专利名称：：用于酮基化合物的立体选择还原的氧化还原酶的利记博彩app用于酮基化合物的立体选择还原的氧化还原酶本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物用氧化还原酶还4奪性还原的新的氧化还原酶。光学活性化合物是对于药学活性化合物、芳香物质、信息素、农业药品和酶抑制物的合成具有广泛应用性的有价值的手性子(chiron)。因而，手性化合物以及手性合成技术的提高的需求是在药物工业中特别受注意的，因为在将来，外消旋化合物难以用作药物制品。原手性酮基化合物的不对称还原是立体选择性催化的一部分，其中生物催化构成了对化学催化的强有力的竟争技术。化学的不对称氢化作用需要使用高度毒性和环境有害的重金属催化剂，使用极端的因而耗能的反应条件以及大量的有机溶剂。此外，这些方法通常特征是副反应和不充分的只于映体过量(enantiomericexcesse)。在自然中，原手性酮基化合物向羟基化合物的还原和相反的过程在许多生物化学途径中发生，在初级新陈代谢和在次级新陈代谢中，在每个器官中，并且被不同种类的仲醇脱氢酶和氧化还原酶催化。通常地，这些酶是辅因子依赖性的。基础可能性过:i模型系:的基础i被反复展现,'、其中分离的氧化还原酶和各种全细胞生物转化系统被用于该任务。从而，对于适度的反应条件、没有副产物和通常显著更可实现的对映体过量，生物催化方法成为非常有利的。对于可实现的对映体过量、降解产物和副产物的形成、以及对于产物分离，相对于涉及全细胞的方法，使用分离的酶是有益的。此外，使用全细胞处理不可能用于每一个化学公司，因为为此需要特定设备和知识。近来，可能展现的是，在具有有机溶剂的水性/有机两相系统中使用分离的氧化还原酶是极度有效的、经济的以及在高浓度(>5%)也是可行的。在所描述的系统中，通常在水中难溶的要还原的酮基化合物从而形成与有机溶剂在一起的有机相。并且，有机溶剂本身可能部分地被一起分配。在这种情况下，有机相从要还原的酮基化合物形成(DE10119274、DE10327454.4、DE10337401.9、DE10300335.5)。辅酶再生因而通过仲醇的同时发生的氧还而实现，为此，在大多数情况下，使用便宜的水可混合的2-丙醇。高对映体选择性的适合的R-和S-特异性氧化还原酶和脱氪酶的实例有来自Cam/Wa;Mra戶"ows的羰基还原酶(CPCR)(US5,523,223和US5,763,236(EnzymeMicrobTechnol.1993Nov;15(11):950-8"和来自尸,c/zz^c"/ww/"to(DE10327454.4)的羰基还原酶。来自红串红球菌(i^ot/ococc^eo^ro尸o/^)的羰基还原酶(RECR)(US5,523,223)、来自jVo/raWa/ksc(3(Biosci.Biotechnol.Biochem.,63(10)(1999)，pp.l721-1729)、(ApplMicrobiolBiotechnol.2003Sep;62(4):380-6.Epub2003Apr26)和赤红球菌(脇c/ococ，(JOrgChem.2003Jan24;68(2):402-6)的羰基还原酶。来自享L^干菌属(Z^"c^a"〃w力(Lactobacilluskefir(US5200335)、Lactobacillusbrevis(DE19610984Al)(ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.2000Dec;56Pt12:1696-8)、Lactobacillusminor(DE10119274)或假单胞菌属(尸化w允mo憩力(US05385833)(ApplMicrobiolBiotechnol.2002Aug;59(4-5):483-7.Epub2002Jim26.,J.Org.Chem.1992,57,1532)的R-特异性仲醇脱氬酶。然而，迄今已知的酶还不足够用于开发酮基化合物的立体选择性还原的完整市场潜力。一个方面，这可以由工业酶对于底物谱、最适pH值以及温度和溶剂稳定性具有非常不同的性质的事实来解释，所述性质通常是相互补充的。因而，甚至相对类似的同源酶可能对于一种特定的底物展现完全不同的转化行为。另一方面，不是几乎所有的所描述的酶都被克隆和可过量表达到足够的数量，这意味着这些酶对以工业使用是不可获得的。为了尽可能广泛地发挥酶学不对称氢化作用的合成潜力，因而必需的是拥有一包尽可能地广泛的、不同的工业可接受的氧化还原酶，所述氧化还原酶进一步适合于在具有有机溶剂的水性/有才几两相系统中使用。现在本发明的主题是多种新的、对映体选择性R-和S-特异性氧化还原酶，特征在于在水性/有机两相系统中良好的稳定性以及在大肠杆菌Escherichiacoli中良好的表达能力(>500单位/gE.coli湿重),以及程:5土。、'、'土、、'-'、、、根据本发明的氧化还原酶的特征在于它们具有氨基酸序列，在所述氨基序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸，或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸，或(c)至少65。/。的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸，或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸，或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸，或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸，或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。根据SEQIDNO:1的多肽可以从酵母、特别是从红酵母属(Rhodotorula)的酵母、特别是从粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:9，其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:l的蛋白。来自粘质红酵母的氧化还原酶促还原，例如，2-辛酮为S-2-辛醇，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。来自粘质红酵母的氧化还原酶是，例如，具有SDS-凝胶中测定的分子量30土2kDa的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围从7.0到8.0,氧化反应的最佳pH值在8.5-10的范围内。来自粘质红酵母的氧化还原酶展现了良好的温度和pH值稳定性，并在5.5到10的pH值范围中和最高达35。C的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。此外，来自粘质红酵母的氧化还原酶展现了有机溶剂中的高稳定性。根据SEQIDNO:2或SEQIDNO:8的多肽可以从酵母、特别是,人毕赤酵母属CP/'c/n'")、念珠菌属(C""c^/")、尸"c/z;Ayo/e"、DeZ"rom少ces或/M""c/7e"/h'a属的酵母、特别是从粉状毕赤酵母(尸Zc/n"/"n"we)DSMZ3316或CandidanemodendraDSMZ70647获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:10和核酸序列SEQIDNO:16,其分别编码氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:8。所述氧化还原酶优选地还原2-丁酮成R-2-丁醇，并优选地氧化2-丁醇的两种对映体中的R-2-丁醇。来自粉状毕赤酵母(尸,c/n'a/an"ora)的氧化还原酶展现了与针对R-2-辛醇相比显著更高的针对R-2-丁醇和2-丙醇的活性,此外，该酶展现了与针对2-辛酮相比显著更高的针对丙酮和2-丁酮的活性。然而，来自Candidanemodendra的氧化还原酶展现了针对R-2-丁醇、2-丙醇和R-2-辛醇的相似的活性，此外，该酶还展现了针对2-辛酮的大约相似的活性。来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2kDa的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围从5.0到6.0，氧化反应的最佳pH值在7.5-10的范围内。来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性，并在5.5到10的pH值范围中、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。来自Candidanemodendra的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2kDa的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值是pH6,氧化反应的最佳pH值范围从10到11。来自Candidanemodendra的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性，并在6.5到9.5的pH值范围中、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的多肽可以从酵母、特别是从毕赤酵母属和念珠菌属的酵母、特别是从树干毕赤酵母(Pichiastipitis)DSMZ3651和PichiatrehalophilaDSMZ70391获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:11和核酸序列SEQIDNO:15,其分别编码SEQIDNO:3和SEQIDNO:7的多肽。来自毕赤酵母属和念珠菌属的酵母的羰基还原酶，其具有与氨基酸序列SEQIDNO:3的至少65°/。同一性，或与氨基酸序列SEQIDNO:7的至少50%同一性，优选地还原2-辛酮成S-2-辛酮，并优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它们还特别适合于4-卣代乙酰乙酸酯还原成R-4-囟代-3-羟基丁酸酯。来自树干毕赤酵母的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量36±2kDa的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围从5.5到6.5，氧化反应的最佳pH值范围是6.5-8.0。来自树干毕赤酵母的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性，并在5.5到10的pH值范围中、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。来自Pichiatrehal叩hila的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量36±2kDa的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是7-7.5,氧化反应的最佳pH值范围是7-8。根据SEQIDNO:4的多肽可以从明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌、特别是从肉色明串珠菌(Leuconostoccar簡um)DSMZ5576获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:12,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:4的蛋白。所述多肽特别适合于2-辛酮向R-2-辛醇的还原，以及适合于R-2-辛醇的氧化。它还非常适合于4-卣代乙酰乙酸酯向S-4-囟代-3-羟基丁酸酯的还原。来自肉色明串珠菌的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2kDa的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是5.0到6.0，氧化反应的最佳pH值范围是6.0-9.0。来自肉色明串珠菌的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性，并在4.5到10的pH值范围中以及在最高达35。C的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:5的多肽可以从放线细菌(Actinobactena)纲的细菌、特别是从微杆菌属(Microbacterium)的细菌、特别是从微杆菌属细菌DSMZ20028获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:13，其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:5的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛酮向S-2-辛醇的还原，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卤代乙酰乙酸酯向R-4-卤代-3-羟基丁酸酯的还原。来自微杆菌属细菌DSMZ20028的氧化还原酶是，例如，具有SDS-凝胶中测定的分子量35±2kDa的同型四聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是6.0到7.5,氧化反应的最佳pH值范围是7.5-9.5。来自微杆菌属细菌的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性，并在4.5到10的pH值范围中以及在最高达5(TC的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:6的多肽可以从放线细菌(Actinobacteria)纲的细菌、特别是从戈登氏菌属(Gordona)的细菌、特别是从深红戈登氏菌(Gordonarubripertincta)DSMZ43570获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:14,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:6的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛酮向S-2-辛醇的还原，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卣代乙酰乙酸酯向R-4-卣代-3-羟基丁酸酯的还原。来自深红戈登氏菌DSMZ43570的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量41±3kDa的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是4.5到5.5,氧化反应的最佳pH值范围是7.5到9.5。来自深红戈登氏菌DSMZ43570的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性，并在4.5-10的pH值范围中以及在最高达55。C的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:129的多肽可以从酵母、特别是从路德酵母属(Lodderomyces)、4+另'J是乂人LodderomyceselongisporusDSMZ70320获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:130,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:129的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛酮向S-2-辛醇的还原，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卣代乙酰乙酸酯向R-4-囟代-3-羟基丁酸酯的还原。此外，本发明涉及融合蛋白，其特征在于它们代表具有氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化还原酶或其同源物，其在N-末端或羧基末端肽键地连接到进一步的多肽。融合蛋白可以，例如，更容易地从其他蛋白分离，或可以以更大的数量重组表达。此外，本发明涉及抗体，所述抗体特异性地结合根据SEQIDNO.-1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO.6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化还原酶或结合其同源物。这些抗体的产生根据已知的方法通过免疫适合的动物和随后回收抗体来进行。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的。氨基酸序列的比较可以，例如，在互联网上在蛋白质数据库例如SWISS-PROT、PIR以及在DNA数据库例如EMBL、GeneBank等等中使用FASTA程序或BLAST程序进行。在这样做时，通过BLAST算法(BasicLocalAlignementSearchTool)(幽c'/m/"/，，尸rac.淑/.Jcc/.园.S7,"(5dS)的方式确定最佳比对。作为基础，使用PAM30矩阵作为评估序列相似性的计分矩阵。(Da>^o#/Sc/zvrac兄M，Ocw",S.C./97&,5广3>Z)aj^of广edJ345-352,iV""owa/S/omed/ca/Ae化0Tc//ow<ia/7o)。此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQIDNO:l的片段，每个片段具有数量超过26个的氨基酸。本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MPATLRLDK(SEQIDNO:17)和/或C-末端氨基酸序列QALAAPSNLAPKA(SEQIDNO:18)和/或内部部分序列VEIIKTQVQD(SEQIDNO:19)、KVAIITGGASGIGL(SEQIDNO:20)、SCYVTPEG(SEQIDNO:21)、TDFKVDGG(SEQIDNO:20)、VMFNNAGIMH(SEQIDNO:23)或VHAREGIRIN(SEQIDNO:24)之一。此外，本发明还涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQIDNO:2的片段，每个片段具有数量超过15个的氨基酸。本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MAYNFTNKVA(SEQIDNO:25)和/或C-末端氨基酸序列TTLLVDGGYTAQ(SEQIDNO:26)和/或内部部分序列EYKEAAFTN(SEQIDNO:27)、NKVAIITGGISGIGLA(SEQIDNO:28)、DVNLNGVFS(SEQIDNO:29)、HYCASKGGV(SEQIDNO:30)、NCINPGYI(SEQIDNO:31)或LHPMGRLGE(SEQIDNO:32)之此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQIDNO:3的片段，每个片段具有数量超过15个的氨基酸。本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MSIPATQYGFV(SEQIDNO:33)和/或C-末端氨基酸序列SAYEGRVVFKP(SEQIDNO:34)和/或内部部分序列CHSDLHAIY(SEQIDNO:35)、GYQQYLLVE(SEQIDNO:36)、TFDTCQKYV(SEQIDNO:37)、LLTPYHAM(SEQIDNO:38)、LVSKGKVKP(SEQIDNO:39)、GAGGLGVNG(SEQIDNO:40)、IQIAKAFGAT(SEQIDNO:41)或LGSFWGTS(SEQIDNO:42)之一。此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQIDNO:4的片段，每个片段具有数量超过18个的氨基酸。本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氬酶，其包含N-末端氨基酸序列MTDRLKNKVA(SEQIDNO:43)和/或C-末端氨基酸序列AEFVVDGGYLAQ(SEQIDNO:44)和/或内部部分序列VVITGRRAN(SEQIDNO:45)、GGASII丽S(SEQIDNO:46)、TQTPMGHI(SEQIDNO:47)或GYIKTPLVDG(SEQIDNO:48)之一。此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQIDNO:5的片段，每个片段具有数量超过18个的氨基酸。本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MKALQYTKIGS(SEQIDNO:49)和/或C-末端氨基酸序列LAAGTVRGRAVIVP(SEQIDNO:50)和/或内部部分序列CHSDEFVMSLSE(SEQIDNO:51)、VYGPWGCGRC(SEQIDNO:52)、VSLTDAGLTPYHA(SEQIDNO:53)、LRAVSAATVIAL(SEQIDNO:54)或DFVGADPTI(SEQIDNO:55)之一。此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQIDNO:6的片段，每个片段具有数量超过26个的氨基酸。本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MKAIQIIQ(SEQIDNO:56)和/或C-末端氨基酸序列DLRGRAVVVP(SEQIDNO:57)和/或内部部分序列TAAGACHSD(SEQIDNO:58)、TPYHAIKPSLP(SEQIDNO:59)、DFVGLQPT(SEQIDNO:60)、VYGAWGCG(SEQIDNO:61)、DDARHLVP(SEQIDNO:62)、MTLGHEGA(SEQIDNO:63)或GGLGHVGIQLLRHL(SEQIDNO:64)之一。此外，本发明涉及包含一个或几个核酸序列的克隆载体，所述核酸序列编码根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的羰基还原酶或其同源物。此外，本发明包含克隆载体，其除了羰基还原酶之外包括用于NAD(P)的再生的适合的酶，例如，曱酸脱氢酶、醇脱氬酶或葡萄糖脱氢酶。此外，本发明涉及位于细菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞中的、包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码根据SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的羰基还原酶或其同源物，并以适合的方式连接到表达控制序列。此外，本发明涉及重组宿主细胞，其是细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，并且用这样的表达载体转化或转染，还涉及根据培养这种重组宿主细胞获得羰基还原酶的生产方法。适合的克隆载体是，例如，ppCR-Scrip、pCMV-Script、pBluescript(Stratagene)、pDrive克隆载体(Quiagen,Hilden，Germany)、pSBlue、pETBlue、pETLIC载体(Novagen，Madison,USA)和TA-PCR克隆载体(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)。适合的表达载体是，例如，pKK223-3、pTrc99a、pUC、pTZ、pSK、pBluescript、pGEM、pQE、pET、PHUB、pPLc、pKC30、pRMl/pRM9、pTrxFus、pASl、pGEx、pMAL或pTrx。适合的表达控制序列是，例如，trp-lac(tac)启动子、trp-lac(trc)启动子、lac启动子、T7启动子或入pL启动子。根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化还原酶或其同源物可以以这样的方式获得，其中培养上述重组E.coli细胞，诱导相应的氧化还原酶的表达，随后在约10到18小时之后，通过超声波处理、在球形磨(Retsch，GmbH,HaanGermany10分钟，24Hz)中用玻璃珠湿磨或使用高压匀化器来消化细胞。获得的细胞提取物可以直接使用或进一步纯化。为此，例如，细胞提取物被离心，获得的上清液进行离子交换层析，例如，通过在Q-SepharoseFastFlow(Pharmacia)上离子交4灸层才斤。此外，本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下使用氧化还原酶来还原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化还原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸，或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸，或(c)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸，或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸，或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸，或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸，或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。根据本发明的所述方法的进一步优选的实施方式在于所述酮基化合物具有通式IR广C(0)-R2(I)其中所迷R1代表以下部分之一1)-(d-C20)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，2)-(C2-C20)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达四个双键，3)-(C2-C2Q)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有最多达四个三键，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(d-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被-OH、卣素、-N02和/或-NH2取代一次、两次或三次，或7)-(C3-C7)-环烷基，其中在1)到7)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卤素、-N02和/或-NH2取代一次、两次或三次，R2代表以下部分之一8)-(01-05)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，9)-(02-00-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达三个双键，10)-(。2-(:6)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有两个三键，或11)-(d-do)-烷基-C(O)-O-(C广C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，并且是未取代的或被-OH、囟素、-^102和/或-^^2取代一次、两次或三次，其中在8)到11)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卣素、"^〇2和/或-^02取代一次、两次或三次。此外，本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下使用氧化还原酶来还原，所述方法特征在于使用的氧化还原酶(a)由来自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:130的组的核酸序列编码，或(b)由核酸序列编码，该核酸序列的互补链在高度严格条件下与(a)中所述核酸序列之一杂交。术语"芳基"被理解为在环内包含6到14个碳原子的芳香碳部分。-(C6-C14)-芳基部分是，例如，苯基、萘基，例如，l-萘基、2-萘基、联苯基，例如，2-联苯基、3-联苯基和4-联苯基，蒽基或芴基。联苯基部分、萘基部分以及特别是苯基部分是优选的芳基部分。术语"卣素"，被理解为来自氟、氯、溴、碘家族的元素。术语"-(d-C2Q)-烷基"被理解为烃部分，它的碳链是线性链或是分支的，并且包含1到20个碳原子，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或葵基。术语"-Co-烷基"被理解为共价键。术语"-(C3-C7)-环烷基"被理解为环烃部分，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。术语"-(C5-C14)-杂环"代表单环或双环的5成员到14成员的杂环形环，其是部分地或完全地饱和的。N、O和S是杂原子的实例。衍生自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、唑、噻唑、异p塞唑、四唑、1,2,3,5-卩恶p塞二唑-2-氧化物、三唑酮、f感二唑酮、异卩恶唑酮、ff恶二唑啉硫酮、—皮F、-CN、-CF3或-C(O)-O-(Cl-C4)烷基取代的三唑、3-羟基吡咯-2，4-二酮、5-氧代-l，2,4-噻二唑、吡啶、吡。秦、嘧啶、口引哚、异吲咮、吲唑、2.3-二氮杂萘、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、咔啉的部分，所迷杂环的苯并稠合的，环戊二烯并、环己二烯并或环庚三烯并稠合的的衍生物。所述部分特别优选的是2-或3-吡咯基、苯基吡咯基，例如4-或5-苯基吡咯基、2-呋喃基、2-噻吩基、4-咪唑基、曱基咪唑基，例如l-甲基-2-、-4-或-5-咪唑基，1,3-漆哇-2-基、2-他咬基、3-吡啶基、4-吡啶基，2-、3-或4-吡啶-N-氧化物、2-吡。秦基，2-、4-或5-嘧啶基，2-、3-或5-吲哚基，取代的2-吲哚基，例如l-甲基、5-曱基、5-甲氧基、5-千氧基-、5-氯-或4,5-二甲基-2-吲哚基，l-苄基-2-或-3-口引哚基,4,5,6,7-四氢-2-吲哚基，环庚三烯并[b]-5-吡咯基，2-、3-或4-喹啉基，1_、3-或4-异喹啉基，l-氧代-l,2-二氢-3-异喹啉基，2-喹喔啉基，2-苯并呋喃基，2-苯并噻吩基，2-苯并P恶唑基或苯并噻唑基或二氢吡啶基，吡咯烷基，例如2-或3-(N-甲基吡咯烷基)，哌。秦基，吗啉基，硫代吗啉基，四氢噻吩基或苯并二氧杂环戊烷基。优选的具有式I的化合物是，例如，4-氯-乙酰乙酸乙酯，乙酰乙酸甲酯，8-氯-6-氧代辛酸乙酯，3-氧代戊酸乙酯，4-雍基-2-丁酮，2-氧代戊酸乙酯，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，丙酮酸乙酯，乙醛酸乙基苯基酯，l-苯基-2-丙酮，2-氯-l-(3-氯苯基)乙烷習l-酮,苯乙酮，2-辛酮,3-辛酮，2-丁酮，l-[3,5-二(三氟曱基)苯基]乙烷-l-酮，2,5-己二酮，1.4-二氯-2-丁酮，乙酸基丙酮，苯酰曱基氯，4-溴乙酰乙酸乙酯，1,1-二氯丙酮，1,1,3-三氯丙酮或l-氯丙酮。在根据本发明的方法中，氧化还原酶可以以完全纯化的或部分纯化的状态使用，或者所述方法可以用含有根据本发明的氧化还原酶的细胞来进行。在这样做时，使用的细胞可以以天然的、渗透化的或裂解的状态来提供。优选的相应地使用根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化还原酶或其同源物。每kg要转化的式I的化合物使用5.000到10MioU的氧化还原酶(没有上限)。酶单位1U相应于每分钟(min)转化1)umol式I化合物所需的酶数量。酶促还原本身在温和条件下进行，从而产生的醇不进一步反应。根据本发明的方法展现了高残留时间、和产生的手性醇的一般超过95%的对映异构纯度、和高产率，相对于所采用的酮基化合物的量。在根据本发明的方法中，基于总体积，以3%到50%的数量、优选的5%到40%、特别是10%-30%来使用羰基化合物。此外，本发明的优选的实施方式的特征在于在还原期间形成的NAD或NADP被分别持续地还原成NADH或NADPH,使用共底物。所述共底物分别与相应的醛或酮以及NADH或NADPH反应，分别借助于氧化还原酶和NAD或NADP。这分别导致NADH和NADPH的再生。基于总体积，用于借此再生的共底物的比例从按体积的5%到95%。对于辅因子的再生，可以添加另外的醇脱氢酶。适合的NADH依赖性醇脱氬酶是可获得的，例如，来自面包酵母、来自Candidaboidinii、Candidaparapsilosis或Pichiacapsulata。此夕卜，适合的NADPH依赖性醇脱氢酶在短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(DE19610984Al)、稍小乳杆菌(Lactobacillusminor)(DE10119274)、假单胞菌(Pseudomonas)(US5,385,833)中或在布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobiumbrockii)中存在。这些醇脱氢酶的适合的共底物是已经提及的仲醇，例如乙醇、2-丙醇(异丙醇)、2-丁醇、2-戊醇、4-曱基-2-戊醇、2-辛醇或环己醇。此外，辅因子再生也可以^_用例如NAD-或NADP-依赖性加酸脱氬酶来实现(Tichkov等人，J.Biotechnol.Bioeng.[1999]64,187-193,Pilot-scaleproductionandisolationofrecombinantNADandNADPspecificFormatedehydrogenase)。曱酸脱氢酶的适合的共底物是，例如，甲酸的盐，如曱酸铵、甲酸钠或曱酸钓。然而，根据本发明的方法优选地没有这种额外的脱氢酶来进行，即，发生底物联结的辅酶再生。酶促还原进行的反应混合物的水性部分优选的含有緩冲液，例如，磷酸钾、tris/HCl或三乙醇胺緩沖液，具有5到10的pH值，优选的6到9的pH值。此外，所述緩沖液可以包含离子用于稳定或活化所述酶，例如锌离子或镁离子。当进行本发明的方法时，温度适合地在约l(TC到7(TC的范围内，优选的20。C到40°C。在根据本发明的方法的进一步优选的实施方式中，在存在有机溶剂的情况下实现所述酶学转化，所述溶剂是与水不可混溶的，或与水可混溶的仅到有限的程度。例如，所述溶剂是对称的或不对称的二可溶的仲醇。例如，优选的有机溶剂是乙醚、叔丁基曱基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷、2-辛醇、2-庚醇、4-甲基-2-戊醇或环己烷。同时，所述溶剂也可以充当辅因子再生的共底物。如果分别使用水可溶的溶剂和共底物，反应批次由水性和有机相构成。底物根据它的溶解度分布在有机相和水相中。基于总反应体积，有冲几相一般具有5到95%的比例，优选的10%到90%。优选的枳^戒地混合两种液相从而在它之间产生大的表面。同样在这个实施方式中，在酶促还原期间分别形成的NAD或NADP被分别还原回NADH或NADPH，使用如上描述的共底物。NADH或NADPH分别在水相中的浓度一般从0.001mM到1mM，特别是从0.01mM到0.1mM。在根据本发明的方法中，氧化还原酶/脱氢酶的稳定剂可以另外使用。适合的稳定剂是，例如，甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫苏糖醇、二曱亚石风(DMSO)。例如，在由玻璃或金属制成的封闭反应容器中进行根据本发明的方法。为此，成分被单独地转移到反应容器中并在气体，例如氮气或空气的情况下搅动。反应时间从1小时到48小时，特别是从2小时到24小时。随后，加工反应混合物。为此，分离水相，过滤有才几相。所述水相可以任选的提取一次或多次并可以如有机相一样进一步处理。随即，任选的从过滤的有机相蒸发溶剂。此外，本发明涉及获得式II的手性羟基化合物的方法，(d-C6)烷基酯、Rl國C(OH)-R2(II)其中Rl和R2如以上定义的，其特征在于a)在存在根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的本发明的氧化还原酶或其同源物之一、NAD(P)和水的情况下孵育含有式n的外消旋化合物的混合物，从而式II的羟基化合物的对映体被转化成相应的酮化合物和NAD(P)H,以及b)分离式II的羟基化合物的剩余的对映体。如果使用根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:129的羰基还原酶，优选的获得相应的手性R-羟基化合物。如果使用根据SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8的羰基还原酶，优选的获得相应的S-轻基化合物。反应混合物基本上与上述的式I的酮基化合物的对映异构特异性还原方法的相同。然而，式I的酮基化合物的对映异构特异性还原和式II化合物的外消旋混合物不同，式II的羟基化合物的仅一种对映体被对映异构地氧化成相应的酮基化合物。因而，式II的羟基化合物的相对的对映体保留下来并可以被分离。此外，除了用作共底物的醇，例如乙醇、2-丙醇(异丙醇)、2-丁醇、2-戊醇或2-辛醇，在NAD的再生的过程中使用其相应的酮例如丙酮。例如，通过根据本发明的氧化还原酶或其他脱氢酶，丙醇和NAD(P)H纟皮转化成NAD和异丙醇。通过以下的实施例进一步详细地说明了本发明的优选的实施方式。f农糸的潜#和蔬差还#躇话^W谬逸为了筛选，在以下培养基中培养酵母菌林粘质红酵母DSMZ70825、粉状毕赤酵母DSMZ3316、CandidanemodendraDSMZ70647、树干毕赤酵母DSMZ3651和PichiatrehalophilaDSMZ70391、LodderomyceselongisporusDSMZ70320:酵母提取物(3)、麦芽提取物(3)、蛋白胨(5)和葡萄糖(10)(在每种情况下，括号中的数字单位g/1)。培养基在121。C灭菌，酵母在25。C没有进一步pH调节的、在160转每分钟(rpm)的摇动器上培养。菌抹LeuconostoccarnosuDSMZ5576在以下培养基中培养葡萄糖(20)、酵母提取物(5)、麦芽提取物(10)、柠檬酸氢二铵(2)、醋酸钠(5)、硫酸镁(0.2)、硫酸锰(0.05)、磷酸氢二钾(2)。培养基在12rC灭菌，在3(TC培养有机体，没有进一步的pH调节或氧供应。菌株Microbacteriumspec.DSMZ20028在酵母提取物(3)和胰酶大豆粉(30)的培养基上在3(TC用160转每分钟(rpm)培养。菌林深红戈登氏菌DSMZ43570在酵母提取物(4)、葡萄糖(4)、麦芽提取物(10)和CaC03(2)的培养基上在37。C用160转每分钟(rpm)培养。随后使用800^1消化緩沖液(100mM三乙醇胺(TEA),pH=7.0)重悬浮125mg细胞，与1g玻璃珠混合，在球磨(Retsch)中在4。C消化10分钟。在12.000rpm离心2分钟后获得的上清液(溶胞产物)在随后的活性筛选中使用，并用于测定对映体过量(ee-值)。使用不同的酮，例如2-丁酮、2-辛酮、4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮或2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作为底物。活性筛选的批次860|ul0.1MKH2P04/K2P04pH=7.0lmMMgCl220|ulNADPH或NADH(10mM)20|ul溶胞产物100pi底物(100mM)在340nm跟踪反应1分钟。用于ee-值测定的批次20|iil溶胞产物100)ulNADH或NADPH(50mM)60^1底物(100mM)在24小时(h)之后，使用例如氯仿提取用于ee测定的批次，经由气相色谱(GC)测定对映体过量。对映体过量如下计算ee(%)=((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇)x100表1DSMZNo.微生物活性，U/g宿主有一几体细胞2-丁酮2陽辛酮NADHNADPHNADHNADPH70825粘质红酵母<1<13316粉状毕赤酵母12<170647Candidanemodendra45123651树干毕赤酵母106.470391Pichiatrehalophila85455576肉色明串珠菌777720028微杆菌属92643570深乡工戈登氏菌7.71370320Lodderomyceselogisporus4034----DSMZ代表DeutscheSammlungfiirMikroorganismenundZellkulturen,MascheroderWeglb,38124Braunschweig。酶单位的定义1U相应于每分钟转化l|umol底物所需的酶数量。A^D「尸」//汆^'^凝^#真^还/^躇^为、庠^遂^为了分离NAD(P)H依赖性微生物氧化还原酶，如实施例1中描述培养微生物体。在达到稳定阶段时，通过离心从培养基收获和分离细胞。通过使用玻璃珠湿磨实现酶释放，但也可以通过其他消化方法实现。为此，例如，100g的湿细胞团用400ml消化緩冲液(100mM三乙醇胺，lmMMgCl2,pHH7.0)悬浮，通过French压力的方法匀质化。在离心(7000rpm)后获得的粗提取物然后经由FPLC(快速蛋白液相层析)来纯化。根据本发明的所有氧化还原酶可以通过不同组合的离子交换层析例如,在Q-SepharseFastFlow(Pharmacia)或UnoQ(Biorad,Munich,Germany)上、疏7K相互作用层析，例如在Octyl-SepharoseFastFlow或Butyl-SepharoseFastFlow(Pharmacia)上、陶资轻石辟灰石层析和凑是胶渗透来纯化。4《為、炎^^發孕AS"MZ的A^4D//^谢^真必还^雄的遂必对于蛋白质分离，在离心后获得的来自為V乂'^^,母DSMZ3316的溶胞产物直接施加到用100mM三乙醇胺緩沖液pH=7.01M(NH4)S04平衡的Butyl-SepharoseFF柱上，用降低的线性盐梯度洗脱。组合含有氧化还原酶的级分并通过超滤(排阻限制10kDa)的方式浓缩到适合的体积。随后，氧化还原酶的浓缩的级分进一步通过Uno.Q纯化。为此，氧化还原酶直接施加到用50mM磷酸钾緩冲液pFN7.0平衡的UnoQ柱(Biomd)上并用提高的线性盐梯度洗涤，借此氧化还原酶在0MNaCl洗脱而没有结合，而混杂物的主要部分是结合的并在更高的盐浓度下洗脱。第三个纯化步骤在陶乾羟磷灰石柱(Pharmacia)上进行，其中氧化还原酶被施加到用10mM磷酸钾緩沖液、lmMMgCl2pH=6.8平衡的柱上，使用提高的緩冲液浓度洗脱(400mM磷酸钾緩冲液lmMMgCl2pH=6.8)。在80-100mM磷酸钾緩冲液处洗脱氧化还原酶。由此，获得的纯化氧化还原酶的分子量经由凝胶渗透来测定(Superdex200HR;Pharmacia,100mM三乙醇胺，pH=7,0.15MNaCl)。过氧化氢酶(232kDa)、醛缩酶(158kDa)、白蛋白(69.8kDa)和卵清蛋白(49.4kDa)被用作分子量标准。以下的表2概括了获得的结果。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在根据实施例1(分批活性筛选)的测试系统中测定氧化还原酶的酶活性，蛋白质数量的测定根据Lowryetal.,JournalofBiologicalChemistry,193(1951):265-275或Petersonetal.,AnalyticalBiochemicstry,100(1979):201-220)进行。酶活性比蛋白质数量的商产生比活性，其中1pmol每分钟的转化相应于1单位(U)。4《凝^霧4AStUZ的^谢^真必还^箱的^^对于蛋白质分离，在离心后获得的来自A^'cra^"en'ww2W2S的溶胞产物直接施加到用50mM磷酸钾緩沖液pH=7.0平衡的Q-SepharoseFF柱上，用提高的线性盐梯度洗脱。从而，氧化还原酶在0.6到0.8MNaCl处洗脱。组合含有氧化还原酶的级分并通过超滤(排阻限制10kDa)的方式浓缩到适合的体积。随后，氧化还原酶的浓缩的级分进一步通过Uno.Q纯化。为此，氧化还原酶直接施加到用50mM磷酸钾緩沖液pH=7.0平衡的UnoQ柱(Biorad)上并用提高的线性盐梯度洗涤，借此氧化还原酶在0.2-0.25MNaCl洗脱。第三个纯化步骤在陶资羟磷灰石柱(Pharmacia)上进行，其中来自微7f萄^4ASA/Z2⑧2S的氧化还原酶被施加到用10mM磷酸钾緩冲液、lmMMgCl2pH=6.8平衡的柱上，使用提高的緩沖液浓度洗脱(400mM磷酸钾緩冲液lmMMgCl2pH=6.8)。在80-100mM磷酸钾緩沖液处洗脱氧化还原酶。由此，获得的纯化氧化还原酶的分子量如2a所描述的测定。以下的表3概括了获得的结果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>橫孩本发'效^真必还f渗^在10%十二烷基石克酸钠(SDS)凝胶中凝胶渗透之后，根据实施例2的酶制品被分离并转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上。显著的条带进行经由Edman降解的N-末端测序(Procise492(PE-Biosystems))。从庠的/,键辱應產齊的一處^;發衷^才艮据Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法才是取染色体DNA。产生的核酸充当使用简并引物的聚合酶链式反应(PCR)的模板。在这样做时，5'引物来自氨基酸序列(SEQIDNO:66、72、80),3，引物来自氨基酸序列(SEQIDNO:67、73、81),涉及特异于有机体的遗传编码(SEQIDNO:68、68、74、75、82、83)。在PCR緩冲液[67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04，115mMMgCl2,0.01%Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、40pMol每种引物和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]中进行扩增。在BioThermStar聚合酶活化(95°C8分钟)和随后45-50个循环的Touch-DownPCR之后，反应冷却到4°C,整个PCR批次施加到1%琼脂糖凝胶上用于分析。来自聚合酶链式反应的特异性片段被连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中，并使用引物M13rev(SEQIDNO:65)和M13uni(SEQIDNO:128)借助ABIDNA测序仪来测序。基因编码序列的5，和3，末端区域使用RACE方法(cDNA末端的快速扩增)来测定。根据特异性片段的核酸序列，构建3，-RACE和5，-RACE的寡核苷酸。从细胞制备的总RNA充当模板用于利用3，-RACE系统(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)的第一cDNA链的合成。这随后是借助3，-RACE寡核苷酸(SEQIDNO:76、77、84、85)的特异性cDNA的扩增和再扩增。随后，批次施加到1%琼脂糖凝胶上用于分析。携带缺失3'-侧翼序列信息的特定片段被分离，连接到TA克隆载体pCR2.1并测序。序列的编码和非编码5'末端序列使用5'-RACE系统(Invitrogen)来测定。为此，来自早先获得的总RNA的mRNA借助OligodT-纤维素(NEB，Beverly,USA)来富集，并用于利用基因特异性寡核苷酸(SEQIDNO:70;71;78;79;86;87)的第一cDNA链的合成。特异性cDNA的随后的扩增和再扩增产生片段，其被连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen)用于分析。借助ABIDNA测序仪分析含有片段的质粒。因而，获得关于基因的5'末端的缺失序列信息。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>根据编码全长基因(SEQIDNO:9;10;11)的序列，构建了用于随后将所述DNA片段克隆到适合的表达系统中的特异性引物。为此，例如，分别具有NdeI的识别序列、或具有SphI的识别序列、或BamHI的识别序列的5'引物，以及具有HindIII的识别序列的3，引物被修饰(SEQIDNO:89;90;91;92;93;94;95;96)。在随后的PCR中，染色体DNA充当;^莫板。编码相应的氧化还原酶的DNA片段借助尸/W,wwwp/jc聚合酶(Invitrogen)来扩增。在1%琼脂糖凝胶上纯化之后，产生的PCR产物用适合的DNA内切酶处理，并分别连接到pET21载体(Novagen，Madison,USA)的主干中、或pQE70载体(Qiagen，Hilden,Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸内切酶处理。在测序之后，形成表达构建体被分别带入表达菌林BL21Star(Invitrogen)或RB791(E.coli遗传库，Yale,USA)。叙^《###炎^^##^#键傳这#^真^还^痴时^發对于从粉状毕赤酵母克隆氧化还原酶，例如，根据Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法从粉状毕赤酵母的新鲜细胞提取染色体DNA。产生的核酸充当利用寡核苷酸SEQIDNO:74、75的Touch-DownPCR的模板。在PCR循环仪(BioRad,Hercule，USA)中活化BiothermStar聚合酶8分钟之后，编程以下30个循环用于特异性DNA片段的鉴定94°C45秒60。C-0.5。C/循环45秒68°C2分钟随后，通过另外20个循环提高扩增信号94。C40秒52°C40秒72°Cl分钟。在1%琼脂糖凝胶中整个反应批次的分级之后，检测到具有550bp大小的特定片段。所述片段从凝胶上脱除并连接到pCR2.1TA载体(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中。形成的质粒pCR2.1-PF550进行测序。具有550bp长度的基因片段的序列分析显示了174个氨基酸残基的开放阅读框，其中还发现了N-末端和内部肽的两个序列片段。根据具有521bp长度的片段的核苷酸序列，构建了3，-RACE(SEQIDNO:76、77)和5，-RACE(SEQIDNO:78、79、88)的寡核苷酸。对于cDNA合成反应，如下制备来自粉状毕赤酵母的细胞的总RNA。600mg新鲜细胞重悬浮在2.5ml水冷的LETS緩沖液中。在硝酸中洗涤并用3ml苯酚平tf的5ml(约20g)玻璃珠添加到所述细胞悬浮液中。在每种情况下整个批次涡旋30秒，总共10分钟，在冰上冷却30秒。随后，添加5ml冰冷的LETS緩冲液，再次充分地涡旋。所述细胞悬浮液在4'C以11000g离心5分钟。回收水相并用等体积的苯酚氯仿异戊醇(24:24:l)提取两次。这随后是用氯仿提取。在最后的4是取之后，通过添加1/10体积的5MLiCl2在-20。C4h沉淀总RNA。第一cDNA链的合成使用3'RACE系统(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)进行。随后，使用寡核苷酸SEQIDNO:76和AUAP(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)在反应67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2，0.01%Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、10pMol每种引物和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecmft,Liidingshausen,Germany)]中控制特异性cDNA,使用以下30个温度循环94°C40秒，55°C40秒，72°C1分钟。使用引物SEQIDNO:77和引物UAP(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)使用30个温度循环94°C40秒，55°C40秒，72°C50秒通过嵌套PCR来提高PCR信号。结果是具有约400bp大小的特异性DNA片段，其在从1%琼脂糖凝胶分离之后连接到载体pCR2.1(Invitrogen)。具有382bp长度的DNA片段序列分析产生了序列信息，关于编码来自粉状毕赤酵母的氣化还原酶的cDNA的3，-延伸直到终止密码子和ploy-A环。对于5，RACE反应，使用从粉状毕赤酵母的细胞制备的5|ig总RNA。基因特异性cDNA的合成使用5，RACE系统(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)和寡核香酸SEQIDNO:78进行。产生的基因特异性cDNA进行同多聚化dCTP添加反应。这之后是在PCR[67mMTris-HCKpH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2，0.01%Tween20〗、0.2mM脱氧核苦三磷酸混合物(dNTP)、20pMol引物SEQIDNO:79和引物AAP(Invitrogen)、2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]中的cDNA扩增，使用以下35个温度循环94°C45秒、54°C45秒、72°C1分30秒。通过使用嵌套PCR用引物SEQIDNO:88和引物UAP(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)4吏用30个温度循环94°C40秒、55°C40秒、72°Cl分钟来提高PCR信号。结果是具有约350bp大小的特异性DNA片段，其在从1%琼脂糖凝胶分离之后连接到载体pCR2.1(Invitrogen)。具有352bp长度的DNA片段序列分析产生了序列信息，关于编码醇脱氢酶/还原酶的cDNA的5,-末端。编码蛋白质的DNA片段具有765bp(SEQIDNO:10)的总长度和254个氨基酸的开放阅读框(SEQIDNO:2)。粉状毕赤酵母细胞的染色体DNA用作模板用于在聚合酶链式反应中产生全长DNA[IOmMTris-HCl,(pH8.0);50mMKC1;10mMMgS04;0.2mMdNTPMix;20pMol引物SEQIDNO:91,或，分别地，20pMol引物SEQIDNO:92、20pMol引物SEQIDNO:93和2U尸/a""ww聚合酶(Invitrogen)],使用温度循环循环194°C,2分钟循环2x3094°C,15秒56°C,20秒68°C,1分15秒在1%琼脂糖凝胶上纯化之后，用NdeI和HindIII、或用SphI和HindIII处理产生的PCR产物，分别连接到载体pET21a(Novagen，Madison,USA)或pQE70(Qiagen，Hilden,Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸内切酶处理。在将2|ul的连接批次转化到E.coliToplOF，细胞中之后，检查氨千青霉素抗性克隆的质粒DNA中连接的正确性，所述连接通过分别使用内切酶NdeI或SphI和HindIII的限制性分析的方式进行。对于插入为阳性的载体的DNA分别转化到表达菌株BL21Star(Invitrogen)和RB79(E.coli遗传库，Yale,USA)中。勿,为、庠净^真必还^癉w—废^;發衷略才艮据Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法才是取基因组DNA。产生的核酸充当使用简并引物的聚合酶链式反应(PCR)的模板。在这样做时，5，-引物来自氨基酸序列(SEQIDNO:104;112)，3，-引物来自氨基酸序列(SEQIDNO:105;113),涉及特异于有机体的遗传编码(SEQIDNO:106;107;114;115)。在PCR緩沖液[67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2，0.01%Tween20]、0.2mM脱氧核苷三石粦酸混合物(dNTP)、40pMol每种引物和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]中进行扩增。在BioThermStar聚合酶活化(95°C8分钟)和随后45-50个循环的Touch-DownPCR之后，反应冷却到4°C,整个PCR批次施加到1%琼脂糖凝胶上用于分析。来自聚合酶链式反应的特异性片段被连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中，并使用引物M13rev(SEQIDNO:65)和M13uni(SEQIDNO:128)借助ABIDNA测序仪来测序。基因编码序列的5'和3'末端区域使用反向聚合酶链式反应方法(iPCR)来测定。根据内部特异性片段的核酸序列，构建寡核香酸SEQIDNO:100;101;102;103;108;109;110;111;116;117;118;119。通过限制性内切酶的方式消化基因组DNA并用于连接，从而可以环化小的DNA片段。所述然后使用所述连接化合物作为iPCR的模板，引物SEQIDNO:100;102;108;119;116;118信号通过随后的嵌套PCR用引物SEQIDNO:101;103;109;111;117;119来提高。产生的特异性片段从1%琼脂糖凝胶洗脱之后连接到载体pCR2.1(Invitrogen)中。因而，含有片段的载体pCR2.1的序列分析产生了关于醇脱氢酶/还原酶基因的3，-和5，-编码区的缺失序列信息。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>根据编码全长基因的序列(SEQIDNO:12;13;14),构建了特异性引物，用于随后克隆所述DNA片段到适合的表达系统中。在这样做时，分别用NdeI的识别序列或用SphI的识别序列或BamHI的识别序列修饰5，-引物，用HindIII的识别序列修饰3'-引物(SEQIDNO:120;121;122;123;124;125;126;127)。如实施例3中描述的进行，编码蛋白质的全长DNA从基因组的扩增，随后限制性酶切并连接到表达载体中。表达菌抹BL21Star(Invitrogen)或RB791(E.coli遗传库,Yale，USA)分别用形成的表达构建体转化。5a^《微^參凝^,虞^#鍵^这脊^辱應產躇/还#^^^發对于从微杆菌属克隆氧化还原酶，例如，根据Manniatis&Sambrook的"Molecularcloning"中描述的方法从微杆菌属的新鲜细胞提取基因组DNA。产生的核酸充当利用30pMol每种寡核苷酸SEQIDNO:106;107的PCR的模板。在PCR循环仪(BioRad,Hercule,USA)中活化BiothermStar聚合酶10分钟之后，编程以下30个循环用于特异性DNA片段的鉴定94°C50秒60°C1分钟72°C1分钟在1%琼脂糖凝胶中整个反应批次的分级之后，检测到具有1000bp大小的特定片段。所述片段从凝胶上脱除并连接到pCR2.1TA载体(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中。形成的质粒pCR2.1-MslOOO进行测序。具有1002bp长度的基因片段的序列分析显示了334个氨基酸残基的开放阅读框，其中还发现了N-末端和内部肽的两个序列片段。根据具有1002bp长度的片段的核苷酸序列，构建了用于反向PCR(iPCR)的寡核芬酸(SEQIDNO:108;109;110;111)。来自微杆菌属的基因组DNA(2.5ug)以50^1批次用20U限制性内切酶SacI处理25分钟。在整个批次的苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)提取和用1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积乙醇沉淀之后，由此消化的DNA转移到25|tilH20中。其中的5|til(200ng)用于在总体积40^1和2UT4连接酶(Fermentas)中的连接反应。重新连接的基因组DNA(2^1=200ng)然后用于iPCR[67mMTris-HCl(pH8.3),16mM(NH4)2S04,115mMMgCl2,0.01%Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、30pMol每种引物(SEQIDNO:108、110)和2.5UBioThermStar聚合酶(Genecraft,Liidingshausen,Germany)]]。使用以下循环进行扩增循环195°C,10分钟循环2x3095°C,1分钟56°C,1分钟72°C,2分钟在嵌套PCR中使用寡核苷酸SEQIDNO:109和IIO提高扩增信随后扩增反应冷却到4。C并作为整体施加到1%琼脂糖凝胶上。结果是约1000bp大小的特异性片段。在从凝胶洗脱之后，片段连接到pCR2.1载体(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)中。含有所述片段的质粒的序列分析产生了信息，关于5'-和3，-侧翼序列。因而，编码蛋白质的DNA片段具有1044bp的总长度，以终止密码子结束(SEQIDNO:13),展现了347个氨基酸的开放阅读框(SEQIDNO:5)。使用微杆菌属细胞的基因组DNA作为模板用于在聚合酶链式反应中产生编码蛋白的全长DNA,使用GC-RichPCR系统(Roche,Mannhein,Germany)和分别30pMol的寡核苷酸SEQIDNO:123或SEQIDNO:124，和30pMol寡核苷酸SEQIDNO:125以及温度循环循环195°C,3分钟循环2x3095°C,30秒59°C,30秒72°C,45秒在1%琼脂糖凝胶上纯化之后，用NdeI和HindIII、或用SphI和HindIII处理产生的PCR产物，分别连接到载体pET21a(Novagen,Madison,USA)或pQE32(Qiagen，Hilden,Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸内切酶处理。在将2|Lll的连接批次转化到E.coliToplOF，细胞中之后，检查氨节青霉素抗性克隆的质粒DNA中连接的正确性，所述连接通过分别使用内切酶NdeI或SphI和HindIII的限制性分析的方式进行。对于插入为阳性的载体的DNA分别转化到表达菌林BL21Star(Invitrogen)和RB791(E.coli遗传库，Yale,USA)中。f逸趁應產箱/还^雜^Eco//哞的《这用表达构建体转化的Escherichiacoli菌林BL21Star(Invitrogen)和RB79(E.coli遗传库，Yale,USA)分別在具有氨节青霉素(50jug/ml)和羧千青霉素(50|ug/ml)的200mlLB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物，P/。NaCl)中培养，直到达到在550nm测量的0.5光密度。重组蛋白的表达通过添加浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。在25。C和220rpm分别诱导8小时或16小时之后，收获细胞并在-2(TC冷冻。对于活性测试，10mg细胞与500jull00mMTEA緩沖液pH7.0以及500卩il玻璃珠混合，使用球磨消化10分钟。获得的溶胞产物然后用于在稀释状态的相应测量。活性测试包括以下的870|ul100mMTEA緩冲液pH7.0，160貼NAD(P)H,lOpl稀释的细胞溶胞产物。向反应混合物添加100pi100mM底物溶液来开始反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>产生表4中所列的緩沖液。相应緩冲液成分的浓度在每种情况下数量为50mM。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>测量批次(30°C)—最佳pH还原870pi表3中所述每种緩沖系统20孵育进行约2到3分钟，随后100|ul底物溶液(100mM)纟皮添加。根据氧化还原酶，使用2-丁酮或2-辛酮作为底物。反应在340nm监视1分钟。为了测量最佳pH值，分析了表4所列各种緩冲液中的酶反应。为了确定氧还反应的最佳pH值，使用NAD(P)作为辅因子，2-丙醇或2-辛醇用作底物。根据本发明的氧化还原酶的结果在表5中综合。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>-9.5通过将重组氧化还原酶保存在表4所提及的緩沖系统中来检查重组氧化还原酶活性的测定。为此，在pH4到11的范围内制备不同的緩冲液(50mM)，用来稀释根据实施例4产生的氧化还原酶。在孵育30、60和120分钟之后，在批次中取出10|ul并用于根据实施例1的活性测试。初始值是在磷酸钾緩沖液50mMpH=7.0中稀释(1:20)酶之后立即获得的测量值。在给定的条件下，所述值相应于约0.70/分钟的消光改变(extinctionchange),并被设置为100%值，所有随后测量的值与该值相关联。在表6中，综合了对于根据本发明的氧化还原酶，在持续120々钟的孵育中酶展现了不低于初始活性的50%的pH范围。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>7c,'產佳溫^为了确定最佳测试温度，在15。C到70。C的温度范围内在标准测量批次中测量根据本发明的氧化还原酶的酶活性。测定的最佳温度在表7中综合表7<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>7丄-溫產璁定遂按照如实施例5c描述的类似的方式，在15。C到7(TC的范围测定温度稳定性。维持，根据本发明的氧化还原酶的稀释物在每种情况下在相应的温度孵育60分钟和180分钟，随后使用上述的测量批次在30。C测量。在表8中，综合了对于根据本发明的氧化还原酶，在持续120分钟的孵育中酶展现了不低于初始活性的50%的温度范围。表8DSMZNo.微生物pH范围稳定性70825粘质红酵母15-35°C3316粉状毕赤酵母15-25。C70647Candidanemodendra15-35。C3651树干毕赤酵母15-350C70391Pichiatrehalophila15-35°C5576肉色明串珠菌15-35。C20028微杆菌属15-60。C43570深红戈登氏菌15曙55。C7e,4參渗通过用许多酮类和醇类测试酶的氧还和还原活性，测定了根据本发明的氧化还原酶的底物语。为此，用不同的引物使用根据实施例1的标准测量批次。对于所有的酶，对乙酰乙酸甲酯的活性被设置为100%,所有其他的底物与之相关联。表9:底物i普还原底物粘质红酵母SEGIDNOl粉状毕赤酵母SEQIDN02树干毕赤酵母SE(3IDN03肉色明串珠菌SEGIDN04微杆菌属SEQIDN05深红戈登氏菌SEQIDN06l-苯基-2-丙酮66%10%30%13%80%82%苯曱酰曱基氯36%130%9%37%<2%70/0苯乙酮12%1950/。32%28%52%23%萘乙酮n.b.25%84%n.b.125%68%丙基笨基酮0%0%0%0%0%0%2-辛酮71%20%27%28%227%75%3-辛酮29%10%40%18%470/052%2-丁酮190%65%49%36%4%14%2-氧代戊酸乙酯4%85%60%25%<2%23%2-氧代-4-苯基丁酸乙酯4%35%16%10%<2%18%丙酮酸乙酯60%560%148%122%480%160%乙菘酸乙基笨基酯8%35%3%4%<2%11%4-氯乙酰乙酸乙酯79%70%100%80%110%110%乙酰乙酸曱酯100%100%100%100%100%100%3-氧代戊酸乙酯60%45%73%30%<2%56%丙酮82%55%100%28%<2%7%7/;哞的」體;t'/i通过在适合于相应的氧化还原酶的水性緩冲液中稀释实施例6中获得的(来自重组表达)溶胞产物(约10单位/ml緩冲液)，检查了在水性/有机两相系统中新的氧化还原酶的稳定性。然后，与水不可混溶的相同体积的有机溶剂被添加到所述緩沖液中稀释的氧化还原酶中，在恒定的整体混合(170rpm的热混合器)下在室温下孵育批次。在24h的孵育之后，从水相中各采集10用于在标准的测试批次(磷酸钾緩沖液(KPP)100mM,pH=7.0，0.2mMNAD(P)H,10mM底物)中确定酶活性。同样在这种情况中，在緩冲液中稀释之后即刻的初始值:故设为100%,所有进一步的值与之相关联。表9:在水性/有机两相系统中孵育24小时之后的酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>MTBE-甲基叔丁基醚表10:底物语氧化<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>^r滋辦s.'豫务^存化炎^7^《祐IJr發母^歲必还^^^^差-GS」-J-在差/j'^的合4对于预备性批次，25mL緩沖液(100mMTEA,pH=7,1mMZnCl2,10%甘油)、375mL4-曱基-2-戊醇、100mL甲基-3-氧戊酸、100mgNAD和37kU来自RhodotorulamucillaginosaDSMZ70825的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。在24h之后，所使用的97%的甲基-3-氧戊酸被还原成甲基-(3S)-3-羟基戊酸。随后，含有产物的4-甲基-2-戊醇相从水相中分离、过滤，通过蒸馏获得产物曱基-(3S)-3-羟基戊酸。按照这种方式，产物曱基-(3S)-3-羟基戊酸以高产量获得，纯度〉99%,对映体过量>99.5%。8b使用来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶的(2R)-1-氯丙烷-2-醇的合成为了转化，80mL緩冲液(lOOmMTEA,pH=7,lmMMgCl2,10%甘油)、15ml2-丙醇、5ml氯丙酮、10mgNAD和2kU来自粉状毕赤酵母DSMZ3316的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的氯丙酮被完全还原成(2R)-l-氯丙烷-2-醇。随后，用乙酸乙酯提取反应化合物，使用旋转蒸发器除去溶剂，获得粗产物。按这种方式产生的(2R)-1-氯丙烷-2-醇具有〉99%的对映体过量。8c使用来自树干毕赤酵母的氧化还原酶的(2R)-1-氯-1-2-醇的合成为了转化，20mL緩沖液(100mM磷酸钾，pH=8.5,lmMMgCl2，10%甘油)、溶解在80ml4-甲基-2-戊醇中的20g2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-酮、10mgNAD和2kU来自树干毕赤酵母DSMZ3651的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的超过99%的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-酮被还原。随后，含有产物的4-曱基-2-戊醇相从水相中分离，过滤，通过蒸馏获得产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-醇。按照这种方式，产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-醇以高产量获得，纯度>98%,对映体过量>99.9%。曱基-2-戊醇相从水相中分离，过滤，通过蒸馏获得产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-l-醇。为了转化，8mL緩冲液(100mMTEA,pH=7，1mMMgCl2)、24ml异丙醇、8ml4-氯乙酰乙酸乙酯、2mgNADP和6.7kU(=6ml)来自肉色明串珠菌DSMZ5576的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的超过99%的4-氯乙酰乙酸乙酯被还原成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。通过使用旋转蒸发器首先除去2-丙醇来重新处理反应混合物。随后，用乙酸乙酯提取反应混合物，使用旋转蒸发器除去溶剂，获得粗产物。按这种方式产生的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有>99.5%的对映体过量。^^^《凝朴霧^^歲化还^凝W(^S,-/-AJ,5-二差J哀差/乙處-/-^的合成为了转化，1mL緩沖液(100mMTEA,pH=7,10%甘油，1mMZnCl2)、3ml4-曱基-2-戊醇、1mll-[3,5-(三氟曱基)苯基]乙烷-l-酮、2mgNAD和0.7kU来自微杆菌属DSMZ20028的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。在24h之后，所使用的超过90%的l-[3,5-(三氟曱基)苯基]乙烷-l-酮被还原成(IS)-1-[3,5-二(三氟曱基)苯基]乙烷-l-醇。随后，含有产物的4-甲基-2-戊醇相从水相中分离，过滤、通过蒸馏获得产物(IS)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-l-醇。照这样获得的粗产物(IS)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-1-醇展现了〉99.5%的对映体过量。权利要求1.用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下用氧化还原酶还原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化还原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO6和SEQIDNO8之一的氨基酸，或(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO2的氨基酸，或(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO3的氨基酸，或(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO4的氨基酸，或(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO5的氨基酸，或(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO7的氨基酸，或(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO129的氨基酸。2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述酮基化合物具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R广C(0)-R2(I)其中所述R1代表以下部分之一1)-(C广C20)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，2)-(C2-C2Q)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达四个双键，3)-(C2-C20)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有最多达四个三键，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(Q-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被-OH、卤素、-N02和/或-NH2取代一次、两次或三次，或7)-(C3-C7)-环烷基，其中在1)到7)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卣素、-:^02和/或^&取代一次、两次或三次，R2代表以下部分之一8)-(d-C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，9)-(C2-C6)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达三个双键，10)-((:2-。6)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有两个三键，或11)-(C广CQ)-烷基-C(O)-O-(C广C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，并且是未取代的或被-oh、卣素、-:^〇2和/或-^^2取代一次、两次或三次，其中在8)到11)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-oh、卣素、-:^02和/或^1"12取代一次、两次或三次。3.用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下用氧化还原酶还原，其特征在于使用的氧化还原酶(a)由选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:130的核酸序列编码，或(b)由核酸序列编码，该核酸序列的互补链在高度严格条件下与(a)中所述核酸序列之一杂交。4.用于根据权利要求1到3任一项的方法的氧化还原酶，其特征在于它具有氨基酸序列，在所述氨基酸序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸，或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸，或(c)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸，或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸，或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸，或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸5或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。全文摘要本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下用氧化还原酶还原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化还原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO6和SEQIDNO8之一的氨基酸，或(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO2的氨基酸，或(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO3的氨基酸，或(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO4的氨基酸，或(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO5的氨基酸，或(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO7的氨基酸，或(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO129的氨基酸。文档编号C12N9/02GK101273137SQ200680035680公开日2008年9月24日申请日期2006年7月20日优先权日2005年7月27日发明者A·古普塔,A·特申谢,M·博布科瓦申请人:Iep有限责任公司