权利要求45的方法，该方法还包括监测样品中相同或不同 mRNA中存在的其他指定子序列，对每个所述其他指定子序列进行相同的 步骤a)至g)。
60. 如权利要求48的方法，该方法还包括第二T7启动子子序列与所 述T7启动子子序列形成双链体。
61. 如权利要求45的方法，其中所述步骤c)还包括如下步骤用包 含连接的半抗原的核苷酸延伸所述构建体，并且将所述延伸的构建体捕获 到带有所述半抗原的配体的微颗粒。
62. 如权利要求61的方法，其还包括在从未退火或未延伸的构建体 纯化之后，捕获所述延伸的构建体。
63. 如权利要求61的方法，其中所述半抗原为生物素或抗原部分， 并且所述配体为链霉亲和素或中性亲和素或抗体。
64. 如权利要求61的方法，其中所述微颗粒在微珠阵列中，所述阵 列还含有权利要求51的微颗粒。
65. —种测定DNA或RNA样品中多态性或突变位点的存在的方法， 其包括a) 提供包含所述多态性或突变位点的DNA或RNA样品；b) 为每一个感兴趣的所述位点提供一个构建体，所述构建体(从3， 到5，末端)包含引物子序列(与所述指定子序列的至少一部分互补且含 有指定核苷酸，其被设计为当退火至所述RNA或DNA时与所述位点的互 补核芬酸对齐)、转录启动子子序列和选择子子序列，并且其中所述转录录;— 。 — ' 、 、c) 提供用于所述引物子序列在3'方向延伸的条件以产生延长的构建 体，所述延长的构建体带有与所述RNA或DNA的对齐区域中那些核苷酸 互补的核苷酸，前提是所述引物中的指定核苷酸与所述位点的核苷酸互 补，"5]。述延长的构建体与过量的未被利用的构建体分离；f) 转录结合到所述固体载体上的所述延长构建体的所述选择子序列， 或转录没有结合到所述固体载体上的所述延长构建体的所述选4奪子序列，以产生RNA;和g) 测定产生的RNA的存在，其表明所述引物子序列中所述指定核苷 酸与感兴趣多态性或突变位点互补。
66. 如权利要求65的方法，其中所述亲和半抗原为生物素或抗原部 分并且所述配体为链霉亲和素或中性亲和素或抗体。
67. 如权利要求65的方法，其中所述固体载体为磁性或顺磁性的， 并且在标记结合至所述固体载体之后，所述固体载体被磁性吸引以固定它 们的位置，然后清除未被利用的构建体。
68. 如权利要求65的方法，其中所述固体载体为亲和柱的形式，或 者分离包括柱分离。
69. 如权利要求65的方法，其中所述mRNA在所述构建体的延伸之 后被清除或保留在原处。
70. 如权利要求69的方法，其中所述清除是通过RNA酶H催化的消化。
71. 如权利要求48的方法，其中在柱分离之前进行核酸外切酶I处理。
72. 如权利要求48的方法，其中产生的RNA通过退火至展示在编码 微颗粒上的寡核苷酸而被捕获，其中不同编码的微颗粒展示不同的寡核苷酸。
73. 如权利要求48的方法，其中在捕获之后，所述寡核苷酸在包括 标记dNTP或标记ddNTP的反应中得到延长，以产生被标记的延长产物。
74. 如权利要求48的方法，其中RNA通过标记NTP的掺入而得到 标记。
75. 如权利要求73或74的方法，其中来自已知的展示特异寡核苷酸的微颗粒的信号鉴定多态性或突变的存在。
76. 如权利要求48的方法，其中针对每一个感兴趣的多态性或突变 位点提供一对构建体，其中包含第一选择子子序列的一个构建体成员在其 3，末端具有使所述引物与正常等位基因互补的核苷酸，并且包含第二选才奪 子子序列的第二构建体成员在其3，末端具有使所述引物与变异等位基因互 补的核苦酸。
77. —种测定DNA或RNA样品中多态性或突变位点的存在的方法， 其包括a) 提供包含所述多态性或突变位点的DNA或RNA样品；b) 为每一个所述感兴趣的位点提供第一寡核香酸和构建体，所述第 一寡核苷酸和所述构建体的一个具有在对齐并退火至所述RNA或DNA时与所述感兴趣位点的核苷酸互补的核苷酸，并且其中所述第一寡核苷酸和 所述构建体的另外一个具有与紧邻所述感兴趣位点核苷酸的核苷酸对齐 的各自末端核苷酸(各自为5，或3');所述第一寡核苷酸全部或部分互补 于所述RNA或DNA中的子序列，其可以被标记或可以有与其相连的标记； 所述构建体包括(从3，到5'末端)引物子序列(与所述指定子序列的至少 一部分互补)、转录启动子子序列和选择子子序列，并且其中所述转录启录； 。 — ' ' 、c) 提供连接所述第一核苷酸与所述构建体的条件以产生连接产物；d) 提供清除过量构建体的条件；e )转录结合或未结合到所述固体载体的所述连接产物的所述选择子序 列以产生RNA或标记RNA,其中利用标记NTP进行RNA合成；和f)确定所产生的RNA的存在，如果存在，其表明所述第一核苷酸中 的或者所述构建体中的对齐核苷酸适当地与所述感兴趣位点的核苷酸互补。
78. —种用于测定DNA或RNA样品中多态或突变位点的存在的方法， 其包括a) 提供包含所述多态或突变位点的mRNA样品；b) 为每一个所述感兴趣的位点提供第一部分和构建体，其中所述第 一部分和所述构建体的一个具有在对齐并退火至所述RNA或DNA时与所 述感兴趣位点的核苷酸互补的核苷酸，并且其中所述第一部分和所述构建 体的另外一个具有与所述感兴趣位点核苷酸紧邻的核苷酸对齐的各自末 端核普酸(各自为5'或3，)；所述第一部分全部或部分互补于所述RNA或 DNA中的子序列，其可以被标记或可以有与其相连的标记，并且其中所述 第一部分具有如下定向的转录启动子使所述启动子在合适条件下引导选 择子子序列的转录；所述构建体包括(从3，到5，末端)引物子序列(与所 述指定子序列的至少一部分互补)和选择子子序列，c) 提供连接所述第一核苷酸与所述构建体的条件以产生连接产物；d) 提供任选清除过量构建体的条件；e )转录结合到所述固体载体的所述连接产物或者未连接到所述固体载 体的所述连接产物的所述选l奪子序列，以产生RNA;和f)测定所产生的RNA的存在，如果存在，其表明所述第一部分中的 或者所述构建体中的对齐核苷酸适当地与所述感兴趣位点的核苷酸互补。
79. 如权利要求77或78的方法，其还包括如下步骤延伸带有标记 dNTP的所述第一部分(或所述连接产物的第一部分)，其中所述标记提供 能被配体结合的位点；并通过所述标记结合到展示在固体载体表面的配体 来从所述mRNA分离所述连接产物。
80. 如权利要求77或78的方法，其中所述第一部分为标记的或未被 标记的。
81. 如权利要求77或78的方法，其用于检测样品中来自病毒的mRNA 的存在，利用带有磁性捕获微珠和编码检测微珠的共装配微珠阵列，所述 磁性捕获微珠携带与感兴趣mRNA杂交的寡核苷酸，所述编码检测微珠携 带表征步骤a)至e)的反应所产生的RNA的寡核苷酸。
82. 如;K利要求65、 77或78的方法，其通过测定多重实验中产生的 正常RNA与变异RNA的相对数量和比例，用以确定受试者对于所述多重实验中的突变和/或多态性位点是否为纯合、杂合或正常。
83. 如权利要求65、 77或78的方法，其用于确定受试者中的杂合性 缺失。
84. —种如图13所显示和阐述的方法。
全文摘要
所公开的是一个单链的引物-启动子-选择子构建体，其包含(从3′到5′方向)一个与靶标退火的引物子序列，一个T7启动子或其它启动子子序列(模板链)，和一个选择子子序列。引物可以通过模板介导的延长作用而得到延伸，所述延长作用包括反转录或连接至其它寡核苷酸。启动子序列定向为与引物延伸方向相反以引导体外转录(IVT)，其中选择子子序列作为IVT的模板。选择子与感兴趣的靶标子序列相关，其和扩增产物是与样品中存在的其它序列不同的独特子序列。所述构建体可用于测定样品中指定子序列的存在和相对丰度、多重基因表达分析、多重等位基因计数、确定多态性/突变位点和杂合性缺失。
文档编号C12P19/34GK101589154SQ200680041636
公开日2009年11月25日 申请日期2006年9月21日 优先权日2005年9月21日
发明者娜塔莉亚·科泽瓦, 迈克尔·休 申请人:佰尔瑞溶液有限公司