4碳醇的发酵生产的利记博彩app

专利名称：4碳醇的发酵生产的利记博彩app
与相关申请的交叉参考
本申请根据35 U.S.C.§119要求于2005年9月29日提交的美国临时申请系列号60/721677，和2006年6月16日提交的美国临时申请系列号60/814470的优先权。
发明领域 本发明涉及工业微生物学和醇生产领域。更具体而言，1-丁醇经由重组微生物的工业发酵来生产。

背景技术：
丁醇是重要的工业化学药品，用作燃料添加剂、塑料工业中的原料化学药品、以及食物和调味剂工业中的食物级提取剂。每年有100-120亿磅丁醇通过石油化学方法进行生产，并且关于这种日用化学药品的需要将很可能增加。
用于化学合成1-丁醇的方法是已知的，例如Oxo Process、ReppeProcess、和巴豆醛氢化(Ullmann＇s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，德国，第5卷，第716-719页)。这些方法使用来源于石油化学的原材料并且一般是昂贵且不是环境友好的。来自植物衍生原材料的1-丁醇生产将使温室气体排放减到最小且将代表本领域的进展。
用于通过其他有机化学药品的生物转化生产1-丁醇的方法也是已知的。例如，Muramoto等人(JP63017695)描述了使用假单胞菌属(Pseudomonas)菌株用于从醛生产醇包括丁醇的方法。此外，Kuehnle等人(EP 1149918)描述了通过各种赤红球菌(Rhodococcus ruber)菌株氧化烃来制备1-丁醇和2-丁醇的方法。
通过发酵生产丁醇的方法也是已知的，其中最普遍的方法生产丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物，且被称为ABE方法(Blaschek等人，美国专利号6,358,717)。通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵是认识最久的已知工业发酵之一，并且负责生产这些溶剂的途径和基因已得到报道((Girbal等人，Trends inBiotechnology 1611-16(1998))。然而，实际发酵仍是相当复杂且难以控制的。自20世纪50年代以后ABE发酵已不断下降，且现在几乎所有丁醇都经由如上所述的石油化学途径生产。在一般的ABE发酵中，丁酸、丙酸、乳酸和乙酸首先通过丙酮丁醇梭菌生产，培养物pH降低且经历代谢“蝶形(butterfly)”移动，随后形成1-丁醇、丙酮、异丙醇和乙醇。在常规ABE发酵中，来自葡萄糖的1-丁醇产量低，一般为约15％且很少超过25％。因此，在常规ABE发酵中的1-丁醇浓度通常低于1.3％。
通过消除所有其他溶剂副产品使来自ABE方法的1-丁醇生产达到最大的尝试尚未完全成功，且因此该方法产生相当大量不能用作汽油添加剂的丙酮。用于发酵生产丁醇的其中1-丁醇是唯一产物的方法将代表本领域的进展。
因此需要用于生产1-丁醇作为单一产物、环境负责、有成本效益的方法。本发明通过发现表达1-丁醇生物合成途径的重组微生物生产宿主解决了这个需要。
发明概述 本发明提供了具有工程改造的1-丁醇生物合成途径的重组微生物。工程改造的微生物可以用于1-丁醇的商业生产。因此本发明提供了包含编码多肽的至少一种DNA分子的重组微生物宿主细胞，所述多肽催化选自下述的底物至产物转化 a)乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A b)乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A c)3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A d)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A e)丁酰辅酶A至丁醛和 f)丁醛至1-丁醇； 其中所述至少一种DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的且其中所述微生物宿主细胞生产1-丁醇。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产1-丁醇的方法，所述方法包括 i)提供包含编码多肽的至少一种DNA分子的重组微生物宿主细胞，所述多肽催化选自下述的底物至产物转化 a)乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A b)乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A c)3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A d)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A e)丁酰辅酶A至丁醛和 f)丁醛至1-丁醇； 其中所述至少一种DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的；和 ii)使(i)的所述宿主细胞在由此生产1-丁醇的条件下与可发酵的碳底物接触。
附图简述和序列描述 根据形成本申请部分的下述详细描述、附图和伴随的序列描述可以更充分地理解本发明。


图1显示了1-丁醇生物合成途径。标记为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”和“f”的步骤表示下文描述的底物至产物转化。
下述序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(＂Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules＂)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(管理条令(Administrative Instructions)的规则5.2和49.5(a-bis)，以及部分(section)208和附录C)。对于核苷酸和氨基酸序列使用的符号和格式遵守37 C.F.R.§1.822中所述规则。
表1 基因和蛋白质SEQ ID NO.概括 SEQ ID NOs17-44是用于扩增1-丁醇生物合成途径基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs45-72是用于测序的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs73-75是用于构建实施例9中所述转化载体的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO76是在本文中称为CaTER的密码子最优化的CAC0462基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO77是在本文中称为EgTER(opt)的密码子最优化的EgTER基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO78是在本文中称为ald(opt)的密码子最优化的ald基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO79是质粒pFP988的核苷酸序列。
SEQ ID NO＇s 80-127、160-185、和190-207是用于克隆、测序或筛选本文所述的1-丁醇生物合成途径基因的克隆、测序或PCR筛选引物的核酸序列，且在表4和5中更充分地描述。
SEQ ID NO156是cscBKA基因簇的核苷酸序列。
SEQ ID NO157是蔗糖水解酶(CscA)的氨基酸序列。
SEQ ID NO158是D-果糖激酶(CscK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO159是蔗糖透性酶(CscB)的氨基酸序列。
SEQ ID NO186是实施例17中所述的密码子最优化的tery基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO187是由密码子最优化的tery基因(SEQ ID NO186)编码的丁酰辅酶A脱氢酶(ter)的氨基酸序列。
SEQ ID NO188是实施例17中所述的密码子最优化的aldy基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO189是由密码子最优化的aldy基因(SEQ ID NO188)编码的丁酰脱氢酶(ald)的氨基酸序列。
SEQ ID NO208是实施例14中使用的模板DNA的核苷酸序列。
发明详述 本发明涉及使用重组微生物生产1-丁醇的方法。本发明满足了许多商业和工业需要。丁醇是具有多种应用的重要工业日用化学药品，其中它作为燃料或燃料添加剂的潜力特别重要。尽管只是4碳醇，但丁醇具有的能含量类似于汽油的那种，且可以与任何化石燃料掺合。丁醇作为燃料或燃料添加剂是有利的，因为当在标准内燃机中燃烧时，它只产生CO2，且产生很少或没有SOx或NOx。此外丁醇的腐蚀性少于迄今为止最优选的燃料添加剂乙醇。
除了其作为生物燃料或燃料添加剂的效用，丁醇具有影响新兴的燃料电池工业中的氢分布问题的潜力。燃料电池现今受到与氢运输和分布有关的安全关心的困扰。丁醇可以容易地对于其氢含量进行改造，且可以通过现有加油站以燃料电池或车辆所需的纯度进行分配。
最后本发明从植物衍生的碳源生产丁醇，从而避免了与用于丁醇生产的标准石油化学方法相关的负面环境影响。
下述定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
如本文使用的，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，且不预期指本发明的任何单个实施方案，而是包含如说明书和权利要求中所述的所有可能实施方案。
“ABE”是关于丙酮-丁醇-乙醇发酵方法的缩写。
术语“1-丁醇生物合成途径”意指从乙酰辅酶A(乙酰CoA)生产1-丁醇的酶途径。
术语“乙酰辅酶A乙酰转移酶”指催化2个乙酰辅酶A分子转化成乙酰乙酰辅酶A和辅酶A(CoA)的酶。优选的乙酰辅酶A乙酰转移酶是对短链酰基辅酶A和乙酰辅酶A具有底物优先的乙酰辅酶A乙酰转移酶(在正向中的反应)，且分类为E.C.2.3.1.9[EnzymeNomenclature 1992，Academic Press，San Diego]；尽管，具有更广泛底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也将起作用。乙酰辅酶A乙酰转移酶可从许多来源获得，例如大肠杆菌(GenBank NosNP_416728(SEQ IDNO129)，NC_000913(SEQ ID NO128)；NCBI(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)，丙酮丁醇梭菌(GenBank NosNP_349476.1(SEQ ID NO2)，NC_003030(SEQ ID NO1)；NP_149242(SEQID NO4)，NC_001988(SEQ ID NO3)，枯草芽孢杆菌(GenBankNosNP_390297(SEQ ID NO131)，NC_000964(SEQ ID NO130))，和啤酒糖酵母(GenBank NosNP_015297(SEQ ID NO133)，NC_001148(SEQ ID NO132))。
术语“3-羟丁酰辅酶A脱氢酶”指催化乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟丁酰辅酶A的酶。3-羟丁酰辅酶A脱氢酶可以是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖性的，对(S)-3-羟丁酰辅酶A或(R)-3-羟丁酰辅酶A具有底物优先，且分别分类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。此外，3-羟丁酰辅酶A脱氢酶可以是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性的，对(S)-3-羟丁酰辅酶A或(R)-3-羟丁酰辅酶A具有底物优先，且分别分类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟丁酰辅酶A脱氢酶可从许多来源获得，例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_349314(SEQ ID NO6)，NC_003030(SEQID NO5))，枯草芽孢杆菌(GenBank NOsAAB09614(SEQ ID NO135)，U29084(SEQ ID NO134))，富养罗尔斯通氏菌(GenBankNOsYP_294481(SEQ ID NO137)，NC_007347(SEQ ID NO136))，和真养产碱菌(GenBank NOsAAA21973(SEQ ID NO139)，J04987(SEQ ID NO138))。
术语“巴豆酸酶”指催化3-羟丁酰辅酶A转化成巴豆酰辅酶A和H2O的酶。巴豆酸酶可以对(S)-3-羟丁酰辅酶A或(R)-3-羟丁酰辅酶A具有底物优先，且分别分类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶可从许多来源获得，例如大肠杆菌(GenBank NOsNP_415911(SEQ ID NO141)，NC_000913(SEQ ID NO140))，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_349318(SEQ ID NO8)，NC_003030(SEQID NO6))，枯草芽孢杆菌(GenBank NOsCAB13705(SEQ ID NO143)，Z99113(SEQ ID NO142))，和豚鼠气单胞菌(GenBank NOsBAA21816(SEQ ID NO145)，D88825(SEQ ID NO144))。
术语“丁酰辅酶A脱氢酶”指催化巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶。丁酰辅酶A脱氢酶可以是NADH依赖性或NADPH依赖性的，且分别分类为E.C.1.3.1.44和E.C.1.3.1.38。丁酰辅酶A脱氢酶可从许多来源获得，例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_347102(SEQID NO10)，NC_003030(SEQ ID NO9)))，小眼虫(GenBankNOsQ5EU90SEQ ID NO147)，AY741582SEQ ID NO146))，丘链霉菌(GenBank NOsAAA92890(SEQ ID NO149)，U37135(SEQ ID NO148))，和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank NOsCAA22721(SEQ ID NO151)，AL939127(SEQ IDNO150))。
术语“丁醛脱氢酶”指使用NADH或NADPH作为辅因子，催化丁酰辅酶A转化成丁醛的酶。对于NADH具有优先的丁醛脱氢酶被称为E.C.1.2.1.57，且可从下述来源获得例如，拜氏梭菌(GenBank NOsAAD31841(SEQ ID NO12)，AF157306(SEQ ID NO11))和丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_149325(SEQ ID NO153)，NC_001988(SEQ ID NO152))。
术语“丁醇脱氢酶”指使用NADH或NADPH作为辅因子，催化丁醛转化成1-丁醇的酶。丁醇脱氢酶可从下述来源获得例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_149325(SEQ ID NO153)，NC_001988SEQ ID NO152；注这种酶具有醛和醇脱氢酶活性)；NP_349891(SEQ ID NO14)，NC_003030(SEQ ID NO13)；和NP_349892(SEQ ID NO16)，NC_003030(SEQ ID NO15))和大肠杆菌(GenBankNOsNP_417484(SEQ ID NO155)，NC_000913(SEQ ID NO154))。
术语“兼性厌氧菌”指在需氧和厌氧环境中都能够生长的微生物。
术语“碳底物”或“可发酵的碳底物”指能够由本发明的宿主生物代谢的碳源，且特别是选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物或其混合物的碳源。
术语“基因”指能够表达为特定蛋白质的核酸片段，任选包括在编码序列前(5＇非编码序列)和后(3＇非编码序列)的调节序列。“天然基因”指如在自然界中与其自身调节序列一起发现的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在自然界中未在一起发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或调节序列和编码序列来源于相同来源，但排列方式不同于自然界中发现的那种。“内源基因”指在生物基因组中其天然位置中的天然基因。“外来”或“异源基因”指在宿主生物中通常未发现，但通过基因转移引入宿主生物内的基因。外来基因可以包含插入非天然生物内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化程序引入基因组内的基因。
如本文使用的，术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5＇非编码序列)、之内或下游(3＇非编码序列)，且影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3＇。启动子可以整体来源于天然基因，或由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含包含合成的DNA区段。本领域技术人员理解，不同启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或响应不同环境或生理条件表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到因为在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全限定，所以不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接的”指单个核酸片段上的核酸序列的结合，从而使得一种的功能受另一种的影响。例如，当启动子能够影响编码序列表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，它与那种编码序列可操作地连接。编码序列可以与调节序列在有义或反义方向上可操作地连接。
如本文使用的，术语“表达”指来源于本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达可以指mRNA翻译成多肽。
如本文使用的，术语“转化”指核酸片段转移到宿主生物内，从而导致遗传学稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带并非细胞中央代谢部分的基因的染色体外元件，且通常为环状双链DNA片段的形式。此类元件可以是来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性或环状单或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已连接或重组到独特构建体内，所述独特构建体能够将关于所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3＇非翻译序列引入细胞内。“转化盒”指包含外来基因且具有除外来基因外的元件的特定载体，所述元件促进特定宿主细胞的转化。“表达盒”指包含外来基因且具有除外来基因外的元件的特定载体，所述元件允许那种基因在外来宿主中增强的表达。
如本文使用的，术语“密码子简并”指允许核苷酸序列变异而不影响编码的多肽的氨基酸序列遗传密码中的性质。技术人员将充分知道由特定宿主细胞在指定给定氨基酸的核苷酸密码子选择中显示的“密码子偏倚”。因此，当合成用于在宿主细胞中改善的表达的基因时，希望这样设计基因，从而使得其密码子选择频率接近宿主细胞的优选密码子选择频率。
当术语“密码子最优化的”指用于转化各种宿主的基因或核酸分子编码区时，它指基因或核酸分子编码区中的密码子改变，以反映宿主生物的一般密码子选择而不改变由DNA编码的多肽。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，且由下述参考文献描述Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文＂Maniatis＂)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience出版(1987)。
1-丁醇生物合成途径 利用碳水化合物的微生物使用Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途径、Entner-Doudoroff途径和戊糖磷酸循环作为中央代谢途径，以提供能量和细胞前体用于生长和维持。这些途径共有中间物甘油醛-3-磷酸，且最终直接或与EMP途径组合形成丙酮酸盐。随后，丙酮酸盐经由多种方法转化成乙酰辅酶A(乙酰-CoA)，包括与丙酮酸脱氢酶复合体、丙酮酸-甲酸裂合酶、和丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶反应。乙酰辅酶A充当例如脂肪酸、氨基酸和次生代谢物产生中的关键中间物。糖转化成乙酰辅酶A的组合反应产生能量(例如，腺苷-5＇-三磷酸，ATP)和还原当量(例如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH)。NADH和NADPH必须再循环至其氧化形式(分别为NAD+和NADP+)。在无机电子受体(例如O2、NO3-和SO42-)的存在下，还原当量可以用于增加能量库；可替代地，可以形成还原的碳副产品。起因于碳水化合物发酵的乙醇和1-丁醇产生是后者的例子。
通过提供如图1中所示从乙酰辅酶A到1-丁醇的完整1-丁醇生物合成途径，本发明使得能够用重组微生物从碳水化合物来源生产1-丁醇。由于不存在基因或缺乏合适的基因调节，一般在微生物群落中缺乏的这种生物合成途径，包括下述底物至产物的转化 a)如例如由乙酰辅酶A乙酰转移酶催化的，乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A； b)如例如通过3-羟丁酰辅酶A脱氢酶催化的，乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A； c)如例如通过巴豆酸酶催化的，3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A； d)如例如通过丁酰辅酶A脱氢酶催化的，巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A； e)如例如通过丁醛脱氢酶催化的，丁酰辅酶A至丁醛；和 f)如例如通过丁醇脱氢酶催化的，丁醛至1-丁醇。
该途径不需要ATP且产生NAD+和/或NADP+，因此和产生乙酰辅酶A的中央代谢途径平衡。天然生物通过发酵产生1-丁醇的能力是罕见的且最显著地由拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌例示。关于丙酮丁醇梭菌的基因组织和基因调节已得到描述(L.Girbal和P.Soucaille，Trends inBiotechnology 21611-16(1998))。然而，这些酶活性中的许多还与可替代途径相关，例如烃利用、脂肪酸氧化、和聚羟基链烷酸酯代谢。因此，在提供从乙酰辅酶A到1-丁醇的重组途径中，存在实现个别反应步骤的许多选择，且本领域技术人员将能够利用公众可用序列以构建相关途径。本领域已知和1-丁醇生物合成途径构建中有用的许多代表性基因列表在下文表2中列出。
表2 1-丁醇途径基因来源 用于1-丁醇生产的微生物宿主 用于1-丁醇生产的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。用于1-丁醇生产的微生物宿主优选对1-丁醇是耐受的，从而使得得率不受丁醇毒性限制。在1-丁醇高效价水平上有代谢活性的微生物不是本领域众所周知的。尽管丁醇耐受突变体已从产溶剂菌(solventogenic)梭菌(Clostridia)中分离，但关于其他潜在有用细菌菌株的丁醇耐受性的可用信息很少。关于细菌中的醇耐受性比较的大多数研究暗示丁醇比乙醇更有毒(de Cavalho等人，Microsc.Res.Tech.64215-22(2004)和Kabelitz等人，FEMS Microbiol.Lett.220223-227(2003))。Tomas等人(J.Bacteriol.1862006-2018(2004))报道了丙酮丁醇梭菌发酵期间的丁醇得率可能受丁醇毒性限制。丁醇对丙酮丁醇梭菌的主要作用是膜功能的破坏(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.501238-1243(1985))。
选择用于1-丁醇生产的微生物宿主优选对1-丁醇是耐受的，且能够将碳水化合物转化成1-丁醇。关于合适微生物宿主选择的标准包括下述对1-丁醇的固有耐受性、高的葡萄糖利用率、用于基因操作的遗传工具的有效性、和产生稳定染色体改变的能力。
对于1-丁醇具有耐受性的合适宿主菌株可以通过基于菌株的固有耐受性的筛选来鉴定。微生物对1-丁醇的固有耐受性可通过下述测量测定当在极限培养基中生长时负责50％生长速率抑制的1-丁醇浓度(IC50)。IC50值可以使用本领域已知的方法来测定。例如，目的微生物可以在各种量的1-丁醇的存在下生长，且通过测量600纳米处的光密度来监控生长速率。倍增时间可以由生长曲线的对数部分来计算，且用作生长速率的测量。产生50％生长抑制的1-丁醇浓度可以从百分比生长抑制对1-丁醇浓度的图来测定。优选地，宿主菌株对于1-丁醇应当具有大于约0.5％重量/体积的IC50。
用于1-丁醇生产的微生物宿主还应以高比率利用葡萄糖。大多数微生物能够利用碳水化合物。然而，某些环境微生物不能利用碳水化合物至高效率，且因此将不是合适的宿主。
基因修饰宿主的能力是任何重组微生物生产所必需的。基因转移技术的方式可以是电穿孔、接合、转导或天然转化。广泛范围的宿主接合质粒和药物抗性标记是可用的。基于可以在那种宿主中起作用的抗生素抗性标记的性质使克隆载体适合于宿主生物。
微生物宿主还必须通过缺失各种基因进行处理，以灭活关于碳流的竞争途径。这要求指导灭活的转座子或染色体整合载体的有效性。此外，生产宿主应当顺应化学诱变，从而使得可以获得改善固有1-丁醇耐受性的突变。
基于上述标准，用于生产1-丁醇的合适微生物宿主包括但不限于，梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊氏酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)的成员。优选宿主包括大肠杆菌、真养产碱菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌和啤酒糖酵母。
生产宿主的构建 包含必需基因的重组生物可以使用本领域众所周知的技术进行构建，所述必需基因将编码使可发酵的碳底物转化成1-丁醇的酶促途径。在本发明中，编码1-丁醇生物合成途径酶的基因可以如上所述从各种来源分离，所述酶即乙酰辅酶A乙酰转移酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、和丁醇脱氢酶。
从细菌基因组获得所需基因的方法是分子生物学领域常见和众所周知的。例如，如果基因序列是已知的，那么合适的基因组文库可以通过限制性内切核酸酶消化来制备，且可以用与所需基因序列互补的探针来筛选。一旦序列分离，DNA就可以使用标准引物指导的扩增方法例如聚合酶链反应(Mullis，美国专利号4,683,202)进行扩增，以获得适合于使用合适载体转化的DNA量。对于在异源宿主中表达的密码子最优化的工具是容易获得的。用于密码子最优化的一些工具基于宿主生物的GC含量是可用的。某些示例性微生物宿主的GC含量在表3中给出。
表3 微生物宿主的GC含量 一旦相关途径基因被鉴定和分离，它们就可以通过本领域众所周知的方法转化到合适的表达宿主内。对于多种宿主细胞转化有用的载体或盒是常见的，且从公司例如

(Madison，WI)，Invitrogen Co rp.(Carlsbad，CA)，Stratagene(La JoIIa，CA)，和New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)商购可得。一般地，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含具有转录起始控制的基因5＇区域，和控制转录终止的DNA片段3＇区域。2个控制区都可以来源于与转化的宿主细胞同源的基因，尽管应当理解此类控制区也可以来源于对于选择作为生产宿主的特定物种非天然的基因。
用于驱动相关途径编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子是众多的，且是本领域技术人员熟悉的。事实上能够驱动这些遗传元件的任何启动子都适合于本发明，包括但不限于，CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、和GPM(对于在糖酵母菌属中表达有用)；AOX1(对于在毕赤氏酵母属中表达有用)；和lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac，和trc(对于在大肠杆菌、产碱菌属和假单胞菌属中表达有用)；amy、apr、npr启动子和对于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌中表达有用的各种噬菌体启动子；nisA(对于在革兰氏阳性细菌中表达有用，Eichenbaum等人Appl.Environ.Microbiol.64(8)2763-2769(1998))；和合成P11启动子(对于在植物乳杆菌中表达有用，Rud等人，Microbiology 1521011-1019(2006))。
终止控制区也可以来源于对优选宿主天然的各种基因。任选地，终止位点可能是不必要的，然而，如果包括，那么它是最优选的。
某些载体能够在广泛范围的宿主细菌中复制且可以通过接合进行转移。pRK404的完整和注解的序列以及3种相关载体-pRK437、pRK442和pRK442(H)是可用的。这些衍生物已被证明是用于在革兰氏阴性细菌中基因操作的有价值的工具(Scott等人，Plasmid50(1)74-79(2003))。广宿主范围lnc P4质粒RSF1010的几种质粒衍生物与可以在一系列革兰氏阴性细菌中起作用的启动子也是可用的。质粒pAYC36和pAYC37具有活性启动子连同多克隆位点，以允许异源基因在革兰氏阴性细菌中表达。
染色体基因替代工具也是广泛可用的。例如，广宿主范围复制子pWV101的热敏变体已进行修饰以构建质粒pVE6002，所述质粒pVE6002可以用于在一系列革兰氏阳性细菌中产生基因替代(Maguin等人，J.Bacteriol.174(17)5633-5638(1992))。此外，体外transposomes可用于在来自商业来源例如

的多种基因组中产生随机突变。
1-丁醇生物合成途径在各种优选微生物宿主中的表达在下文更详细地描述。
1-丁醇生物合成途径在大肠杆菌中的表达 对于大肠杆菌转化有用的载体或盒是常见的且从上文列出的公司商购可得。例如，如实施例11中所示，1-丁醇生物合成途径的基因可以从各种梭菌菌株中分离、克隆到修饰的pUC19载体内，且转化到大肠杆菌NM522内。1-丁醇生物合成途径在几种其他大肠杆菌菌株中的表达在实施例13中描述。
1-丁醇生物合成途径在红串红球菌中的表达 一系列大肠杆菌-红球菌属穿梭载体可用于在红串红球菌中表达，包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 6261-68(2003))。此外，一系列启动子可用于在红串红球菌中的异源基因表达(参见例如Nakashima等人，Appl.Envir.Microbiol.705557-5568(2004)，和Tao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.2005，DOI 10.1007/s00253-005-0064)。红串红球菌中染色体基因的靶向的基因破坏可以使用由Tao等人，同上和Brans等人(Appl.Envir Microbiol.662029-2036(2000))描述的方法来制备。
如上所述1-丁醇生产所需的异源基因可以最初克隆到pDA71或pRhBR71中且转化到大肠杆菌内。载体随后可以如Kostichka等人，同上所述通过电穿孔转化到红串红球菌内。重组体可以在包含葡萄糖的合成培养基中生长，且1-丁醇的生产可以使用本领域已知方法来跟踪。
1-丁醇生物合成途径在枯草芽孢杆菌中的表达 关于在枯草芽孢杆菌中基因表达和生成突变的方法也是本领域众所周知的。例如，如实施例12中所述，1-丁醇生物合成途径的基因可以从各种梭菌菌株中分离、克隆到修饰的pUC19载体内，且转化到枯草芽孢杆菌BE1010内。此外，如实施例14中所述，1-生物合成途径的6种基因可以分成2个操纵子用于表达。将该途径的前3种基因(thl、hbd和crt)整合到枯草芽孢杆菌BE1010染色体内(Payne和Jackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))。将后3种基因(EgTER、ald和bdhB)克隆到表达质粒内，且转化到携带整合的1-丁醇基因的芽孢杆菌菌株内。
1-丁醇生物合成途径在地衣芽胞杆菌中的表达 在枯草芽孢杆菌中复制的大多数质粒和穿梭载体可以用于通过原生质体转化或电穿孔转化地衣芽孢杆菌。例如，1-丁醇生产所需的基因可以克隆到质粒pBE20或pBE60衍生物内(Nagarajan等人，Gene 114121-126(1992))。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(例如参见Fleming等人Appl.Environ.Microbiol.，61(11)3775-3780(1995))。构建用于在枯草芽孢杆菌中表达的质粒也可以转化到地衣芽孢杆菌内，以产生生产1-丁醇的重组微生物宿主。
1-丁醇生物合成途径在浸麻类芽胞杆菌中的表达 质粒可以如上文关于在枯草芽孢杆菌中表达所述进行构建，且通过原生质体转化用于转化浸麻类芽孢杆菌，以产生生产生产1-丁醇的重组微生物宿主。
1-丁醇生物合成途径在真养产碱菌(富养罗尔斯通氏菌)中的表达 关于在富养罗尔斯通氏菌中基因表达和生成突变的方法是本领域已知的(参见例如，Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.，60(10)3585-3591(1994))。关于1-丁醇生物合成途径的基因可以克隆到上文所述的任何广宿主范围载体中，且进行电穿孔以产生生产1-丁醇的重组体。罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)中的多羟基丁酸盐途径已得到详细描述，且修饰富养罗尔斯通氏菌基因组的多种遗传技术是已知的，且那些工具可应用于工程改造1-丁醇生物合成途径。
1-丁醇生物合成途径在恶臭假单胞菌中的表达 关于在恶臭假单胞菌中基因表达的方法是本领域已知的(参见例如Ben-Bassat等人，美国专利号6,586,229，所述专利引入本文作为参考)。例如，丁醇途径基因可以插入到pPCU18内，且这种连接的DNA可以电穿孔到电转化感受态的恶臭假单胞菌DOT-T1 C5aAR1细胞内，以产生生产1-丁醇的重组体。
1-丁醇生物合成途径在啤酒糖酵母中的表达 关于在啤酒糖酵母中基因表达的方法是本领域已知的(参见例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)。基因在酵母中的表达一般需要启动子、随后为目的基因、和转录终止子。许多酵母启动子可以用于构建关于编码1-丁醇生物合成途径的基因的表达盒，包括但不限于，组成型启动子FBA、GPD和GPM，以及诱导型启动子GAL1、GAL10和CUP1。合适的转录终止子包括但不限于，FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t和GAL1t。如实施例17中所述，合适的启动子、转录终止子和1-丁醇生物合成途径的基因可以克隆到酵母2微米(2μ)质粒内。
1-丁醇生物合成途径在植物乳杆菌中的表达 乳杆菌属属于乳杆菌目(Lactobacillales)科，且在枯草芽孢杆菌和链球菌属(Streptococcus)转化中使用的许多质粒和载体可以用于乳杆菌属。合适载体的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183175-182(1996)；和O＇Sullivan等人，Gene 137227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.621481-1486(1996))；接合质粒pMG1(Tanimoto等人，J.Bacteriol.1845800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.634581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.671262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.381899-1903(1994))。来自植物乳杆菌的几种质粒已得到报道(例如，vanKranenburg R，Golic N，Bongers R，Leer RJ，de Vos WM，Siezen RJ，KleerebezemM.Appl.Environ.Microbiol.2005Mar；71(3)1223-1230)。例如，1-丁醇生物合成途径在植物乳杆菌中的表达在实施例18中描述。
1-丁醇生物合成途径在屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和粪肠球菌中的表达 肠球菌属属于乳杆菌目科，且在乳杆菌属、枯草芽孢杆菌和链球菌属转化中使用的许多质粒和载体可以用于肠球菌属。合适载体的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183175-182(1996)；和O＇Sullivan等人，Gene 137227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.621481-1486(1996))；接合质粒pMG1(Tanimoto等人，J.Bacteriol.1845800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.634581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.671262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.381899-1903(1994))。使用来自乳球菌属(Lactococcus)的nisA基因的粪肠球菌的表达载体也可以使用(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998)。此外，用于在屎肠球菌染色体中基因替代的载体可以使用(Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72334-345(2006))。例如，1-丁醇生物合成途径在粪肠球菌中的表达在实施例19中描述。
发酵培养基 本发明中的发酵培养基必须包含合适的碳底物。合适的底物可以包括但不限于，单糖例如葡萄糖和果糖、寡糖例如乳糖或蔗糖、多糖例如淀粉或纤维素或其混合物，和来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、蔗糖蜜、和大麦芽。此外碳底物也可以是已证实代谢转化为关键生物化学中间物的单碳底物，例如二氧化碳、或甲醇。除了单和二碳底物，也已知甲基营养生物利用许多其他含碳化合物，例如甲胺、葡萄胺和多种氨基酸用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32.Editor(s)Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.PublisherIntercept，Andover，UK)。类似地，各种假丝酵母属(Candida)物种将代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153485-489(1990))。因此预期本发明中利用的碳源可以包含广泛多样的含碳底物，且将只受宿主选择限制。
尽管预期所有上文提及的碳底物及其混合物都适合于本发明，但优选碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖。
除了合适的碳源，发酵培养基必须包含本领域技术人员已知的，适合于培养物生长和促进1-丁醇生产所需酶促途径的合适矿物质、盐、辅因子、缓冲液及其他组分。
培养条件 细胞一般在约25℃-约40℃温度下在合适培养基中生长。本发明中合适的生长培养基是常见的商业制备培养基，例如Luria Bertani(LB)液体培养基、沙氏葡萄糖(Sabouraud Dextrose)(SD)液体培养基或酵母培养基(YM)液体培养基。其他确定成分或合成生长培养基也可以使用，并且关于特定微生物生长的合适培养基将是微生物学或发酵科学领域技术人员已知的。已知直接或间接调节分解代谢物阻抑的试剂的使用，例如环状腺苷2＇3＇-一磷酸也可以掺入发酵培养基内。
用于发酵的合适pH范围为pH5.0-pH9.0，其中pH6.0-pH8.0作为初始条件是优选的。
发酵可以在需氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微需氧条件是优选的。
在发酵培养基中生产的1-丁醇量可以使用本领域已知的许多方法来测定，例如，高效液相层析(HPLC)或气相层析(GC)。
工业分批和连续发酵 本方法使用分批发酵法。传统分批发酵是其中培养基组成在发酵开始时设定，且在发酵期间不实施人工改变的封闭系统。因此，在发酵开始时，用所需一种或多种生物接种培养基，且允许发酵发生而不向系统中添加任何东西。然而，一般地“分批”发酵是就碳源添加而言的分批，且通常在控制因素例如pH和氧浓度方面进行尝试。在分批系统中，系统的代谢物和生物量组成不断改变直至发酵停止时。在分批培养中，细胞适度(moderate)通过静态滞后期至高生长对数期，且最后至其中生长速率减小或停止的稳定期。如果未处理，那么稳定期的细胞将最终死亡。对数期的细胞一般负责终产物或中间物的大量生产。
关于标准分批系统的变化是补料分批系统(Fed-Batch system)。补料分批发酵方法也适合于本发明，且除了底物随发酵进展以增量添加之外，包含一般的分批系统。当分解代谢物阻抑倾向于抑制细胞代谢且希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。补料分批系统中的实际底物浓度测量是困难的，且因此基于可测量因素例如pH、溶解氧和废气例如CO2的分压变化来估计。分批和补料分批发酵是本领域常见和众所周知的，并且例子可以在下述参考文献中找到Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227，(1992)，所述参考文献引入本文作为参考。
尽管本发明以分批模式来进行，但预期该方法将适应于连续发酵法。连续发酵是其中向生物反应器中连续添加确定成分发酵培养基，且同时取出等量条件培养基用于加工的开放系统。连续发酵一般使培养物维持在恒定高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或许多因素。例如，一种方法将使限制营养物例如碳源或氮水平维持在固定比率，且允许所有其他参数保持适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统努力维持稳定状态生长条件，且因此由于培养基排出的细胞丧失必须针对发酵中的细胞生长速率进行平衡。对于连续发酵方法调节营养物和生长因子的方法以及使产物发酵速率达到最大的技术是工业微生物学领域众所周知的，且各种方法由Brock同上详细描述。
预期本发明可以使用分批、补料分批或连续方法进行实践，且任何已知发酵模式都将是合适的。此外，预期细胞可以作为全细胞催化剂固定化在底物上，且实施用于1-丁醇生产的发酵条件。
从发酵培养基分离1-丁醇的方法 生物生产的1-丁醇可以使用本领域已知方法从发酵培养基进行分离。例如，固体可以通过离心、过滤、倾析等从发酵培养基中取出。随后，1-丁醇可以使用例如蒸馏、液液提取、或基于膜的分离的方法从发酵培养基分离，所述发酵培养基已如上所述进行处理以取出固体。因为1-丁醇与水形成低沸点、共沸混合物，所以蒸馏只能用于使混合物分离直至其共沸组成。蒸馏可以与另一种分离方法组合使用，以获得大约在共沸混合物的分离。可以与蒸馏组合使用以分离和纯化1-丁醇的方法包括但不限于，倾析、液液提取、吸附、和基于膜的技术。此外，1-丁醇可以使用共沸蒸馏使用共沸剂进行分离(参见例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)。
1-丁醇-水混合物形成不均态共沸混合物，从而使得蒸馏可以与倾析组合使用以分离和纯化1-丁醇。在这种方法中，将包含1-丁醇的发酵液体培养基蒸馏至接近共沸组成。随后，将共沸混合物浓缩，且通过倾析使1-丁醇与发酵培养基分开。倾析的水相可以作为回流送回第一个蒸馏柱。富含1-丁醇的倾析的有机相可以通过在第二个蒸馏柱中蒸馏进一步得到纯化。
1-丁醇还可以使用液液提取与蒸馏组合从发酵培养基中分离。在这种方法中，1-丁醇使用液液提取用合适的溶剂从发酵液体培养基中提取。含1-丁醇的有机相随后进行蒸馏以使1-丁醇与溶剂分开。
蒸馏与吸附组合也可以用于从发酵培养基分离1-丁醇。在这种方法中，将包含1-丁醇的发酵液体培养基蒸馏至接近共沸组成，且随后剩余的水通过使用吸附剂例如分子筛去除(Aden等人LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-CurrentDilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，June 2002)。
此外，蒸馏与全蒸发组合可以用于从发酵培养基分离和纯化1-丁醇。在这种方法中，将包含1-丁醇的发酵液体培养基蒸馏至接近共沸组成，且随后剩余的水经由全蒸发通过亲水膜去除(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。
实施例 本发明在下述实施例中进一步限定。应当理解这些实施例在指出本发明的优选实施方案的同时，仅作为举例说明而给出。由于上文讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以进行本发明的各种变化和修饰以使其适应各种用途和条件。
一般方法 实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，且由下述参考文献描述Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory PressCold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)，T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)，和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由GreenePublishing Assoc and Wiley-lnterscience出版(1987)。
适合于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域众所周知的。适合于在下述实施例中使用的技术可以如下述参考文献中所述找到Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Phillips，eds)，American Society for Microbiology，Washington，DC.(1994))或Thomas D.Brock in BiotechnologyATextbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。除非另有说明，用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制酶和材料都得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wl)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。
在下述实施例中用于克隆的寡核苷酸引物在表4中给出。用于测序或筛选克隆的基因的引物在表5中给出。所有寡核苷酸引物都由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)合成。
表4 寡核苷酸克隆引物 表5 测序和PCR筛选引物 用于测定培养基中的1-丁醇浓度的方法 培养基中的1-丁醇浓度可以通过本领域已知的许多方法进行测定。例如，具体高效液相层析(HPLC)法使用购自Waters Corporation(Milford，MA)的Shodex SH-1011柱与Shodex SH-G保护柱，其具有折射率(RI)检测。层析分离使用流速为0.5mL/分钟的0.01M H2SO4作为流动相和50℃的柱温来完成。1-丁醇在使用的条件下具有52.8分钟的保留时间。可替代地，气相层析(GC)法是可用的。例如，具体GC法使用HP-INNOWax柱(30m x 0.53mm id，1μm膜厚度，AgilentTechnologies，Wilmington，DE)，其具有火焰离子化检测器(FID)。载气是流速为4.5mL/分钟的氦，使用恒定排出压力于150℃测量；注射器分流在200℃时为125；烤箱温度为45℃1小时，以10℃/分钟45-220℃，和220℃5分钟；和于240℃使用FID检测，其具有26mL/分钟氦补充气体。1-丁醇的保留时间为5.4分钟。使用Varian CP-WAX58(FFAP)CB柱(25m x 0.25mm id X 0.2μm膜厚度，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)的类似GC法也可以使用。
缩写含义如下“s”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“psi”表示磅/平方英寸，“nm”表示纳米，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mm”表示毫米，“nm”表示纳米，“mM”表示毫摩尔浓度(millimolar)，“M”表示摩尔浓度(molar)，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克和“ng”表示纳克，“PCR”表示聚合酶链反应，“OD”表示光密度，“OD600”表示在600nm波长处测量的光密度，“OD550”表示在550nm波长处测量的光密度，“kDa”表示千道尔顿，“g”表示重力加速度，“rpm”表示每分钟转数，“bp”表示碱基对，“kbp”表示千碱基对，“％w/v”表示重量/体积百分比，“％v/v”表示体积/体积百分比，“HPLC”表示高效液相层析，且“GC”表示气相层析。
实施例1 乙酰辅酶A乙酰转移酶的克隆和表达 这个实施例的目的是在大肠杆菌中表达乙酰辅酶A乙酰转移酶，在本文中也称为乙酰乙酰辅酶A硫解酶。乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因thlA从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大肠杆菌中表达。thlA基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA扩增，从而导致产生1.2kbp产物。
来自丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)的基因组DNA购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，或如下所述从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)培养物分离。
来自丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)的基因组DNA由厌氧生长的培养物制备。梭菌属菌株在塞好和卷曲的100mL Bellco血清瓶(BellcoGlass Inc.，Vineland，NJ)的10mL梭菌生长培养基(Lopez-Contreras等人，Appl.Env.Microbiol.69(2)，869-877(2003))中，在厌氧室中于30℃生长。接种物是来自2X YTG板(Kishii，等人，AntimicrobialAgents & Chemotherapy，47(1)，77-81(2003))在2.5L MGCAnaeroPakTM(Mitsubishi Gas Chemical America Inc，New York，NY)中于37℃生长的单个菌落。
基因组DNA使用Gentra

试剂盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；目录号D-6000A)，使用制造商说明书的修改(Wong等人，Current Microbiology，32，349-356(1996))进行制备。thlA基因通过PCR使用引物N7和N8(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因组DNA进行扩增，所述引物N7和N8分别作为SEQ ID NO21和22给出。其他PCR扩增试剂在制造商的试剂盒例如Kod HiFi DNAPolymerase(Novagen Inc.，Madison，WI；目录号71805-3)中提供，且根据制造商的规程使用。扩增在DNA Thermocycler GeneAmp 9700(PE Applied Biosystems，Foster city，CA)中进行。
对于表达研究，使用Gateway克隆技术(Invitrogen Co rp.，Carlsbad，CA)。进入载体(entry vector)pENTR/SD/D-TOPO允许定向克隆且为目的基因提供SD序列。目的载体pDEST14使用T7启动子用于表达无标签的基因。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPOthlA。将pENTR构建体转化到大肠杆菌Top10(Invitrogen)细胞内，且根据制造商的建议进行铺平板。转化体生长过夜，且使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA；目录号27106)根据制造商的建议制备质粒DNA。提交克隆用于由M13正向和反向引物(参见表5)测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N7SeqF1和N7SeqR1(参见表5)以对PCR产物完全测序，所述N7SeqF1和N7SeqR1分别作为SEQ IDNOs47和48给出。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2给出。
为了生成表达克隆，通过重组将thlA基因转移至pDEST14载体以产生pDEST14thlA。将pDEST14thlA载体转化到BL21-AI细胞内。将转化体接种到补加了50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基内且生长过夜。等分试样的过夜培养物用于接种补加了50μg/mL氨苄青霉素的50mLLB。培养物于37℃伴随振荡温育直至OD600达到0.6-0.8。将培养物分成2个25-mL培养物，且将阿拉伯糖加入瓶之一至0.2重量％的终浓度。阴性对照瓶不用阿拉伯糖诱导。瓶于37℃伴随振荡温育4小时。细胞通过离心进行收获，且将细胞沉淀重悬浮于50mM MOPS，pH7.0缓冲液中。细胞通过超声处理或通过弗氏压碎器来破坏。将全细胞溶解产物离心，从而产生上清液或无细胞提取物和沉淀或不溶性级分。将等分试样的每种级分(全细胞溶解产物、无细胞提取物和不溶性级分)重悬浮于SDS(MES)加样缓冲液(Invitrogen)中，加热至85℃ 10分钟，且实施SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel，目录号NP0322Box，Invitrogen)。如由核酸序列推导的预期分子量约41kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物中但不存在于未诱导的对照中。
无细胞提取物中的乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性通过监控303nm处吸光度中的减少作为Mg2+-乙酰乙酰辅酶A复合物降解来测量。标准测定条件为100mM Tris-HCl pH8.0，1mM DTT(二硫苏糖醇)和10mMMgCl2。使混合物(cocktail)于37℃平衡5分钟；随后加入无细胞提取物。反应用添加0.05mM乙酰乙酰辅酶A加0.2mM辅酶A来起始。蛋白质浓度通过Bradford方法或通过Bicinchoninic Kit(Sigma，目录号BCA-1)来测量。牛血清清蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)在2种情况下用作标准。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的0.27μmolmg-1min-1比较，诱导的培养物中的ThlA蛋白质比活性测定为16.0μmolmg-1min-1。
实施例2 乙酰辅酶A乙酰转移酶的克隆和表达 这个实施例的目的是在大肠杆菌中表达乙酰辅酶A乙酰转移酶，在本文中也称为乙酰乙酰辅酶A硫解酶。乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因thlB从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大肠杆菌中表达。thlB基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA扩增。
thlB基因以与实施例1中所述的thlA基因相同的方式克隆和表达。丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA通过PCR使用引物N15和N16(参见表4)来扩增，所述引物N15和N16分别作为SEQ ID NOs27和28给出，从而产生1.2kbp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPOthlB。提交克隆用于由M13正向和反向引物测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N15SeqF1和N16SeqR1(参见表5)以对PCR产物完全测序，所述N15SeqF1和N16SeqR1分别作为SEQ ID NOs49和50给出。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4给出。
为了生成表达克隆，通过重组将thlB基因转移至pDEST14(Invitrogen)载体以产生pDEST14thlB。将pDEST14thlB载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如由核酸序列推导的预期分子量约42kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物中但不存在于未诱导的对照中。酶测定如实施例1中所述进行。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的0.28μmol mg-1min-1比较，诱导的培养物中的ThlB蛋白质比活性测定为14.9μmol mg-1min-1。
实施例3 3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的克隆和表达 这个实施例的目的是从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)克隆hbd基因且在大肠杆菌中表达它。hbd基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因组DNA扩增。
hbd基因使用实施例1中所述方法进行克隆和表达。hbd基因通过PCR使用引物N5和N6(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物N5和N6分别作为SEQ ID NO19和20给出，从而产生881bp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPOhbd。提交克隆用于由M13正向和反向引物测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N5SeqF2和N6SeqR2(参见表5)以对PCR产物完全测序，所述N5SeqF2和N6SeqR2分别作为SEQ ID NOs51和52给出。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6给出。
为了生成表达克隆，通过重组将hbd基因转移至pDEST 14(Invitrogen)载体以产生pDEST14hbd。如实施例1中所述，将pDEST14hbd载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如由核酸序列推导的预期分子量约31kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物中但不存在于未诱导的对照中。
如通过340nm处吸光度中的减少测量的，通过测量NADH氧化率来测定羟丁酰辅酶A脱氢酶活性。标准测定混合物包含50mM MOPS，pH7.0，1mM DTT和0.2mM NADH。使混合物于37℃平衡5分钟，且随后加入无细胞提取物。反应通过添加底物0.1mM乙酰乙酰辅酶A来起始。在一种一般测定法中，与未诱导的培养物中的0.885μmol mg-1min-1比较，诱导的培养物中的BHBD蛋白质比活性测定为57.4μmolmg-1min-1。
实施例4 巴豆酸酶的克隆和表达 这个实施例的目的是从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆crt基因且在大肠杆菌中表达它。crt基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA扩增。
crt基因使用实施例1中所述方法进行克隆和表达。crt基因通过PCR使用引物N3和N4(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物N3和N4分别作为SEQ ID NO17和18给出，从而产生794bp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPOcrt。提交克隆用于由M13正向和反向引物测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ IDNO7和SEQ ID NO8给出。
为了生成表达克隆，通过重组将crt基因转移至pDEST 14(Invitrogen)载体以产生pDEST14crt。如实施例1中所述，将pDEST14crt载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如由核酸序列推导的预期分子量约28kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物中的量比未诱导的对照中的多得多。
巴豆酸酶活性如Stern(Methods Enzymol.1，559-566，(1954))所述进行测定。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的47μmolmg-1min-1比较，诱导的培养物中的巴豆酸酶蛋白质比活性测定为444μmol mg-1min-1。
实施例5 丁酰辅酶A脱氢酶的克隆和表达 这个实施例的目的是在大肠杆菌中表达丁酰辅酶A脱氢酶，在本文中也称为反式-2-烯酰辅酶A还原酶。CAC0462基因，推定的反式-2-烯酰辅酶A还原酶同源物从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大肠杆菌中表达。CAC0462基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA扩增。
CAC0462基因使用实施例1中所述方法进行克隆和表达。CAC0462基因通过PCR使用引物N17和N21(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物N17和N21分别作为SEQ ID NO29和30给出，从而产生1.3kbp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPOCAC0462。提交克隆用于由M13正向和反向引物测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N22SeqF1(SEQ ID NO53)、N22SeqF2(SEQ ID NO54)、N22SeqF3(SEQ ID NO55)、N23SeqR1(SEQ ID NO56)、N23SeqR2(SEQID NO57)、和N23SeqR3(SEQ ID NO58)(参见表5)以对PCR产物完全测序。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO9和SEQ ID NO10给出。
为了生成表达克隆，通过重组将CAC0462基因转移至pDEST 14(Invitrogen)载体以产生pDEST14CAC0462。如实施例1中所述，将pDEST14CAC0462载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。通过SDS-PAGE的分析显示在阴性对照或诱导的培养物中没有预期分子量的超表达的蛋白质。丙酮丁醇梭菌CAC0462基因使用许多罕见的大肠杆菌密码子。为了避免密码子选择问题，将pRARE质粒(Novagen)转化到具有pDEST14CAC0462载体的BL21-A1细胞内。用携带pRARE载体的培养物重复使用阿拉伯糖诱导的表达研究。预期分子量约46kDa的蛋白质存在于诱导的培养物中但不存在于未诱导的对照中。
反式-2-烯酰辅酶A还原酶活性如Hoffmeister等人(J.Biol.Chem.280，4329-4338(2005))所述进行测定。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的0.0128μmol mg-1min-1比较，诱导的培养物中的TERCAC0462蛋白质比活性测定为0.694μmol mg-1min-1。
实施例6 丁醛脱氢酶(乙酰化)的克隆和表达 这个实施例的目的是从拜氏梭菌(ATCC 35702)克隆ald基因且在大肠杆菌中表达它。ald基因使用PCR从拜氏梭菌(ATCC 35702)基因组DNA扩增。
ald基因使用实施例1中所述方法进行克隆和表达。ald基因通过PCR使用引物N27F1和N28 R1(参见表4)从拜氏梭菌(ATCC 35702)基因组DNA(如实施例1中所述由厌氧生长的培养物制备)进行扩增，所述引物N27F1和N28 R1分别作为SEQ ID NO31和32给出，从而产生1.6kbp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPOald。提交克隆用于由M13正向和反向引物测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N31SeqF2(SEQ ID NO59)、N31SeqF3(SEQ ID NO60)、N31SeqF4(SEQ ID NO61)、N32SeqR1(SEQ ID NO72)、N31SeqR2(SEQID NO62)、N31SeqR3(SEQ ID NO63)、N31SeqR4(SEQ ID NO64)、和N31SeqR5(SEQ ID NO65)(参见表5)以对PCR产物完全测序。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO11和SEQ ID NO12给出。
为了生成表达克隆，通过重组将ald基因转移至pDEST14(Invitrogen)载体以产生pDEST14ald。如实施例1中所述，将pDEST14ald载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如由核酸序列推导的预期分子量约51kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物中但不存在于未诱导的对照中。
如Husemann等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.31435-444(1989))所述，如通过340nm处吸光度中的增加测量的，通过监控NADH的形成来测定酰化醛脱氢酶活性。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的0.01μmol mg-1min-1比较，诱导的培养物中的Ald蛋白质比活性测定为0.106μmol mg-1min-1。
实施例7 丁醇脱氢酶的克隆和表达 这个实施例的目的是从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)克隆bdhB基因且在大肠杆菌中表达它。bdhB基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因组DNA扩增。
bdhB基因使用实施例1中所述方法进行克隆和表达。bdhB基因通过PCR使用引物N11和N12(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物N11和N12分别作为SEQ ID NO25和26给出，从而产生1.2kbp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPObdhB。翻译起始密码子也通过引物序列从“GTG”变成“ATG”。提交克隆用于由M13正向和反向引物测序，所述M13正向和反向引物分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N11SeqF1(SEQ ID NO66)、N11SeqF2(SEQ ID NO67)、N12SeqR1(SEQ ID NO68)、和N12SeqR2(SEQ ID NO69)(参见表5)以对PCR产物完全测序。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO13和SEQID NO14给出。
为了生成表达克隆，通过重组将bdhB基因转移至pDEST14(Invitrogen)载体以产生pDEST14bdhB。如实施例1中所述，将pDEST14bdhB载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如由核酸序列推导的预期分子量约43kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物但不存在于未诱导的对照中。
如Husemann和Papoutsakis同上所述，如通过340nm处吸光度中的减少测量的，由NADH的氧化率来测定丁醇脱氢酶活性。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的0.022μmol mg-1min-1比较，诱导的培养物中的BdhB蛋白质比活性测定为0.169μmol mg-1min-1。
实施例8 丁醇脱氢酶的克隆和表达 这个实施例的目的是从丙酮丁醇梭菌824克隆bdhA基因且在大肠杆菌中表达它。bdhA基因使用PCR从丙酮丁醇梭菌824基因组DNA扩增。
bdhA基因使用实施例1中所述方法进行克隆和表达。bdhA基因通过PCR使用引物N9和N10(参见表4)从丙酮丁醇梭菌824基因组DNA进行扩增，所述引物N9和N10分别作为SEQ ID NO23和24给出，从而产生1.2kbp产物。正向引物掺入紧邻翻译起始密码子的4个碱基(CACC)，以允许定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)内，以产生质粒pENTRSDD-TOPObdhA。克隆分别作为SEQ ID NOs45和46给出，以证实基因以正确方向插入且证实序列。需要另外的测序引物N9SeqF1(SEQ ID NO70)和N10SeqR1(SEQ ID NO71)(参见表5)以对PCR产物完全测序。关于这种基因的可读框(ORF)的核苷酸序列以及酶的预测氨基酸序列分别作为SEQ ID NO15和SEQ ID NO16给出。
为了生成表达克隆，通过重组将bdhA基因转移至pDEST14(Invitrogen)载体以产生pDEST14bdhA。如实施例1中所述，将pDEST14bdhA载体转化到BL21-AI细胞内，且通过添加阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如由核酸序列推导的预期分子量约43kDa的蛋白质，存在于诱导的培养物但不存在于未诱导的对照中。
如Husemann和Papoutsakis同上所述，如通过340nm处吸光度中的减少测量的，由NADH的氧化率来测定丁醇脱氢酶活性。在一种一般测定中，与未诱导的培养物中的0.028μmol mg-1min-1比较，诱导的培养物中的BdhA蛋白质比活性测定为0.102μmol mg-1min-1。
实施例9 关于1-丁醇生物合成途径中的基因的转化载体构建-下游(lower)途径 为了构建包含编码1-丁醇生物合成途径中6个步骤的基因的转化载体，将编码途径中6个步骤的基因分成2个操纵子。上游途径包含由乙酰辅酶A乙酰转移酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶和丁酰辅酶A脱氢酶催化的前4个步骤。下游途径包含由丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶催化的后2个步骤。
这个实施例的目的是构建下游途径操纵子。上游途径操纵子的构建在实施例10中描述。
个别基因通过PCR使用引物进行扩增，所述引物掺入限制位点以用于稍后克隆，且正向引物包含最优化的大肠杆菌核糖体结合位点(AAAGGAGG)。将PCR产物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO载体内且转化到大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)内。质粒DNA由TOPO克隆制备且验证基因序列。限制酶和T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)根据制造商的建议使用。对于克隆实验，限制片段通过凝胶电泳使用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)进行纯化。
序列证实后，将基因亚克隆到作为克隆平台的修饰的pUC19载体内。pUC19载体通过HindIII/SapI消化进行修饰，从而产生pUC19dHS。消化去除邻近于MCS(多克隆位点)的lac启动子，从而防止操纵子在载体中转录。
ald基因通过PCR使用引物N58和N59(参见表4)从拜氏梭菌ATCC 35702基因组DNA进行扩增，所述引物N58和N59分别作为SEQ ID NO41和42给出，从而产生1.5kbp产物。正向引物掺入限制位点AvaI和BstEII以及RBS(核糖体结合位点)。反向引物掺入HpaI限制位点。将PCR产物克隆到pCRBlunt II-TOPO内，从而产生pCRBluntII-ald。质粒DNA由TOPO克隆制备，且用下述引物验证基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N31SeqF2(SEQ ID NO59)、N31SeqF3(SEQ ID NO60)、N31SeqF4(SEQ ID NO61)、N32SeqR1(SEQ ID NO72)、N31SeqR2(SEQID NO62)、N31SeqR3SEQ ID NO63)、N31SeqR4(SEQ ID NO64)、和N31SeqR5(SEQ ID NO65)(参见表5)。
bdhB基因通过PCR使用引物N64和N65(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物N64和N65分别作为SEQ ID NO43和44给出，从而产生1.2kbp产物。正向引物掺入HpaI限制位点和RBS。反向引物掺入PmeI和SphI限制位点。将PCR产物克隆到pCRBlunt II-TOPO内，从而产生pCRBluntII-bdhB。质粒DNA由TOPO克隆制备，且用下述引物验证基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N11SeqF1(SEQID NO66)、N11SeqF2(SEQ ID NO67)、N12SeqR1(SEQ ID NO68)、和N12SeqR2(SEQ ID NO69)(参见表5)。
为了构建下游途径操纵子，使来自pCRBluntII-bdhB的1.2kbp SphI和HpaI片段，来自pCRBluntII-ald的1.4kbp HpaI和SphI片段，以及来自AvaI和SphI消化的pUC19dHS的大片段连接在一起。三向连接产生pUC19dHS-ald-bdhB。
pUC19dHS-ald-bdhB载体用BstEII和PmeI进行消化，从而释放克隆到pBenBP内的2.6kbp片段，所述pBenBP是大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。质粒pBenBP通过pBE93载体修饰产生，所述pBE93由Nagarajan，WO93/24631(实施例4)描述。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)中性蛋白酶启动子(NPR)、信号序列和phoA基因用NcoI/HindIII消化从pBE93中去除。NPR启动子通过引物BenF和BenBPR从pBE93进行PCR扩增，所述引物BenF和BenBPR分别由SEQ ID NO73和75给出。引物BenBPR掺入启动子下游的BstEII、PmeI和HindIII位点。PCR产物用NcoI和HindIII进行消化，且将片段克隆到载体pBE93的相应位点内以产生pBenBP。将下游操纵子片段亚克隆到pBenBP中的BstEII和PmeI位点内，从而产生pBen-ald-bdhB。
使用上述方法对粗提取物来进行关于丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶活性的测定。2种酶活性均在超过包含空载体的对照菌株的水平上得到证实。
实施例10(预示的) 关于1-丁醇生物合成途径中的基因的转化载体构建-上游途径 这个预示的实施例的目的是描述如何装配上游途径操纵子。一般方法与实施例9中所述的相同。
thlA基因通过PCR使用引物对N44和N45(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因组DNA进行扩增，所述引物对N44和N45分别作为SEQ ID NO33和34给出，从而产生1.2kbp产物。正向引物掺入SphI限制位点和核糖体结合位点(RBS)。反向引物掺入AscI和PstI限制位点。将PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-thlA。质粒DNA由TOPO克隆制备，且用下述引物验证基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ IDNO46)、N7SeqF1(SEQ ID NO47)、和N7SeqR1(SEQ ID NO48)(参见表5)。
hbd基因通过PCR使用引物对N42和N43(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物对N42和N43分别作为SEQ ID NO35和36给出，从而产生0.9kbp产物。正向引物掺入SalI限制位点和RBS。反向引物掺入SphI限制位点。将PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-hbd。质粒DNA由TOPO克隆制备，且用下述引物验证基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N5SeqF2(SEQID NO51)、和N6SeqR2(SEQ ID NO52)(参见表5)。
CAC0462基因对于在作为第一宿主的大肠杆菌和作为第二宿主的枯草芽孢杆菌中的表达进行密码子最优化。作为SEQ ID NO76给出的称为CaTER的新基因由Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成。基因CaTER作为BamHI-SalI片段克隆到pUC57载体中且包括RBS，从而产生质粒pUC57-CaTER。
crt基因通过PCR使用引物对N38和N39(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物对N38和N39分别作为SEQ ID NO39和40给出，从而产生834bp产物。正向引物掺入EcoRI和MluI限制位点和RBS。反向引物掺入BamHI限制位点。将PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-crt。质粒DNA由TOPO克隆制备，且用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)(参见表5)验证基因序列。
序列证实后，将基因亚克隆到作为克隆平台的修饰的pUC19载体内。pUC19载体通过SphI/SapI消化进行修饰，从而产生pUC19dSS。消化去除邻近于MCS的lac启动子，从而防止操纵子在载体中转录。
为了构建上游途径操纵子，pCR4 Blunt-TOPO-crt用EcoRI和BamHI进行消化，从而释放0.8kbp crt片段。pUC19dSS载体也用EcoRI和BamHI进行消化，从而释放2.0kbp载体片段。crt片段和载体片段使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)连接在一起，以形成pUC19dSS-crt。CaTER基因通过用BamHI和SalI消化pUC57-CaTER从而释放1.2kbp CaTER片段，插入pCU19dSS-crt内。pUC19dSS-crt用BamHI和SalI进行消化，且使大载体片段与CaTER片段连接，从而产生pUC19dSS-crt-CaTER。为了完成操纵子，连接来自pCR4Blunt-TOPO-hbd的884 bp SalI和SphI片段，来自pCR4Blunt-TOPO-thlA的1.2 kb SphI和PstI thlA片段，以及来自pUC19dSS-crt-CaTER的SalI和PstI消化的大片段。三向连接产物是pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA。
pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA载体用MluI和AscI进行消化，从而释放克隆到pBE93衍生物(Caimi，WO 2004/018645，第39-40页)内的4.1kbp片段，所述pBE93衍生物是大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，称为pBenMA。质粒pBenMA通过pBE93载体修饰产生。解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶启动子(NPR)、信号序列和phoA基因用NcoI/HindIII消化从pBE93中去除。NPR启动子通过引物BenF和BenMAR从pBE93进行PCR扩增，所述引物BenF和BenMAR分别由SEQ ID NO73和74给出。引物BenMAR掺入启动子下游的MluI、AscI和HindIII位点。PCR产物用NcoI和HindIII进行消化，且将片段克隆到载体pBE93的相应位点内，从而产生pBenMA。将上游操纵子片段亚克隆到pBenMA中的MluI和AscI位点内，从而产生pBen-crt-hbd-CaTER-thlA。
实施例11(预示的) 1-丁醇生物合成途径在大肠杆菌中的表达 这个预示的实施例的目的是描述如何在大肠杆菌中表达1-丁醇生物合成途径。
将分别如实施例10和9中所述构建的质粒pBen-crt-hbd-CaTER-thlA和pBen-ald-bdhB转化到大肠杆菌NM522(ATCC47000)内，且每个操纵子中的基因表达通过SDS-PAGE分析、酶测定和蛋白质印迹分析来监控。对于蛋白质印迹，抗体针对经由Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)的合成肽产生。所有基因的表达证实后，用EcoRI和PmeI消化pBen-ald-bdhB，以释放NPR启动子-ald-bdhB片段。将EcoRI消化的片段使用DNA聚合酶的克列诺(Klenow)片段(New England Biolabs，目录号M0210S)平端化。质粒pBen-crt-hbd-CaTER-thlA用PvuII进行消化，以产生线性化平端载体片段。使载体与NPR-ald-bdhB片段连接，从而产生p1B1 O.1和p1B1O.2，包含其中NPR启动子-ald-bdhB片段为相反方向的完整1-丁醇生物合成途径。将质粒p1B1 O.1和p1B1 O.2转化到大肠杆菌NM522内，且如前所述监控基因表达。
将大肠杆菌菌株NM522/p1B1 O.1或NM522/p1B1 O.1接种到包含50mL培养基的250mL摇瓶内，且于250rpm和35℃振荡。培养基由下述组成葡萄糖，5g/L；MOPS，0.05M；硫酸铵0.01M；一代磷酸钾，0.005M；S10金属混合物，1％(v/v)；酵母提取物，0.1％(w/v)；酪蛋白氨基酸，0.1％(w/v)；硫胺素，0.1mg/L；脯氨酸，0.05mg/L；和生物素0.002mg/L，且用KOH滴定至pH7.0。S10金属混合物包含MgCl2，200mM；CaCl2，70mM；MnCl2，5mM；FeCl3，0.1mM；ZnCl2，0.1mM；盐酸硫胺素，0.2mM；CuSO4，172μM；CoCl2，253μM；和Na2MoO4，242μM。18-24小时后，如一般方法部分中所述，1-丁醇通过HPLC或GC分析来检测。
实施例12(预示的) 1-丁醇生物合成途径在枯草芽孢杆菌中的表达 这个预示的实施例的目的是描述如何在枯草芽孢杆菌中表达1-丁醇生物合成途径。使用与实施例11中所述相同的方法。
使用分别如实施例10和9中所述构建的上游和下游操纵子。将质粒p1B1 O.1和p1B1O.2转化到枯草芽孢杆菌BE1010(J.Bacteriol.1732278-2282(1991))内，且如实施例11中所述监控每个操纵子中的基因表达。
将枯草芽孢杆菌菌株BE1010/p1B1 O.1或BE1010/p1B1 O.2接种到包含50mL培养基的250mL摇瓶内，且于250rpm和35℃振荡18小时。培养基由下述组成葡萄糖，5g/L；MOPS，0.05M；谷氨酸，0.02M；硫酸铵0.01M；一代磷酸钾缓冲液，0.005M；S10金属混合物(如实施例11中所述)，1％(v/v)；酵母提取物，0.1％(w/v)；酪蛋白氨基酸，0.1％(w/v)；色氨酸，50mg/L；甲硫氨酸，50mg/L；和赖氨酸，50mg/L，且用KOH滴定至pH7.0。18-24小时后，如一般方法部分中所述，1-丁醇通过HPLC或GC分析来检测。
实施例13 使用重组大肠杆菌从葡萄糖生产1-丁醇 这个实施例描述了1-丁醇在大肠杆菌中的生产。编码1-丁醇生物合成途径6个步骤的基因的表达分成3个操纵子。上游途径包含在1个操纵子中由thlA、hbd、crt和EgTER编码的前4个步骤。由ald编码的下一个步骤由第2个操纵子提供。由yqhD编码的途径中的最后1个步骤在第3个操纵子中提供。1-丁醇生产在包含3个操纵子的大肠杆菌菌株中证实。
除非上下文另有说明，这个实施例中描述的克隆引物通过其SEQID NO参考表4，且测序和PCR筛选引物通过其SEQ ID NO参考表5。
乙酰辅酶A乙酰转移酶。thlA基因通过PCR使用引物对N44和N45(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因组DNA进行扩增，所述引物对N44和N45分别作为SEQ ID NO33和34给出，从而产生1.2kbp产物。正向引物掺入SphI限制位点和核糖体结合位点(RBS)。反向引物掺入AscI和PstI限制位点。将PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-thlA。质粒DNA由TOPO克隆制备，且基因序列用下述引物验证M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N7SeqF1(SEQ ID NO47)、和N7SeqR1(SEQ ID NO48)(参见表5)。
3-羟丁酰辅酶A脱氢酶。hbd基因通过PCR使用引物对N42和N43(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因组DNA进行扩增，所述引物对N42和N43分别作为SEQ ID NO35和36给出，从而产生0.9kbp产物。正向引物掺入SalI限制位点和RBS。反向引物掺入SphI限制位点。将PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-hbd。质粒DNA由TOPO克隆制备，且基因序列用下述引物验证M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N5SeqF2(SEQ ID NO51)、和N6SeqR2(SEQ ID NO52)(参见表5)。
巴豆酸酶。crt基因通过PCR使用引物对N38和N39(参见表4)从丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因组DNA进行扩增，所述引物对N38和N39分别作为SEQ ID NO39和40给出，从而产生834bp产物。正向引物掺入EcoRI和MluI限制位点和RBS。反向引物掺入BamHI限制位点。将PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-crt。质粒DNA由TOPO克隆制备，且基因序列用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)(参见表5)验证。
丁酰辅酶A脱氢酶(反式-2-烯酰辅酶A还原酶)。CAC0462基因针对作为第一宿主的大肠杆菌和作为第二宿主的枯草芽孢杆菌中的增强的密码子选择进行合成。合成新基因(CaTER，SEQ ID NO76)且在pUC57载体中作为BamHI-SalI片段由Genscript Corporation(Piscataway，NJ)克隆，且包括RBS。
来自小眼虫(TER，GenBank No.Q5EU90)的关于丁酰辅酶A脱氢酶的备选基因针对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的增强的密码子选择进行合成。基因由GenScript Corporation合成和克隆到pUC57内，从而产生pUC57::EgTER。引物N85和N86(分别为SEQ ID NO80和81)连同作为模板DNA的pUC57::EgTER，提供包含来自pUC57::EgTER DNA的1224bp的PCR片段。1224bp序列作为SEQ IDNO77给出，其中bp1-1218是EgTER(opt)的编码序列(cds)。EgTER(opt)是密码子最优化的TER基因，从而缺乏正常的线粒体前序列，以便在大肠杆菌中起作用(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.2804329(2005))。
将EgTER(opt)克隆到pCR4Blunt-TOPO内，并且其序列用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)证实。需要另外的测序引物N62SeqF2(SEQ ID NO114)、N62SeqF3(SEQID NO115)、N62SeqF4(SEQ ID NO116)、N63SeqR1(SEQ IDNO117)、N63SeqR2(SEQ ID NO118)、N63SeqR3(SEQ ID NO119)和N63SeqR4(SEQ ID NO120)以对PCR产物完全测序。1.2kbpEgTER(opt)序列随后用HincII和PmeI切割，并且克隆到用HincII线性化的pET23+(Novagen)内。EgTER(opt)基因对于启动子的方向通过用引物T7Primer和N63SeqR2(分别为SEQ ID NO82和118)的菌落PCR筛选证实。将所得到的质粒pET23+::EgTER(opt)转化到BL21(DE3)(Novagen)内用于表达研究。
反式-2-烯酰辅酶A还原酶活性如Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280，4329(2005)所述进行测定。在一般测定中，与未诱导的培养物中的0.547μmol mg-1min-1比较，诱导的BL21(DE3)/pET23+::EgTER(opt)培养物中的EgTER(opt)蛋白质比活性测定为1.9μmol mg-1min-1。
随后将EgTER(opt)基因克隆到在trc启动子控制下的pTrc99a载体内。EgTER(opt)基因作为1287-bpBamHI/SalI片段从pET23+::EgTER(opt)分离。4.2kbp载体pTrc99a用BamHI/SalI线性化。使载体与片段连接，从而产生5.4kbp pTrc99a-EgTER(opt)。阳性克隆通过用引物Trc99aF和N63SeqR3(分别为SEQ ID NO83和119)的菌落PCR来证实，从而产生0.5kb产物。
包含编码乙酰辅酶A乙酰转移酶(thlA)、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)、巴豆酸酶(crt)、和丁酰辅酶A脱氢酶(反式-2-烯酰辅酶A还原酶，EgTER(opt))基因的质粒pTrc99a-E-C-H-T构建。为了起始包含上游途径(EgTER(opt)、crt、hbd和thlA)的4基因操纵子的构建，pCR4Blunt-TOPO-crt用EcoRI和BamHI进行消化，从而释放0.8kbp crt片段。pUC19dSS载体(在实施例10中描述)同样用EcoRI和BamHI进行消化，从而释放2.0kbp载体片段。crt片段和载体片段使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)连接在一起，以形成pUC19dSS-crt。CaTER基因通过用BamHI和SalI消化pUC57-CaTER从而释放1.2kbp CaTER片段，插入pCU19dSS-crt内。pUC19dSS-crt用BamHI和SalI进行消化，且使大载体片段与CaTER片段连接，从而产生pUC19dSS-crt-CaTER。为了完成操纵子，连接来自pCR4Blunt-TOPO-hbd的884bp SalI和SphI片段，来自pCR4Blunt-TOPO-thlA的1.2kb SphI和PstI thlA片段，以及来自pUC19dSS-crt-CaTER的SalI和PstI消化的大片段。三向连接的产物是所谓的pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA或pUC19dss::Operonl。
从pTrc99a-EgTER(opt)获得的丁酰辅酶A脱氢酶活性比来自CaTER构建体的更高，因此，构建来源于pTrc99a-EgTER(opt)的操纵子。CaTER基因通过用BamHI/SalI消化，且将5327-bp载体片段凝胶纯化，从pUC19dss::Operonl中取出。载体用克列诺处理且重新连接，从而产生pUC19dss::Operon1ΔCaTer。2934-bp crt-hbd-thlA(C-H-T)片段随后作为EcoRI/PstI片段从pUC19dssOperon1 ΔCaTer分离。C-H-T片段用克列诺处理以使末端变为平头的。使平端化载体与平端化C-H-T片段连接，以产生pTrc99a-E-C-H-T。菌落PCR反应用引物N62SeqF4和N5SeqF4(分别为SEQ ID NO116和84)进行，以证实插入片段的方向。
包含编码丁醛脱氢酶(ald和ald(opt))的基因的质粒pBHR T7-ald和pBHR-Ptrc-ald(opt)的构建。将PT7-ald操纵子从pDEST14-ald(实施例6)亚克隆到广宿主范围质粒pBHR1(MoBitec，Goettingen，德国)内，以产生pBHR1 PT7-ald。pBHR1质粒与pUC19或pBR322质粒相容，因此pBHR1 PT7-ald可以与携带上游途径操纵子的pUC19或pBR322衍生物组合使用，以用于在大肠杆菌中的1-丁醇生产。pDEST14-ald质粒用BglII进行消化，且用DNA聚合酶的克列诺片段处理，以产生平端。质粒随后用EcoRI进行消化，且将2,245bp PT7-ald片段凝胶纯化。质粒pBHR1用ScaI和EcoRI进行消化，且将4,883bp片段凝胶纯化。使PT7-ald片段与pBHR1载体连接，从而产生pBHRT7-ald。使用引物T-ald(BamHI)和B-ald(EgTER)(分别为SEQ IDNO85和86)的转化体的菌落PCR扩增证实预期的1.4kb PCR产物。pBHR T7-ald克隆使用EcoRI和DrdI的限制酶切作图证实预期的4,757和2,405bp片段。
对于丁醛脱氢酶活性测定，如实施例1中所述，将质粒pBHR T7-ald转化到BL21StarTM(DE3)细胞(Invitrogen)内，且通过添加L-阿拉伯糖诱导来自T7启动子的表达。如实施例6中所述，如通过340nm处吸光度中的增加测量的，通过监控NADH的形成来测定酰化醛脱氢酶活性。
关于来自拜氏梭菌ATCC 35702的ald基因的备选DNA序列由GenScript Corporation(Biscataway，NJ)合成(对于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的密码子选择最优化)且克隆到pUC57内，从而产生质粒pUC57-ald(opt)。pUC57-ald(opt)用SacI和SalI进行消化，以释放包含密码子最优化基因、ald(opt)和已用于大肠杆菌的RBS的1498bp片段。1498bp片段的序列作为SEQ ID NO78给出。
pTrc99a用SacI和SalI进行消化，从而产生4153bp载体片段，使所述载体片段与1498bp ald(opt)片段连接，以产生pTrc-ald(opt)。合成基因ald(opt)的表达在IPTG诱导型Ptrc启动子的控制下。
将Ptrc-ald(opt)操纵子亚克隆到广宿主范围质粒pBHR1(MoBitec)内，以与上述上游途径质粒相容。Ptrc-ald(opt)片段用在相应引物内掺入BspEI和ScaI限制位点的T-Ptrc(BspEI)和B-aldopt(ScaI)(分别为SEQ ID NO87和88)从pTrc99A::ald(opt)进行PCR扩增。PCR产物用BspEI和ScaI进行消化。质粒pBHR1用ScaI和BspEI进行消化，且将4,883bp片段凝胶纯化。使Ptrc-ald(opt)片段与pBHR1载体连接，从而产生pBHR-PcatPtrc-ald(opt)。pBHR-PcatPtrc-ald(opt)克隆使用ScaI和BspEI的限制酶切作图证实预期的4,883和1,704bp片段。为了去除质粒携带的cat启动子(Pcat)区域，质粒pBHR-PcatPtrc-ald(opt)用BspEI和AatII进行消化，且将6,172bp片段凝胶纯化。T-BspEIAatII和B-BspEIAatII(分别为SEQ ID NOs89和90)在包含50mM NaCl、10mM Tris-HCl和10mM MgCl2(pH7.9)的溶液中混合至100μM的终浓度，且通过于75℃温育5分钟并缓慢冷却至室温进行杂交。使杂交的寡核苷酸与6,172bp片段连接，从而产生pBHR-Ptrc-ald(opt)。
表达丁醇脱氢酶(yqhD)的大肠杆菌菌株的构建。大肠杆菌包含鉴定为1，3-丙二醇脱氢酶(美国专利号6,514,733)的天然基因(yqhD)。yqhD基因与梭菌属中的基因adhB具有40％的同一性，所述adhB基因是可能的NADH依赖性丁醇脱氢酶。yqhD基因在大肠杆菌菌株MG1655 1.6yqhD::Cm(WO 2004/033646)中使用λ Red技术(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.976640(2000))，置于葡糖异构酶启动子1.6GI(SEQ ID NO91)变体的组成型表达控制下。类似地，天然启动子用1.5GI启动子(WO 2003/089621)(SEQ ID NO92)替换，从而产生菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm，因此用1.5GI启动子替换MG 1655 1.6yqhD::Cm的1.6GI启动子。
P1溶解产物由MG1655 1.5GI yqhD::Cm制备，且将盒移动至表达菌株MG1655(DE3)和BL21(DE3)(Invitrogen)，从而分别产生MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm和BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm，所述MG1655(DE3)由大肠杆菌菌株MG1655和λDE3溶原化试剂盒(Invitrogen)制备。
来自重组大肠杆菌的1-丁醇生产的证实。大肠杆菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm用质粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR T7-ald转化，以产生菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHRT7-ald。2个独立分离物最初在包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中生长。细胞用于接种包含15、50和150mL的TM3a/葡萄糖培养基(含合适的抗生素)的摇瓶(约175mL总体积)，以分别代表高、中和低氧条件。TM3a/葡萄糖培养基包含(每升)10g葡萄糖、13.6g KH2PO4、2.0g柠檬酸一水化物、3.0g(NH4)2SO4、2.0g MgSO4·7H2O、0.2g CaCl2·2H2O、0.33g柠檬酸铁铵、1.0mg盐酸硫胺素、0.50g酵母提取物、和10mL痕量元素溶液，用NH4OH调节至pH6.8。所述痕量元素溶液包含柠檬酸·H2O(4.0g/L)、MnSO4·H2O(3.0g/L)、NaCl(1.0g/L)、FeSO4·7H2O(0.10g/L)、CoCl2·6H2O(0.10g/L)、ZnSO4·7H2O(0.10g/L)、CuSO4·5H2O(0.010g/L)、H3BO3(0.010g/L)、和Na2MoO4·2H2O(0.010g/L)。瓶以≤0.01单位的起始OD600接种，且于34℃伴随300rpm振荡温育。包含15和50mL培养基的瓶盖上通气盖；包含150mL的瓶盖上非通气盖，以使气体交换最小化。添加IPTG至0.04mM的终浓度；添加时瓶的OD600≥0.4单位。
诱导后约15小时，如一般方法部分中所述，等分试样的液体培养基通过具有折射率(RI)检测的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰离子化检测(FID)的GC(Varian CP-WAX 58(FFAP)CB柱，25m x 0.25mm id X 0.2μm膜厚度)分析1-丁醇含量。1-丁醇测定结果在表6中给出。
表6 通过大肠杆菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生产。
-值由HPLC分析测定。
-菌株后缀“a”和“b”指示独立分离物。
MG 1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的2个独立分离物以相同方式测试1-丁醇生产，只是除了培养基包含5g/L酵母提取物。结果显示于表7中。
表7 通过大肠杆菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生产。
-定量值由HPLC分析测定。
-“-”＝未检测。
-菌株后缀“a”和“b”指示独立分离物。
大肠杆菌BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm用质粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR T7-ald转化，以产生菌株BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald。如上所述准确地测试2个独立分离物的1-丁醇生产。结果在表8和9中给出。
表8 通过大肠杆菌菌株BL21(DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生产。
-定量值由HPLC分析测定。
-“-”指示未检测。
“+”指示通过GC的阳性、定性鉴定，所述GC具有比HPLC更低的检出限。
-菌株后缀“a”和“b”指示独立分离物。
表9 通过大肠杆菌菌株BL21(DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生产。
-定量值由HPLC分析测定。
-“-”指示未检测。
“+”指示通过GC的阳性、定性鉴定，所述GC具有比HPLC更低的检出限。
-菌株后缀“a”和“b”指示独立分离物。
大肠杆菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm用质粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR-Ptrc-ald(opt)转化，以产生菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)。2个分离物最初在包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中生长。细胞用于接种包含50和150mL的TM3a/葡萄糖培养基(含合适的抗生素)的摇瓶(约175mL总体积)。瓶以≤0.04单位的起始OD550接种，且如上所述温育，含和不含诱导。添加IPTG至0.4mM的终浓度；添加时瓶的OD550为0.6-1.2单位。在这种情况下，诱导对于1-丁醇途径基因表达不是必要的，这是因为IPTG诱导型启动子的泄漏程度和1.5GI启动子的组成型性质；然而，诱导提供广泛范围的表达。
诱导后约15小时，如上所述，等分试样的液体培养基通过具有火焰离子化检测的GC分析1-丁醇含量。结果在表10中给出。对于重组大肠杆菌菌株，在所有情况下产生1-丁醇；在分开的实验中，野生型大肠杆菌菌株显示不产生可检测的1-丁醇(数据未显示)。
表10 通过大肠杆菌菌株MG16551.5GI-yqhD::Cm/ pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)的1-丁醇生产。
-菌株后缀“a”和“b”指示独立分离物。
实施例14 使用重组枯草芽孢杆菌从葡萄糖生产1-丁醇 这个实施例描述了1-丁醇在枯草芽孢杆菌中的生产。编码6种酶活性的1-生物合成途径的6种基因分成2个操纵子用于表达。将该途径的前3种基因(thl、hbd和crt)整合到枯草芽孢杆菌BE1010染色体内(Payne和Jackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))。将后3种基因(EgTER、ald和bdhB)克隆到表达质粒内，且转化到携带整合的1-丁醇基因的芽孢杆菌属菌株内。
除非上下文另有说明，这个实施例中描述的克隆引物通过其SEQID NO参考表4，且测序和PCR筛选引物通过其SEQ ID NO参考表5。
整合质粒。质粒pFP988是芽孢杆菌属整合载体，它包含来自pBR322的大肠杆菌复制子、用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗生素标记和与芽孢杆菌属染色体中sacB基因同源的2个部分，所述2个同源部分通过同源重组指导载体和间插序列整合。在sacB同源区之间是可以指导克隆的基因合成和分泌的Pamy启动子和信号序列，His-标签和作为用于芽孢杆菌属的选择标记的红霉素。Pamy启动子和信号序列来自解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶。启动子区还包含lacO序列用于通过lacI阻抑蛋白调节表达。pFP988(6509bp)序列作为SEQ ID NO79给出。
因为1-丁醇途径基因将在细胞质中表达，所以缺失淀粉酶信号序列。质粒pFP988使用引物Pamy/lacO F和Pamy/lacO R进行扩增，从而产生包含Pamy/lacO启动子的317bp(0.3kbp)产物。Pamy/lacO F引物的5＇末端掺入BsrGI限制位点随后为EcoRI位点。Pamy/lacO R引物的5＇末端掺入BsrGI限制位点随后为PmeI限制位点。将PCR产物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO。质粒DNA由过夜培养物制备，且提交用于由M13正向和M13反向引物(分别为SEQ ID NOs45和46)测序，以确保没有突变已引入启动子内。pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO克隆用BsrGI进行消化，且将0.3kbp产物凝胶纯化。载体pFP988用BsrGI进行消化，从而导致产生来自5＇sacB同源区的11bp缺失以及Pamy/lacO启动子和信号序列和His标签的去除。将6kbp BsrGI消化的载体凝胶纯化且与Pamy/lacO BsrGI插入片段连接。所得到的质粒用引物Pamy SeqF2和Pamy SeqR筛选，以确定启动子的方向。正确克隆使Pamy/lacO启动子恢复其原始方向且命名为pFP988Dss。
具有基因thl-crt的盒通过SOE(重叠延伸剪接)来构建。基因使用模板pUC19dss::Operonl进行扩增。thl引物是Top TF和Bot TR，从而扩增0.9kbp产物。crt引物是Top CF和Bot CR，从而扩增1.3kbp产物。2种基因通过SOE用使用引物Top TF和Bot CR的PCR扩增进行连接，从而产生2.1kbp产物，将所述2.1kbp产物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-T-C。提交克隆用于测序以证实序列。质粒pCR4Blunt-TOPO-T-C用BstEII和PmeI进行消化，从而释放凝胶纯化的2.1kbp片段。插入片段用克列诺聚合酶处理，以使BstEII位点变成平头的。载体pFP988Dss用PmeI进行消化，且用牛小肠碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理以防止自身连接。使2.1kbp thl-crt片段与消化的pFP988Dss连接，且转化到大肠杆菌Top10细胞内。转化体通过PCR扩增筛选0.7kbp产物，所述PCR扩增使用Pamy SeqF2和N7SeqR2，正确产物命名为pFP988Dss-T-C。
thl-crt盒的构建在2种基因之间产生独特的SalI和SpeI位点。为了向盒中添加hbd基因，从pCR4Blunt-TOPO-hbd亚克隆作为0.9kbpSalI/SpeI片段的hbd基因。载体pFP988Dss-T-C用SalI和SpeI进行消化，且将8kbp载体片段凝胶纯化。使载体与hbd插入片段连接，且转化到大肠杆菌Top10细胞内。转化体通过PCR扩增筛选3.0kbp片段，所述PCR扩增使用Pamy SeqF和N3SeqF3。所得到的质粒命名为pFP988Dss-T-H-C。
Pamy启动子随后替换为来自质粒pMUTIN4的Pspac启动子(Vagner等人，Microbiol.1443097-3104(1998))。Pspac启动子从pMUTIN4使用引物Spac F和Spac R作为0.4kbp产物扩增，且TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO内。转化体通过PCR扩增筛选0.5kbp插入片段的存在，所述PCR扩增使用M13正向和M13反向引物。提交阳性克隆用于由相同引物测序。质粒pCR4Blunt-TOPO-Pspac用SmaI和XhoI进行消化，且将0.3kbp片段凝胶纯化。载体pFP988Dss-T-H-C用SmaI和XhoI进行消化，且9kbp载体通过凝胶纯化来分离。使消化的载体与Pspac插入片段连接，且转化到大肠杆菌Top10细胞内。转化体通过使用引物SpacF Seq和N7SeqR2的PCR扩增进行筛选。阳性克隆产生0.7kbp产物。质粒DNA由阳性克隆制备，且通过用引物SpacF Seq和N3SeqF2的PCR扩增进一步筛选。阳性克隆产生3kbpPCR产物，且命名为pFP988DssPspac-T-H-C。
整合到枯草芽孢杆菌BE1010内，以形成包含外源thl、hbd和crt基因的枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28。枯草芽孢杆菌BE1010的感受态细胞如Doyle等人，J.Bacteriol.144957-966(1980)中所述进行制备。感受态细胞通过离心进行收获，且将细胞沉淀重悬浮于小体积的细胞上清液中。向1体积感受态细胞中加入2体积SPII-EGTA培养基(Methods for General and Molecular Bacteriology，P.Gerhardt等人，Eds，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994))。将等分试样的0.3mL细胞分配到试管内，且将质粒pFP988DssPspac-T-H-C加入管中。细胞于37℃伴随振荡温育30分钟，这之后向每个管中加入0.1mL 10％酵母提取物，且将细胞再温育60分钟。转化体在LB红霉素板上进行铺平板用于选择，其中使用双重琼脂覆层法(Methods for General and Molecular Bacteriology，同上)。转化体通过使用引物Pamy SeqF和N5SeqF3的PCR扩增进行最初筛选。扩增预期2kbp PCR产物的阳性克隆通过PCR扩增进一步筛选。如果盒插入染色体内已经由双交换事件发生，那么引物组sacB Up和N7SeqR2以及引物组sacB Dn和N4SeqR3将分别扩增1.7kbp和a2.7kbp产物。阳性克隆被鉴定且命名为枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28。
EgTER、ald和bdhB基因的质粒表达。剩余的3种1-丁醇基因由质粒pHT01(MoBitec)表达。质粒pHT01是经由θ机制复制的芽孢杆菌属-大肠杆菌穿梭载体。克隆的蛋白质由与lacO序列融合的GroEL启动子表达。lacO下游是来自gsiB基因的有效RBS，随后为MCS。ald基因通过PCR用引物AF BamHI和AR Aat2使用pUC19dHS-ald-bdhB(在实施例9中描述)作为模板进行扩增，从而产生1.4kbp产物。将产物TOPO克隆到pCR4-TOPO内且转化到大肠杆菌Top10细胞内。转化体用M13正向和M13反向引物进行筛选。阳性克隆扩增1.6kbp产物。提交克隆用于由下述引物测序M13正向和M13反向、N31SeqF2、N31SeqF3、N32SeqR2、N32SeqR3和N32SeqR4。质粒命名为pCR4TOPO-B/A-ald。
载体pHT01和质粒pCR4TOPO-B/A-ald都用BamHI和AatII进行消化。使7.9kbp载体片段与1.4kbp ald片段连接在一起，以产生pHT01-ald。将连接物转化到大肠杆菌Top10细胞内，且转化体通过PCR扩增筛选1.3kbp产物，所述PCR扩增使用引物N31SeqF1和HT R。
为了给pHT01载体添加途径的最后2个步骤，设计2种克隆方案。对于2种方案，EgTER和bdhB通过SOE一起扩增。随后，将EgTER-bdh片段克隆到pHT01-ald内，从而产生pHT01-ald-EB，或克隆到pCR4-TOPO-B/A-ald内，从而产生pCR4-TOPO-ald-EB。随后将来自TOPO载体的ald-EgTer-bdhB片段克隆到pHT01内，从而产生pHT01-AEB。
EgTER-bdhB片段使用引物正向1(E)和反向2(B)进行PCR扩增，其中使用作为SEQ ID NO208给出的模板DNA。将所得到的2.5kbp PCR产物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-E-B。将TOPO反应物转化到大肠杆菌Top10细胞内。菌落用M13正向和M13反向引物通过PCR扩增进行筛选。阳性克隆产生2.6kbp产物。提交pCR4Blunt-TOPO-E-B的克隆用于由下述引物测序M 13正向和反向，N62SeqF2、N62SeqF3、N62SeqF4、N63SeqR1、N63SeqR2、N63SeqR3、N11Seq F1和N11Seq F2、N12SeqR1和N12SeqR2。
质粒pCR4Blunt-TOPO-E-B用HpaI和AatII进行消化，以释放2.4kbp片段。E-B片段用克列诺聚合酶处理以使末端变成平头的，且随后进行凝胶纯化。质粒pHT01-ald用AatII进行消化，且用克列诺聚合酶处理，以使末端变成平头的。载体随后用牛小肠碱性磷酸酶处理且进行凝胶纯化。使E-B片段与线性化载体pHT01-ald连接，转化到大肠杆菌Top10细胞内，且在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB板上选择。转化体通过使用引物N3SeqF1和N63SeqR1进行PCR扩增以产生2.4kbp产物来筛选。将所得到的质粒pHT01-ald-EB转化到JM103细胞recA+大肠杆菌菌株内。由recA+菌株制备的质粒形成比recA-菌株更多的多聚体。使用质粒多聚体而不是单体的枯草芽孢杆菌转化更有效(Methods for General and Molecular Bacteriology，同上)。质粒DNA由JM103制备且转化到感受态枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28内，从而形成菌株枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB。感受态细胞如先前所述进行制备和转化。转化体在包含5μg/mL氯霉素的LB板上进行选择，且通过菌落PCR筛选1.3kbp产物，所述菌落PCR使用引物N31SeqF1和N63SeqR4。
在可替代的克隆策略中，pCR4Blunt-TOPO-E-B用HpaI和AatII进行消化，从而释放凝胶纯化的2.4kbp片段。质粒pCR4-TOPO-B/A-ald用HpaI和AatII进行消化，且将5.4kbp载体片段凝胶纯化。使来自pCR4-TOPO-B/A-ald的载体片段与HpaI-AatII E-B片段连接，从而产生pCR4-TOPO-ald-EB。将连接物转化到大肠杆菌Top10细胞内，且所得到的转化体通过PCR扩增筛选2.1kbp产物，所述PCR扩增使用引物N11SeqF2和N63SeqR4。质粒pCR4-TOPO-ald-EB用BamHI和AatII和SphI进行消化。BamHI/AatII消化释放凝胶纯化的3.9kbp ald-EB片段。SphI消化的目的是将剩余载体切割成较小片段，从而使得它不能在凝胶上与ald-EB插入片段共迁移。载体pHT01用BamHI和AatII进行消化，且将7.9kbp载体片段凝胶纯化。使载体与ald-EB插入片段连接，以形成质粒pHT01-AEB，且转化到大肠杆菌Top10细胞内。菌落通过PCR扩增筛选1.5kbp产物，所述PCR扩增使用引物N62SeqF4和HT R。制备质粒且转化到JM103内。质粒DNA由JM 103制备且转化到感受态枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28内，从而形成菌株枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm # 28/pHT01-AEB。感受态BE1010细胞如先前所述进行制备和转化。芽孢杆菌属转化体通过PCR扩增筛选1.3kbp产物，所述PCR扩增使用引物N31SeqF1和N63SeqR4。
来自重组枯草芽孢杆菌的1-丁醇生产的证实。
每种菌株枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB和枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB的3个独立分离物接种到包含15mL培养基的摇瓶(约175mL总体积)内。也包括缺乏外源1-丁醇、6基因途径的枯草芽孢杆菌BE1010菌株作为阴性对照。培养基包含(每升)10mL 1M(NH4)2SO4；5mL 1M磷酸钾缓冲液，pH7.0；100mL 1M MOPS/KOH缓冲液，pH7.0；20mL 1M L-谷氨酸，钾盐；10g葡萄糖；各10mL 5g/L L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸；酵母提取物和酪蛋白氨基酸各0.1g；20mL金属混合物；以及合适的抗生素(5mg氯霉素和红霉素用于重组菌株)。金属混合物包含200mMMgCl2、70mM CaCl2、5mM MnCl2、0.1mM FeCl3、0.1mM ZnCl2、0.2mM盐酸硫胺素、172μM CuSO4、253μM CoCl2、和242μMNa2MoO4。瓶以≤0.1单位的起始OD600接种，用非通气盖密封，且于37℃伴随约200rpm振荡温育。
接种后约24小时，如一般方法部分中所述，等分试样的液体培养基通过具有折射率(RI)检测的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰离子化检测(FID)GC(Varian CP-WAX 58(FFAP)CB柱，0.25mm X 0.2μm X 25m)分析1-丁醇含量。1-丁醇测定结果在表11中给出。
表11 通过菌株枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/DHT01-ald-EB和枯草芽孢杆菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/DHT01-AEB的1-丁醇生产。
*通过GC测定的浓度。
-菌株后缀“a”、“b”和“c”指示独立分离物。
实施例15 通过重组大肠杆菌从葡萄糖或蔗糖生产1-丁醇。
为了赋予大肠杆菌MG1655使用蔗糖作为碳源和能源用于1-丁醇生产的能力，将来自质粒pScrI(下文描述)的蔗糖利用基因簇(cscBKA)亚克隆到这种生物中的pBHR-Ptrc-ald(opt)(在实施例13中描述)内。蔗糖利用基因(cscA、cscK和cscB)编码作为SEQ ID NO157给出的蔗糖水解酶(CscA)，作为SEQ ID NO158给出的D-果糖激酶(CscK)，和作为SEQ ID NO159给出的蔗糖透性酶(CscB)。为了允许来自其天然启动子的3种基因的组成型表达，调节该基因簇的蔗糖特异性阻抑基因cscR不存在于构建体中。
蔗糖利用基因簇cscBKA在质粒pBHR-Ptrc-ald(opt)中的克隆和表达。作为SEQ ID NO156给出的蔗糖利用基因簇cscBKA，从蔗糖利用大肠杆菌菌株基因组DNA中分离，所述蔗糖利用大肠杆菌菌株来源于大肠杆菌菌株ATCC 13281。基因组DNA用BamHI和EcoRI消化完全。从琼脂糖凝胶分离平均大小约4kbp的片段，与质粒pLitmus28(New England Biolabs，Beverly，MA)连接，随后用BamHI和EcoRI进行消化。将所得到的DNA转化到超感受态(ultracompetent)大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)内。转化体在包含1％蔗糖和100μg/mL氨苄青霉素的MacConkey琼脂板上进行铺平板，且筛选紫色菌落。从紫色转化体中分离质粒DNA，且使用下述引物测序M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、scr1(SEQID NO160)、scr2(SEQ ID NO161)、scr3(SEQ ID NO162)和scr4(SEQ ID NO163)。包含cscB、cscK和cscA(cscBKA)基因的质粒命名为pScr1。
质粒pScrI用XhoI进行消化，且用DNA聚合酶的克列诺片段处理，以产生平端。质粒随后用AgeI进行消化，且将4,179bp cscBKA基因簇片段凝胶纯化。质粒pBHR-Ptrc-ald(opt)如实施例13中所述制备，且用AgeI和NaeI进行消化。将所得到的6,003bp pBHR-Ptrc-ald(opt)片段凝胶纯化。使cscBKA片段与pBHR-Ptrc-ald(opt)连接，从而产生pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB。将质粒pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB转化到大肠杆菌NovaXG电转化感受态细胞(Novagen，Madison，WI)内，且蔗糖利用通过使转化体在包含2％蔗糖和25μg/mL卡那霉素的McConkey琼脂板上铺平板来证实。在pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB构建体中，蔗糖利用基因作为独立片段以cscA、cscK和cscB的顺序克隆到Ptrc-ald(opt)下游。
可替代地，将蔗糖利用基因以相反方向克隆到pBHR-Ptrc-ald(opt)中。质粒pBHR-Ptrc-ald(opt)用ScaI和AgeI进行消化，且将5,971bppBHR-Ptrc-ald(opt)片段凝胶纯化。使如上所述制备的4,179bp cscBKA片段与pBHR-Ptrc-ald(opt)片段连接，从而产生pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA。将质粒pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA转化到大肠杆菌NovaXG电转化感受态细胞(Novagen，Madison，WI)内，且蔗糖利用通过使转化体在包含2％蔗糖和25μg/mL卡那霉素的McConkey琼脂板上铺平板来证实。在pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA构建体中，蔗糖利用基因作为独立片段以cscB、cscK和cscA的顺序克隆到Ptrc-ald(opt)下游。
使用重组大肠杆菌从葡萄糖或蔗糖的1-丁醇生产的证实。大肠杆菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm(在实施例13中描述)用质粒pTrc99a-E-C-H-T(如实施例13中所述制备)和pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB或pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA转化，以产生2种菌株，MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB#9和MG16551.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA#1。2种菌株的起子培养物通过使细胞在包含25μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中培养细胞来制备。如实施例13中所述，这些细胞随后用于接种包含50、70和150mL的TM3a/葡萄糖培养基(含合适的抗生素)的摇瓶(约175mL总体积)，以分别代表高、中和低氧条件。在包含100μg/mL羧苄青霉素的TM3a/葡萄糖培养基中生长的第3种菌株大肠杆菌MG 1655/pScr1，用作阴性对照。对于每种菌株，相同组的瓶用TM3a/蔗糖培养基(含合适的抗生素)制备。TM3a/蔗糖培养基等同于TM3a/葡萄糖培养基，只是除了蔗糖(10g/L)替换葡萄糖。瓶以≤0.03单位的起始OD550接种，且如实施例13中所述温育。除了阴性对照瓶，当培养物达到OD550 0.2-1.8单位时，向瓶中加入IPTG(终浓度0.04mM)。当培养物OD550增加至少3倍时收获细胞。
接种后约24小时，如一般方法部分中所述，等分试样的液体培养基通过具有折射率(RI)检测的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰离子化检测(FID)的GC(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mm id，1μm膜厚度)分析1-丁醇含量。
在含葡萄糖和蔗糖的培养基中生长后培养物中的1-丁醇浓度分别在表12和表13中给出。包含1-丁醇生物合成途径的2种重组大肠杆菌菌株在所有氧条件下从葡萄糖和蔗糖产生1-丁醇，而阴性对照菌株不产生可检测的1-丁醇。
表12 通过重组大肠杆菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB#9和 MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt) -cscBKA#1从葡萄糖的1-丁醇生产 表13 通过重组大肠杆菌菌株从蔗糖的1-丁醇生产。
实施例16 使用重组枯草芽孢杆菌从蔗糖生产1-丁醇。
这个实施例描述了使用重组枯草芽孢杆菌从蔗糖生产1-丁醇。基本上如实施例14中所述检查枯草芽孢杆菌菌株ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB(实施例14)的2个独立分离物的1-丁醇生产。将菌株接种到包含20mL或100mL培养基的摇瓶(约175mL总体积)内，以分别模拟高和低氧条件。培养基A完全如实施例14中所述，只是除了葡萄糖替换为5g/L蔗糖。培养基B等同于实施例13中所述的TM3a/葡萄糖培养基，只是除了葡萄糖替换为10g/L蔗糖，且培养基补加了(每L)各10mL 5g/L L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸溶液。瓶以≤0.1单位的起始OD550接种，盖上通气盖，且于34℃伴随300rpm振荡温育。
接种后约24小时，如一般方法部分中所述，等分试样的液体培养基通过具有FID检测的GC(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mm id，1.0μm膜厚度)分析1-丁醇含量。1-丁醇测定结果在表14中给出。包含1-丁醇生物合成途径的重组芽孢杆菌属菌株在高和低氧条件下在2种培养基中都产生可检测水平的1-丁醇。
表14 通过枯草芽孢杆菌菌株ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB从蔗糖生产1-丁醇 1通过GC测定的浓度。
2“+”指示1-丁醇的定性存在。
菌株后缀“a”和“b”指示独立分离物。
实施例17 使用重组啤酒糖酵母从葡萄糖和蔗糖生产1-丁醇 这个实施例描述了1-丁醇在啤酒糖酵母中的生产。在编码催化1-丁醇生物合成途径步骤的酶的6种基因中，将5种克隆到3种相容性酵母2微米(2μ)质粒内，且在啤酒糖酵母中共表达。“上游途径”定义为由乙酰辅酶A乙酰转移酶(thlA，硫解酶)、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)和巴豆酸酶(crt)催化的前3个酶促步骤。下游途径定义为该途径的第4个(丁酰辅酶A脱氢酶，ter)和第5个(丁醛脱氢酶，ald)酶促步骤。1-丁醇途径的最后1个酶促步骤由醇脱氢酶催化，所述醇脱氢酶可以由内源酵母基因例如adhI和adhII编码。
基因在酵母中的表达一般需要启动子，随后为目的基因，和转录终止子。许多组成型酵母启动子在构建用于编码1-丁醇生物合成途径的基因的表达盒中使用，包括FBA、GPD和GPM启动子。一些诱导型启动子例如GAL1、GAL10、CUP1也在中间质粒构建中使用，但不在最终显示菌株中使用。使用几种转录终止子，包括FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、和GAL1t。将编码1-丁醇生物合成途径的基因首先亚克隆到酵母质粒内，侧面为启动子和终止子，这产生关于每种基因的表达盒。如下文所述表达盒通过缺口修复克隆任选与单个载体组合。例如，将编码上游途径的3种基因盒亚克隆到酵母2μ质粒内。ter和ald基因各自在2μ质粒中个别表达。所有3种质粒在单个酵母菌株中的共转化导致功能性1-丁醇生物合成途径。可替代地，编码启动子、基因和终止子的几个DNA片段通过缺口修复克隆在单个载体中直接组合。
关于在啤酒糖酵母中构建质粒和菌株的方法。基本酵母分子生物学规程包括转化、细胞生长、基因表达、缺口修复重组等，在Methodsin Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular andCell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)中描述。
这个实施例中使用的质粒是大肠杆菌-啤酒糖酵母穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425、和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，所述穿梭载体包含大肠杆菌复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点、和用于营养选择的标记。关于这4种载体的选择标记为His3(载体pRS423)、Trp1(载体pRS424)、Leu2(载体pRS425)和Ura3(载体pRS426)。这些载体允许在大肠杆菌和酵母菌株中的菌株繁殖。酵母单倍体菌株BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 metl5Δ0 ura3Δ0)(Research Genetics，Huntsville，AL，也可从ATCC 201388获得)和二倍体菌株BY4743(MATa/alpha his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0lys2Δ0/LYS2 MET15/metl5Δ0 ura3Δ0/ura3Δ0)(Research Genetics，Huntsville，AL，也可从ATCC 201390获得)用作基因克隆和表达的宿主。关于编码1-丁醇生物合成途径酶的基因的表达载体的构建通过在大肠杆菌中的标准分子克隆技术，或通过在酵母中的缺口修复重组法来进行。
缺口修复克隆方法利用酵母中的高效同源重组。一般地，酵母载体DNA进行消化(例如，在其多克隆位点中)以在其序列中产生“缺口”。产生在5＇和3＇末端包含≥21bp序列的许多目的插入DNA，所述插入DNA与彼此且与载体DNA的5＇和3＇末端连续重叠。例如，为了构建关于“基因X”的酵母表达载体，选择酵母启动子和酵母终止子用于表达盒。启动子和终止子从酵母基因组DNA扩增，且基因X从其来源生物进行PCR扩增，或从包含基因X序列的克隆载体获得。在线性化载体的5＇末端和启动子序列之间、在启动子和基因X之间、在基因X和终止子序列之间、以及在终止子和线性化载体的3＇末端之间存在至少21bp重叠序列。随后将“缺口的”载体和插入DNAs共转化到酵母菌株内，且在SD极限撤除成分培养基上铺平板，且选择菌落用于培养物生长和小量制备(mini preps)质粒DNAs。正确插入片段组合的存在可以通过PCR作图来证实。从酵母分离的质粒DNA(浓度通常低)随后可以转化到大肠杆菌菌株例如TOP10内，随后为小量制备和限制酶切作图，以进一步验证质粒构建体。最后构建体可以通过序列分析来验证。阳性质粒的酵母转化体在SD培养基中生长用于执行酶测定，以表征由目的基因表达的酶的活性。
酵母培养物在YPD复合培养基或包含葡萄糖(SD培养基)和合适的化合物混合物的合成极限撤除成分培养基中生长，所述化合物混合物允许质粒上的营养选择标记互补(Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，2004，PartA，第13-15页)。SD撤除成分培养基中的糖组分为2％葡萄糖。对于1-丁醇生产，酵母培养物也在含2％蔗糖的合成极限撤除成分培养基(SS培养基)中生长。
对于酶活性分析，将每种菌株的单个菌落在包含SD极限撤除成分培养基的新鲜板上划线，且于30℃温育2天。这个板上的细胞用于接种125mL摇瓶中的20mL SD撤除成分培养基，且于30℃伴随250rpm振荡生长过夜。测量过夜培养物的光密度(OD600)，且在1.0L摇瓶中的250mL相同培养基中将培养物稀释至OD600＝0.1，且于30℃伴随250rpm振荡生长至OD600 0.8-1.0。细胞随后通过在2000xg下离心10分钟进行收获，且重悬浮于20mL 50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5中。酶测定如上所述进行。
用于thlA和hbd共表达的质粒pNY102的构建。构建许多双重表达载体用于共表达thlA和hbd基因。啤酒糖酵母ERG10基因是thlA基因的功能性直向同源物。最初，ERG10和hbd的双重载体使用酵母GAL1-GAL10反向双启动子、GAL1终止子(GAL1t)和ERG10终止子(ERG10t)来构建。ERG10基因-ERG10t DNA片段从啤酒糖酵母菌株BY4743基因组DNA进行PCR扩增，其中使用引物OT731(SEQ IDNO164)和OT732(SEQ ID NO165)。酵母GAL1-GAL10反向启动子也通过PCR从BY4743基因组DNA扩增，其中使用引物OT733(SEQ ID NO166)和OT734(SEQ ID NO167)。hbd基因从大肠杆菌质粒pTrc99a-E-C-H-T(在实施例13中描述)扩增，其中使用PCR引物OT735(SEQ ID NO168)和OT736(SEQ ID NO169)。GAL1t从BY4743基因组DNA扩增，其中使用引物OT737(SEQ ID NO170)和OT738(SEQ ID NO171)。因此获得的4种PCR片段erg10-ERG10t、GAL1-GAL10启动子、hbd和GAL1t，在每个相邻PCR片段之间具有约25bp重叠序列。GAL1t和ERG10-ERG10t片段各自包含与酵母载体pRS425的约25bp重叠序列。为了通过缺口修复重组装配这些序列，将DNA片段连同载体pRS425共转化到酵母菌株BY4741内，所述载体pRS425用BamHI和HindIII酶进行消化。菌落选自SD-Leu极限板，且具有插入片段的克隆通过PCR扩增鉴定。新质粒命名为pNY6(pRS425.ERG10t-erg10-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t)。进一步的证实通过限制酶切作图来进行。
通过将质粒pNY6转化到啤酒糖酵母BY4741内制备的酵母菌株BY4741(pNY6)显示良好的Hbd活性，但无硫解酶活性。由于缺乏硫解酶活性，ERG10基因通过缺口修复重组替换为thlA基因。thlA基因通过PCR从大肠杆菌载体pTrc99a-E-C-H-T扩增，其中使用引物OT797(SEQ ID NO172)和OT798(SEQ ID NO173)，所述引物OT797添加ShpI限制位点，所述引物OT798添加AscI限制位点。质粒pNY6用SphI和PstI限制酶进行消化，凝胶纯化，且连同thlA的PCR产物一起共转化到酵母BY4741内。由于thlA的PCR产物和消化的pNY6之间的30bp重叠序列，thlA基因重组到pNY6内的GAL10启动子和ERG10t终止子之间。这产生质粒pNY7(pRS425.ERG10t-th1A-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t)，所述质粒pNY7通过PCR和限制酶切作图来验证。
在基于缺口修复重组的后续克隆步骤中，pNY7中的GAL10启动子替换为CUP1启动子，且GAL1启动子替换为强GPD启动子。这种质粒pNY10(pRS425.ERG10t-thlA-CUP1-GPD-hbd-GAL1t)允许在铜诱导型启动子CUP1下表达thlA基因，和在GPD启动子下表达hbd基因。CUP1启动子序列从酵母BY4743基因组DNA进行PCR扩增，其中使用引物OT806(SEQ ID NO174)和OT807(SEQ ID NO175)。GPD启动子从BY4743基因组DNA扩增，其中使用引物OT808(SEQID NO176)和OT809(SEQ ID NO177)。CUP1和GPD启动子的PCR产物与用NcoI和SphI限制酶消化的pNY7质粒组合。从这个缺口修复克隆步骤构建质粒pNY10，所述质粒pNY10通过PCR和限制酶切作图来验证。包含pNY10的酵母BY4741菌株具有Hbd活性，但无ThlA活性。与GAL1启动子控制的Hbd活性相比较，在GPD启动子下的Hbd活性显著改善(1.8U/mg对0.40U/mg)。测序分析揭示pNY10中的thlA基因在3＇末端附近具有1个碱基缺失，这导致截短的蛋白质。这解释了菌株中硫解酶活性的缺乏。
质粒pNY12用正确的thlA基因序列构建。thlA基因通过用SphI和AscI消化从载体pTrc99a-E-C-H-T中切割。FBA1启动子从BY4743基因组DNA进行PCR扩增，其中使用引物OT799(SEQ ID NO178)和OT761(SEQ ID NO179)，且用SalI和SphI限制酶进行消化。将thlA基因片段和FBA1启动子片段连接到质粒pNY10内的AscI和SalI位点上，从而产生质粒pNY12(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1)，所述质粒pNY12通过限制酶切作图来验证。将pNY12转化到酵母菌株BY4741内，且所得到的转化体显示1.66U/mg的ThlA活性。
将来自pNY12的FBA1启动子-thlA基因片段重新亚克隆到pNY10内。pNY10载体用AscI限制酶切割，且与从质粒pNY12分离的AscI消化的FBA1启动子-thlA基因片段连接。这产生了具有2个可能的插入方向的新质粒。选择具有以相反方向彼此相邻定位的FBA1和GPD启动子的克隆，且这种质粒命名为pNY102。pNY102(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t)通过限制酶切作图来验证。菌株DPD5206通过将pNY102转化到酵母菌株BY4741内来制备。DPD5206的ThlA活性为1.24U/mg，且Hbd活性为0.76U/mg。
用于crt表达的质粒pNY11的构建。crt基因表达盒通过在酵母在使用缺口修复重组，将GPM1启动子、crt基因、和GPM1t终止子组合到载体pRS426内来构建。GPM1启动子从酵母BY4743基因组DNA进行PCR扩增，其中使用引物OT803(SEQ ID NO180)和OT804(SEQ ID NO181)。crt基因从大肠杆菌质粒pTrc99a-E-C-H-T使用PCR引物OT785(SEQ ID NO182)和OT786(SEQ ID NO183)扩增。GPM1t终止子从酵母BY4743基因组DNA进行PCR扩增，其中使用OT787(SEQ ID NO184)和OT805(SEQ ID NO185)。酵母载体pRS426用BamHI和HindIII进行消化，且进行凝胶纯化。这种DNA与GPM1启动子、crt基因和GPM1终止子的PCR产物共转化到酵母BY4741感受态细胞内。具有正确插入片段的克隆通过PCR和限制酶切作图来验证，且所得到的酵母菌株BY4741(pNY11pRS426-GPM1-crt-GPM1t)具有85U/mg的Crt活性。
用于thlA、hbd和crt共表达的质粒pNY103的构建。关于上游1-丁醇途径酶的共表达，将来自pNY11的crt基因盒亚克隆到质粒pNY102内，以产生hbd、thlA和crt表达载体。包含GPM1启动子、crt基因和GPM1终止子的2,347bp DNA片段用SacI和NotI限制酶从质粒pNY11中切割，且克隆到载体pNY102内，所述pNY102用NtoI进行消化且用SacI部分消化，从而产生表达载体pNY103(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t-GPM1t-crt-GPM1)。通过用HindIII消化证实pNY103中存在所有3种盒后，将质粒转化到酵母BY4743细胞内，且转化的酵母菌株命名为DPD5200。当在标准条件下生长时，DPD5200显示分别为0.49U/mg、0.21 U/mg和23.0 U/mg的ThlA、Hbd和Crt酶活性。
用于ald表达的质粒pNY8的构建。编码Ter蛋白质(SEQ ID NO187)、命名为tery的密码子最优化基因(SEQ ID NO186)，和编码Ald蛋白质(SEQ ID NO189)、命名为aldy的密码子最优化基因(SEQ ID NO188)，使用啤酒糖酵母的优选密码子来合成。包含密码子最优化的ter基因的质粒pTERy和包含密码子最优化的ald基因的pALDy由DNA2.0(Palo Alto，CA)制备。
为了装配pNY8(pRS426.GPD-ald-GPDt)，包括GPD启动子的PCR产物(由引物OT800(SEQ ID NO190)和OT758(SEQ ID NO191)，以及BY4743基因组DNA合成)，通过用NcoI和SfiI从pALDy中切割的aldy基因片段(SEQ ID NO188)，和GPD终止子的PCR产物(由引物OT754(SEQ ID NO192)和OT755(SEQ ID NO193)，以及BY4743基因组DNA合成)的3种插入片段，经由缺口修复重组克隆与BamHI、HindIII消化的pRS426载体重组。酵母BY4741转化克隆通过PCR作图进行分析。因此构建的新质粒pNY8通过限制酶切作图进一步证实。分析包含pNY8的酵母BY4741转化体的Ald活性，且针对丁酰辅酶A的比活性为约0.07U/mg。
用于ter表达的质粒pNY9和pNY13的构建。通过缺口修复克隆将密码子最优化的tery基因克隆到在FBA1启动子控制下的载体pRS426内。FBA1启动子从酵母BY4743基因组DNA进行PCR扩增，其中使用引物OT760(SEQ ID NO194)和OT792(SEQ ID NO195)。tery基因通过SphI和NotI限制酶消化质粒pTERy来获得，这导致作为SEQ ID NO186给出的片段。FBA1终止子的PCR片段通过PCR从酵母BY4743基因组DNA产生，其中使用引物OT791(SEQ ID NO196)和OT765(SEQ ID NO197)。3种DNA片段-FBA1启动子、ter基因和FBA1终止子，与BamHI、HindIII消化的pRS426载体组合，且通过缺口修复重组转化到酵母BY4741内。所得到的质粒pNY9(pRS426-FBA1-tery-FBA1t)通过PCR作图以及限制酶切消化来证实。pNY9的酵母BY4741转化体产生0.26U/mg的Ter活性。
为了制备最终的1-丁醇生物合成途径菌株，必需构建包含几种质粒的酵母表达菌株，所述质粒各自具有独特的营养选择标记。因为亲本载体pRS426包含Ura选择标记，所以将ter表达盒亚克隆到包含His3标记的载体pRS423内。包含FBA1-tery-FBA1t盒的3.2kb片段通过用SacI和XhoI限制酶消化从质粒pNY9分离，且连接到用这2种相同酶切割的载体pRS423内。新质粒pNY13(pRS423-FBA1-tery-FBAIt)通过限制酶切消化进行作图。将pNY13转化到BY4741菌株内，且在SD-His培养基中培养转化体，从而产生具有0.19U/mg Ter活性的菌株。
包含1-丁醇生物合成途径基因用于证实1-丁醇生产的酵母菌株的构建。如上所述，酵母菌株DPD5200通过将质粒pNY103转化到啤酒糖酵母菌株BY4743内来构建，所述质粒pNY103允许thlA、hbd和crt基因共表达。DPD5200的酵母感受态细胞如上所述进行制备，且将质粒pNY8和pNY13共转化到DPD5200内，从而产生菌株DPD5213。DPD5213允许1-丁醇生物合成途径中的5种基因thlA、hbd、crt、ter和ald同时组成型表达。菌株DPD5212(用空质粒，pRS425和pRS426转化的啤酒糖酵母菌株BY4743)用作阴性对照。菌株DPD5213的4个独立分离物在SD-Ura，-Leu，-His撤除成分极限培养基中在2％葡萄糖或2％蔗糖的存在下生长，以允许所有3种质粒的生长互补。DPD5212的单个分离物在合适培养基中类似地生长。
为了证实通过需氧培养物的1-丁醇生产，将每种菌株的单个菌落在新鲜琼脂板上划线，所述新鲜琼脂板包含SD极限撤除成分生长培养基(包含2％葡萄糖)或SS极限撤除成分生长培养基(包含2％蔗糖)，且于30℃温育2天。来自这些板的细胞用于接种125mL塑料摇瓶中的20mL极限撤除成分培养基(SD或SS)，且于30℃伴随250rpm振荡生长过夜。测量过夜培养物的光密度(OD600)，且在125mL摇瓶中的25mL相同培养基中将培养物稀释至OD6000.1，且于30℃伴随250rpm振荡生长。
如一般方法部分中所述，在24小时和48小时时取出等分试样的培养物用于1-丁醇生产的GC分析(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mmid，1μm膜厚度)，其具有FID检测。GC分析结果在表15中给出。
表15 通过啤酒糖酵母菌株DPD5213从葡萄糖和蔗糖的1-丁醇生产 1独立分离物由a-d指示。
2通过GC测定的浓度。
实施例18(预示的) 1-丁醇生物合成途径在植物乳杆菌中的表达 这个预示的实施例的目的是描述如何在植物乳杆菌中表达1-丁醇生物合成途径。将编码6种酶活性的1-丁醇途径的6种基因分成2个操纵子用于表达。使用由Hols等人(Appl.Environ.Microbiol.601401-1413(1994))描述的方法，通过同源重组将该途径的前3种基因(thl、hbd和crt，分别编码乙酰辅酶A乙酰转移酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和巴豆酸酶)整合到植物乳杆菌染色体内。将后3种基因(EgTER、ald和bdhB，分别编码丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶)克隆到表达质粒内，且转化到携带整合的上游途径1-丁醇基因的乳杆菌属菌株内。乳杆菌属在MRS培养基(DifcoLaboratories，Detroit，MI)中于37℃生长。如由Moreira等人(BMCMicrobiol.515(2005))所述，从植物乳杆菌分离染色体DNA。
整合。通过同源重组将在合成的P11启动子(Rud等人，Microbiology 1521011-1019(2006))控制下的thl-hbd-crt盒整合到植物乳杆菌ATCC BAA-793(NCIMB8826)染色体内的ldhL1基因座上。为了构建ldhL整合靶向载体，来自植物乳杆菌(GenbankNC_004567)与ldhL具有同源性的DNA片段进行PCR扩增，其中使用引物LDH EcoRV F(SEQ ID NO198)和LDH AatIIR(SEQ ID NO199)。将1986 bp PCR片段克隆到pCR4Blunt-TOPO内且测序。pCR4Blunt-TOPO-ldhL1克隆用EcoRV和AatII进行消化，从而释放凝胶纯化的1982 bp ldhL1片段。在实施例14中描述的整合载体pFP988用HindIII进行消化，且用克列诺DNA聚合酶处理，以使末端变成平头的。线性化质粒随后用AatII进行消化，且将2931bp载体片段凝胶纯化。使EcoRV/AatII ldhL1片段与pFP988载体片段连接，且转化到大肠杆菌Top10细胞内。转化体在包含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂板上进行选择，且通过菌落PCR进行筛选，以证实pFP988-1dhL的构建。
为了给整合DNA添加选择标记，Cm基因与其启动子从pC194(Genbank NC_002013)进行PCR扩增，其中使用引物Cm F(SEQ IDNO200)和Cm R(SEQ ID NO201)，从而扩增836bp PCR产物。将扩增子克隆到pCR4Blunt-TOPO内，且转化到大肠杆菌Top10细胞内，从而产生pCR4Blunt-TOPO-Cm。测序以证实通过PCR没有引入错误后，Cm盒作为828 bp MluI/SwaI片段从pCR4Blunt-TOPO-Cm中消化，且进行凝胶纯化。包含ldhL同源性的整合载体pFP988-ldhL用MluI和SwaI进行消化，且将4740bp载体片段凝胶纯化。Cm盒片段与pFP988-ldhL载体连接，从而生成pFP988-DldhL::Cm。
最后来自实施例14中描述的pFP988Dss-T-H-C的thl-hbd-crt盒进行修饰，以用合成的P11启动子替换淀粉酶启动子。随后，将整个操纵子移至pFP988-DldhL::Cm内。P11启动子通过与引物P11F(SEQ IDNO202)和P11R(SEQ ID NO203)的寡核苷酸退火构建。退火的寡核苷酸在6％ Ultra PAGE凝胶(Embi Tec，San Diego，CA)上进行凝胶纯化。质粒pFP988Dss-T-H-C用XhoI和SmaI进行消化，且将9kbp载体片段凝胶纯化。使分离的P11片段与消化的pFP988Dss-T-H-C连接，以产生pFP988-P11-T-H-C。质粒pFP988-P11-T-H-C用XhoI和BamHI进行消化，且将3034bp P11-T-H-C片段凝胶纯化。pFP988-Dldh L::Cm用XhoI和BamHI进行消化，且分离5558bp载体片段。使上游途径操纵子与整合载体连接，以产生pFP988-DldhL-P11-THC::Cm。
将pFP988-DldhL-P11-THC::Cm整合到植物乳杆菌BAA-793内，以形成包含外源thl、hbd和crt基因的植物乳杆菌ΔldhL1::T-H-C::Cm。植物乳杆菌的电转化感受态细胞如Aukrust，T.W.，等人(InElectroporation Protocols for Microorganisms；Nickoloff，J.A.，Ed.；Methods in Molecular Biology，第47卷；Humana Press，Inc.，Totowa，NJ，1995，第201-208页)所述制备。如Aukrust等人同上所述，电穿孔后，细胞在MRSSM培养基(补加了0.5M蔗糖和0.1M MgCl2的MRS培养基)于37℃不伴随振荡过度生长(outgrow)2小时。为了选择将电穿孔的细胞在包含氯霉素(10μg/mL)的MRS板上进行铺平板且于37℃温育。转化体通过菌落PCR扩增进行最初筛选以证实整合，且最初的阳性克隆随后通过PCR扩增使用一组引物更严格地筛选。
EgTER、ald和bdhB基因的质粒表达。剩余3种1-丁醇基因在植物乳杆菌ldhL启动子(Ferain等人，J.Bacteriol.176596-601(1994))控制下，由质粒pTRKH3(O＇Sullivan DJ和Klaenhammer TR，Gene 137227-231(1993))表达。ldhL启动子从植物乳杆菌ATCC BAA-793基因组进行PCR扩增，其中使用引物PldhL F(SEQ ID NO204)和PldhL R(SEQ ID NO205)。将369bp PCR产物克隆到pCR4Blunt-TOPO内且测序。所得到的质粒pCR4Blunt-TOPO-PldhL用SacI和BamHI进行消化，从而释放359 bp PldhL片段。
实施例14中描述的pHT01-ald-EB用SacI和BamHI进行消化，且通过凝胶纯化回收10503bp载体片段。使PldhL片段和载体连接，从而产生pHT01-Pldhl-ald-EB。
为了亚克隆ldhL启动子-ald-EgTER-bdh盒，用MluI消化pHT01-Pldhl-ald-EB，且用克列诺DNA聚合酶处理末端。线性化的载体用SalI进行消化，且将包含PldhL-AEB片段的4270bp片段凝胶纯化。质粒pTRKH3用SalI和EcoRV进行消化，且使凝胶纯化的载体片段与PldhL-AEB片段连接。将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞内，且将转化体在包含红霉素(150mg/L)的脑心浸液(Brain HeartInfusion)(BHI，Difco Laboratories，Detroit，MI)板上进行铺平板。转化体通过PCR进行筛选，以证实pTRKH3-ald-E-B的构建。如上所述通过电穿孔将表达质粒pTRKH3-ald-E-B转化到植物乳杆菌ΔldhL1::T-H-C::Cm内。
将包含pTRKH3-ald-E-B的植物乳杆菌ΔldhL1::T-H-C::Cm接种到250mL摇瓶内，所述摇瓶包含50mL MRS培养基加红霉素(10μg/mL)，且于37℃不伴随振荡生长18-24小时。18-24小时后，如一般方法部分中所述，通过HPLC或GC分析检测1-丁醇。
实施例19(预示的) 1-丁醇生物合成途径在粪肠球菌中的表达 这个预示的实施例的目的是描述如何在粪肠球菌中表达1-丁醇生物合成途径。粪肠球菌菌株V583的全基因组序列已得到公开(Paulsen等人，Science 2992071-2074(2003))，所述菌株V583在这个实施例中作为宿主菌株用于表达1-丁醇生物合成途径。质粒pTRKH3(O＇Sullivan DJ和Klaenhammer TR，Gene 137227-231(1993))-大肠杆菌/革兰氏阳性穿梭载体用于表达在1个操纵子中的1-丁醇途径的6种基因(thlA、hbd、crt、EgTER、ald、bdhB)。pTRKH3包含大肠杆菌质粒p15A复制起点和pAMβ1复制子，以及2种抗生素抗性选择标记-四环素抗性和红霉素抗性。四环素抗性只在大肠杆菌中表达，而红霉素抗性在大肠杆菌和革兰氏阳性细菌中均表达。质粒pAMβ1衍生物可以在粪肠球菌中复制(Poyart等人，FEMS Microbiol.Lett.156193-198(1997))。已通过乳链菌肽在多种革兰氏阳性细菌包括粪肠球菌中用于有效控制基因表达的诱导型nisA启动子(PnisA)(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998))，用于控制编码1-丁醇生物合成途径酶的6种所需基因的表达。
包含nisA启动子(Chandrapati等人，Mol.Microbiol.46(2)467-477(2002))的线性DNA片段(215bp)从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)基因组DNA进行PCR扩增，其中使用引物F-PnisA(EcoRV)(SEQ IDNO206)和R-PnisA(PmeI BamHI)(SEQ ID NO207)。215bp PCR片段用EcoRV和BamHI进行消化，且将所得到的PnisA片段凝胶纯化。质粒pTRKH3用EcoRV和BamHI进行消化，且将载体片段凝胶纯化。使线性化的pTRKH3与PnisA片段连接。通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞内，且转化体于37℃在包含红霉素(25μg/mL)的LB琼脂板上过夜生长后进行选择。转化体随后通过菌落PCR使用引物F-PnisA(EcoRV)和R-PnisA(BamHI)进行筛选，以证实pTRKH3-PnisA的正确克隆。
质粒pTRKH3-PnisA用PmeI和BamHI进行消化，且将载体凝胶纯化。质粒pHTO1-ald-EgTER-bdhB如实施例14中所述进行构建并用SmaI和BamHI进行消化，且将2,973bpald-EgTER-bdhB片段凝胶纯化。将2,973bpald-EgTER-bdhB连接到pTRKH3-PnisA载体内的PmeI和BamHI位点上。通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞内，且转化体于37℃在包含红霉素(25μg/mL)的LB琼脂板上过夜温育后进行选择。转化体随后通过菌落PCR用引物ald正向引物N27F1(SEQ ID NO31)和bdhB反向引物N65(SEQ ID NO44)进行筛选。所得到的质粒命名为pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB(＝pTRKH3-A-E-B)。
质粒pTRKH3-A-E-B从转化体中进行纯化，且用于进一步将剩余基因(thlA、hbd、crt)克隆到位于bdhB基因下游的BamHI位点内。质粒pTRKH3-A-E-B用BamHI进行消化，且用DNA聚合酶的克列诺片段处理，以产生平端。质粒pFP988Dss-thlA-hbd-crt(＝pFP988Dss-T-H-C)如实施例14中所述进行构建，且用SmaI和BamHI进行消化。所得到的2,973bpthlA-hbd-crt片段用DNA聚合酶的克列诺片段处理，以产生平端，且进行凝胶纯化。使2,973bpthlA-hbd-crt片段与线性化的pTRKH3-A-E-B连接。通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞内，且转化体于37℃在包含红霉素(25μg/mL)的LB琼脂板上过夜生长后进行选择。转化体随后通过菌落PCR用引物thlA正向引物N7(SEQ ID NO21)和crt反向引物N4(SEQ ID NO18)进行筛选。所得到的质粒命名为pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB-thlA-hbd-crt(＝pTRKH3-A-E-B-T-H-C)。质粒pTRKH3-A-E-B-T-H-C由大肠杆菌转化体制备，且使用本领域已知方法(Aukrust，T.W.，等人InElectroporationProtocols for Microorganisms；Nickoloff，J.A.，Ed.；Methods in MolecularBiology，第47卷；Humana Press，Inc.，Totowa，NJ.，1995，第217-226页)，通过电穿孔转化到电转化感受态粪肠球菌V583细胞内，从而导致产生粪肠球菌V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C。
通过电穿孔将第2种质粒转化到粪肠球菌V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C内，所述第2种质粒包含nisA调节基因、nisR和nisK、add9壮观霉素抗性基因、以及pSH71复制起点。包含pSH71复制起点的质粒与pAMβ1衍生物在粪肠球菌中是相容的(Eichenbaum等人，同上)。双重药物抗性转化体在包含红霉素(25μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂板上进行选择。
所得到的粪肠球菌菌株V583B具有2种质粒，即表达质粒(pTRKH3-A-E-B-T-H-C)和调节质粒(pSH71-nisRK)，被接种到包含50mL Todd-Hewitt液体培养基的250mL摇瓶内，所述Todd-Hewitt液体培养基补加了酵母提取物(0.2％)(Fischetti等人，J.Exp.Med.1611384-1401(1985))、乳链菌肽(20μg/mL)(Eichenbaum等人，同上)、红霉素(25μg/mL)、和壮观霉素(100μg/mL)。瓶于37℃不伴随振荡温育18-24小时，这之后，如一般方法部分中所述，通过HPLC或GC分析测量1-丁醇生产。
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
<120>4碳醇的发酵生产
<130>CL3241 PCT
<160>208
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<223>引物Spac R
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<213>人工序列
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<223>引物Bot CR
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<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物N3SeqF3
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N4SeqR3
<400>110
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物N5SeqF3
<400>111
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N7SeqR2
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N31SeqF1
<400>113
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N62SeqF2
<400>114
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N62SeqF3
<400>115
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>116
<210>117
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR1
<400>117
<210>118
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR2
<400>118
<210>119
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR3
<400>119
<210>120
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR4
<400>120
<210>121
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy SeqF2
<400>121
<210>122
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy SeqF
<400>122
<210>123
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy seqR
<400>123
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物SpacF Seq
<400>124
<210>125
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物sacB Up
<400>125
<210>126
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物sacB Dn
<400>126
<210>127
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物HT R
<400>127
<210>128
<211>1185
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>128
<210>129
<211>394
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>129
<210>130
<211>1182
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>130
<210>131
<211>393
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>131
<210>132
<211>1197
<212>DNA
<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>132
<210>133
<211>398
<212>PRT
<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>133
<210>134
<211>864
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>134
<210>135
<211>287
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>135
<210>136
<211>855
<212>DNA
<213>富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400>136
<210>137
<211>284
<212>PRT
<213>富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400>137
<210>138
<211>741
<212>DNA
<213>真养产碱菌(Alcaligenes eutrophis)
<400>138
<210>139
<211>246
<212>PRT
<213>真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)
<400>139
<210>140
<211>768
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>140
<210>141
<211>255
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>141
<210>142
<211>783
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>142
<210>143
<211>260
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>143
<210>144
<211>405
<212>DNA
<213>豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)
<400>144
<210>145
<211>134
<212>PRT
<213>豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)
<400>145
<210>146
<211>1912
<212>DNA
<213>小眼虫(Euglena gracilis)
<400>146
<210>147
<211>539
<212>PRT
<213>小眼虫(Euglena gracilis)
<400>147
<210>148
<211>1344
<212>DNA
<213>丘链霉菌(Sreptomyces collinus)
<400>148
<210>149
<211>447
<212>PRT
<213>丘链霉菌(Streptomyces collinus)
<400>149
<210>150
<211>1344
<212>DNA
<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>150
<210>151
<211>447
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>151
<210>152
<211>2589
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>152
<210>153
<211>862
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>153
<210>154
<211>1164
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>154
<210>155
<211>387
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>155
<210>156
<211>3883
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>156
<210>157
<211>477
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>157
<210>158
<211>304
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>158
<210>159
<211>415
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>159
<210>160
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr1
<400>160
<210>161
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr2
<400>161
<210>162
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr3
<400>162
<210>163
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr4
<400>163
<210>164
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT731
<400>164
<210>165
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT732
<400>165
<210>166
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT733
<400>166
<210>167
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT734
<400>167
<210>168
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT735
<400>168
<210>169
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT736
<400>169
<210>170
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT737
<400>170
<210>171
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT738
<400>171
<210>172
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT797
<400>172
<210>173
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT798
<400>173
<210>174
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT806
<400>174
<210>175
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT807
<400>175
<210>176
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT808
<400>176
<210>177
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT809
<400>177
<210>178
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT799
<400>178
<210>179
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT761
<400>179
<210>180
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT803
<400>180
<210>181
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT804
<400>181
<210>182
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT785
<400>182
<210>183
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT786
<400>183
<210>184
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT787
<400>184
<210>185
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PT805
<400>185
<210>186
<211>1269
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子最优化的ter
<400>186
<210>187
<211>398
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的Ter蛋白
<400>187
<210>188
<211>1484
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子最优化的ald
<400>188
<210>189
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>修饰的Ald
<400>189
<210>190
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PT800
<400>190
<210>191
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT758
<400>191
<210>192
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT754
<400>192
<210>193
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT755
<400>193
<210>194
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT760
<400>194
<210>195
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT792
<400>195
<210>196
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT791
<400>196
<210>197
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT765
<400>197
<210>198
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物LDHEcoRV F
<400>198
<210>199
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物LDH AatlR
<400>199
<210>200
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Cm F
<400>200
<210>201
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Cm R
<400>201
<210>202
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P11 F
<400>202
<210>203
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P11 R
<400>203
<210>204
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PldhL F
<400>204
<210>205
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PldhL R
<400>205
<210>206
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F-PnisA(EcoRV)
<400>206
<210>207
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物R-PnisA(PmeI BamHI)
<400>207
<210>208
<211>2460
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>模板DNA
<400>208
权利要求
1.一种重组微生物宿主细胞，其包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下述的底物至产物转化
a)乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A
b)乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A
c)3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A
d)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A
e)丁酰辅酶A至丁醛和
f)丁醛至1-丁醇；
其中所述至少一种DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的且其中所述微生物宿主细胞生产1-丁醇。
2.根据权利要求1的宿主细胞，其中催化乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是乙酰辅酶A乙酰转移酶。
3.根据权利要求1的宿主细胞，其中催化乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是3-羟丁酰辅酶A脱氢酶。
4.根据权利要求1的宿主细胞，其中催化3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是巴豆酸酶。
5.根据权利要求1的宿主细胞，其中催化巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是丁酰辅酶A脱氢酶。
6.根据权利要求1的宿主细胞，其中催化丁酰辅酶A至丁醛的底物至产物转化的所述多肽是丁醛脱氢酶。
7.根据权利要求1的宿主细胞，其中催化丁醛至1-丁醇的底物至产物转化的所述多肽是丁醇脱氢酶。
8.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述细胞选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
9.根据权利要求8的宿主细胞，其中所述细胞是选自梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属和糖酵母属的属的成员。
10.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
11.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是真养产碱菌。
12.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌。
13.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是浸麻类芽孢杆菌。
14.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是红串红球菌。
15.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是恶臭假单胞菌。
16.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是枯草芽孢杆菌。
17.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是植物乳杆菌。
18.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞选自屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、和粪肠球菌。
19.根据权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是啤酒糖酵母。
20.根据权利要求3的宿主细胞，其中所述乙酰辅酶A乙酰转移酶具有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO129、SEQ IDNO131、和SEQ ID NO133的氨基酸序列。
21.根据权利要求4的宿主细胞，其中所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶具有选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、和SEQ ID NO139的氨基酸序列。
22.根据权利要求5的宿主细胞，其中所述巴豆酸酶具有选自SEQID NO8、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、和SEQ ID NO145的氨基酸序列。
23.根据权利要求6的宿主细胞，其中所述丁酰辅酶A脱氢酶具有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ IDNO151、和SEQ ID NO187的氨基酸序列。
24.根据权利要求7的宿主细胞，其中所述丁醛脱氢酶具有选自SEQ ID NO12、SEQ ID NO153、和SEQ ID NO189的氨基酸序列。
25.根据权利要求8的宿主细胞，其中所述丁醇脱氢酶具有选自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、和SEQ ID NO157的氨基酸序列。
26.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞是兼性厌氧菌。
27.一种用于生产1-丁醇的方法，其包括
i)提供包含编码多肽的至少一种DNA分子的重组微生物宿主细胞，所述多肽催化选自下述的底物至产物转化
a)乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A
b)乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A
c)3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A
d)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A
e)丁酰辅酶A至丁醛和
f)丁醛至1-丁醇；
其中所述至少一种DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的；和
ii)使(i)的所述宿主细胞在由此生产1-丁醇的条件下与可发酵的碳底物接触。
28.根据权利要求27的方法，其中所述可发酵的碳底物选自单糖、寡糖和多糖。
29.根据权利要求27的方法，其中所述碳底物选自葡萄糖、蔗糖和果糖。
30.根据权利要求27的方法，其中由此生产1-丁醇的所述条件是厌氧的。
31.根据权利要求27的方法，其中由此生产1-丁醇的所述条件是微需氧的。
32.根据权利要求27的方法，其中所述宿主细胞在极限培养基中与所述碳底物接触。
33.根据权利要求27的方法，其中催化乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是乙酰辅酶A乙酰转移酶。
34.根据权利要求27的方法，其中催化乙酰乙酰辅酶A至3-羟丁酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是3-羟丁酰辅酶A脱氢酶。
35.根据权利要求27的方法，其中催化3-羟丁酰辅酶A至巴豆酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是巴豆酸酶。
36.根据权利要求27的方法，其中催化巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的底物至产物转化的所述多肽是丁酰辅酶A脱氢酶。
37.根据权利要求27的方法，其中催化丁酰辅酶A至丁醛的底物至产物转化的所述多肽是丁醛脱氢酶。
38.根据权利要求27的方法，其中催化丁醛至1-丁醇的底物至产物转化的所述多肽是丁醇脱氢酶。
39.根据权利要求27的方法，其中所述细胞选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
40.根据权利要求39的方法，其中所述细胞是选自梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属和糖酵母属的属的成员。
41.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是大肠杆菌。
42.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是真养产碱菌。
43.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌。
44.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是浸麻类芽孢杆菌。
45.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是红串红球菌。
46.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是恶臭假单胞菌。
47.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是枯草芽孢杆菌。
48.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是植物乳杆菌。
49.根据权利要求40的方法，其中所述细胞选自屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、和粪肠球菌。
50.根据权利要求40的方法，其中所述细胞是啤酒糖酵母。
51.根据权利要求33的方法，其中所述乙酰辅酶A乙酰转移酶具有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO129、SEQ ID NO131、和SEQ ID NO133的氨基酸序列。
52.根据权利要求34的方法，其中所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶具有选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、和SEQID NO139的氨基酸序列。
53.根据权利要求35的方法，其中所述巴豆酸酶具有选自SEQ IDNO8、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、和SEQ ID NO145的氨基酸序列。
54.根据权利要求36的方法，其中所述丁酰辅酶A脱氢酶具有选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、和SEQ ID NO187的氨基酸序列。
55.根据权利要求37的方法，其中所述丁醛脱氢酶具有选自SEQID NO12、SEQ ID NO153、和SEQ ID NO189的氨基酸序列。
56.根据权利要求38的宿主细胞，其中所述丁醇脱氢酶具有选自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、和SEQ ID NO157的氨基酸序列。
57.根据权利要求27的方法，其中所述宿主细胞是兼性厌氧菌。
全文摘要
提供了用于发酵生产4碳醇的方法。具体而言，丁醇，优选地1-丁醇通过表达1-丁醇生物合成途径的重组细菌的发酵生长来生产。
文档编号C12P7/16GK101432434SQ200680035878
公开日2009年5月13日 申请日期2006年9月28日 优先权日2005年9月29日
发明者G·K·唐纳森, L·L·黄, L·A·马吉奥-黑尔, V·纳加拉彦, C·E·纳卡穆拉, W·叔 申请人:纳幕尔杜邦公司