专利名称：利用植物油体表达人胰岛素的方法
技术领域：
本发明涉及一种人胰岛素(insulin)及其在植物油体中表达的方法，具体涉及利用植物油体蛋白-目的蛋白组成融合蛋白基因表达体系生产人胰岛素的方法。
背景技术：
糖尿病多是由于自身免疫反应破坏胰腺β细胞，导致胰岛素分泌不足，患者逐渐出现一系列严重的并发症，例如心血管疾病、肾脏疾病及糖尿病视网膜病所致的失明。目前，尚无治愈的方法，通常的治疗措施是注射胰岛素，人胰岛素对于胰岛素依赖的糖尿病患者的治疗是十分重要的。但注射胰岛素可能引起视神经萎缩、注射部位肌肉萎缩，皮肤过敏和神经痛等副作用，给患者带来巨大的痛苦。胰岛素吸入治疗是一种新的治疗糖尿病的方法，治疗简便，能避免注射胰岛素给患者带来的不便和痛苦。但该方法存在着胰岛素的用量较大的缺点。
目前，随着糖尿病患者人数的不断增加，尤其胰岛素吸入治疗方法的不断推广和应用，社会对胰岛素的需求越来越大。为了解决这个问题，人们已经尝试利用包括微生物发酵和哺乳动物细胞等几种传统的表达系统进行生产重组人胰岛素，但它们都存在着种种的限制。细菌表达系统的主要问题是它们无法进行哺乳动物蛋白所必须的翻译后加工的过程，如糖基化。而哺乳动物细胞则因为其昂贵的培养装置和其相对较低的产量而限制了它的应用。相比之下，植物反应器是一种可以大规模、低成本生产各种药用蛋白的比较理想的表达系统，利用转基因植物生产医用蛋白，近年越来越受到人们的关注。至今，已有许多重要的药用蛋白，如人表皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子，干扰素、人血清白蛋白、胰岛素等及多种抗体与疫苗已在植物中成功表达。
利用植物油体表达外源蛋白，是目前一种新的更具应用前景的转基因植物方法。目前，已经有多种药用蛋白在油体系统中成功获得表达，如水蛭素，降钙素等等。在植物油体中表达药用蛋白，目的基因插在油体蛋白基因的N端或C末端，构建成融合蛋白基因。由于油体蛋白本身镶嵌在油体表面，构建的融合蛋白基因便可在受体植物种子中特异表达，并结合在种子油体的表面，这样不仅能大大提高外源蛋白在植物组织中的表达量，还可利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎后，再经液体抽提离心等步骤，回收油相，便可将融合蛋白或目的蛋白与细胞内的其它组份分开，这样便可明显简化目的蛋白的分离纯化过程，这种植物油体表达体系有利于外源基因的表达及产业化研究。当然，植物油体表达体系还有许多问题需要进一步的研究和探讨，包括如何进一步提高蛋白表达量和降低目的蛋白的分离成本。此外，油体表达体系的局限性还表现在对目的蛋白分子量的要求，一般目的蛋白不能超过64KD。但目前还没有利用植物油体表达系统表达人胰岛素的报道。
发明内容
本法明的目的在于提供一种利用植物油体表达系统生产人胰岛素的方法，利用这种方法得到的胰岛素可应用于注射或口服来治疗I型和II型糖尿病。
本法明首先根据植物密码子的偏好性设计合成了人胰岛素(insulin)基因的全序列，该序列如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2；进一步，本法明构建了含有油体蛋白与上述人胰岛素的融合蛋白基因的表达载体，所述油体蛋白优选为大豆油体蛋白，表达载体所用的启动子优选为油菜油体蛋白启动子；
然后，将上述表达载体转化植物中，并整合到植物基因组中，培植出带有上述融合基因的转基因植物，该植物能够产生含所述人胰岛素的F2代种子；并且，该种子性状能长期稳定遗传到下一代。所述的胰岛素具有类似天然胰岛素的三维结构。
具体地，本法明可以采用如下技术方案(1)按植物密码子偏好性合成全部由植物偏好密码子组成的人胰岛素(insulin)基因；(2)构建植物油体表达载体；(3)将insulin的核苷酸序列连接到油体蛋白核苷酸序列的3`端，克隆进表达载体中；(4)用步骤(3)的重组表达载体用农杆菌侵染转化适当的真核宿主愈伤组织；(5)筛选转基因抗性愈伤组织；(6)筛选抗性植物转化苗；(7)将得到的F2代植物的种子经粉碎、用提取液萃取，离心可除去90％以上的杂质，经洗涤纯化回收所需的人胰岛素活性多肽。
本发明涉及以重组DNA技术生产insulin的方法，特别是涉及以真核植物作为宿主生产insulin的方法。更具体的说，本发明涉及用于在真核植物种子油体蛋白中融合表达insulin蛋白。本发明进一步涉及按本发明的方法制备的insulin在治疗I型和II型糖尿病中的应用。
为了提高基因的表达效率，本发明采用了油菜油体蛋白启动子，Korzak序列以及其他一些增强子等表达调控元件。其中，本发明所指油体蛋白基因的启动子还包括其他的能使外源基因在植物油体中高效表达的启动子，如菜豆球蛋白启动子，泛素Ubiqutin启动子等等。
为了方便表达产物的纯化和提高表达产物的纯化产率，本发明选择用油体蛋白与insulin融合表达，从而使融合蛋白有利于下游纯化，并且产物更加稳定。
为了提高遗传转化效率，本发明采用了多种转化技术将重组人胰岛素基因转入靶植物愈伤组织。这些方法包括但不仅限于农杆菌介导法，基因枪转化法，花粉管通道法等等。
为了避免转基因植物之间发生基因漂移，导致严重的环境问题和生态危机，本发明采用了自花授粉的大豆，红花作为生物反应器。
可按照本领域已知的技术进行基因的分离和合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞转化和培养，以及表达产物的分离和纯化等操作(参见Sambrook ct al.，Molecular CloningALaboratory Mannual，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cola SpringHarbor，NY，1989)。
采用本发明的方法生产人胰岛素具有如下优点1、植物表达的外源蛋白，可以类似于哺乳动物表达的蛋白，能进行折叠、糖基化和组装，这对于具有体内活性的药用人源蛋白的生产十分重要。
2、利用植物作为反应器可以轻易的避免动物病原体的感染以及大肠杆菌中的内毒素。
3、采用自花授粉的大豆、红花作为反应器，可以避免发生基因漂移，从而避免严重的环境问题和生态问题。
4、利用转基因植物的油体系统表达人胰岛素，可以大大简化目的蛋白的分离纯化过程，降低生产成本，同时有利于人胰岛素的产业化。
5、采用油菜油体蛋白启动子作为强力启动子，可以大大提高下游大豆油体蛋白基因的转录效率。
6、采用农杆菌介导法转化植株，可以降低成本，提高遗传转化率，提高转基因植株的遗传稳定性。
图1是insulin目的蛋白的Western检测图，图中1为人胰岛素标准品，2为本法明方法获得的重组人胰岛素；图2是p1390的结构示意图；图3是pUCON质粒构建图；图4是pUCOE质粒构建图；图5是重组中间载体p1390ON构建示意图；图6是重组中间载体p1390ONE构建示意图；图7是重组表达载体p1390ONE-insulin构建示意图；图8是重组人胰岛素的活性检测。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本法明所要保护的范围。
实施例1Insulin基因的制备及序列测定在GENEBANK中找到人胰岛素原的序列，从中得到人胰岛素A链和B链的序列，并在A，B链之间插入一段短肽序列，然后按照植物偏好的密码子将insulin碱基序列重新改造(其中A链中63个碱基中更换了13个，在B链90个碱基中更换了18个碱基)，并按照密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点。
利用在线软件Primerfinder及DNASTAR设计引物，共设计合成了8条引物，每条引物长度为30-50bp不等，相邻两条引物之间有20个碱基重叠，最后通过桥式PCR合成全长insulin基因。PA1-PA4为正向引物，PA5-PA8为反向引物，其中PA4和PA5为互补的嵌合引物(有20个互补碱基)；在引物PA1引入限制性内切酶BamH I酶切位点及保护碱基，在引物PA6中引入EcoRI酶切位点、凝血酶切位点及保护碱基，以便克隆进中间克隆载体及植物表达载体中。
上述引物是PA1CGCGGATCCATGGCTCTITGGATGAGGCTTPA2ACCGAGAAACCTACTCCGAAGAAGGTGAAGAACGAGAAGAACGAGAAACCPA3TTGCTCTTCTTGCTCTTTGGGGACCTGATCCAGCTGCTGCTTTCGTTAACPA4GTCGACGACGAAAGCAATTGGTTGTGGAAACGCCTAGAGTGGAACAACTCPA5GCGGATCTCACCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTGTTTGCGGAGAGAGGGGAPA6AACAAACGCCTCTCTCCCCTAAGAAGATGTGGGGTTTCTGGTCCTCCCTCPA7CCCCAAAGACCAGGAGGGAGGCAGAGCTTGTTCCAAGGGGATCTTAAGAAPA8AAGGTTCCCCTAGAATTCTTAAGGCCInsulin全长基因合成第一轮PCR扩增，如下建立100μl的反应体系10×pfu缓冲液 10μldNTP(2.5mM) 8μl引物PA4(10μmol/L)2μl引物PA5(10μmol/L)2μlpfu DNA聚合酶 0.5μlddH2O77.5μl总计 100μl反应参数94℃5min55℃5min72℃5min4℃ 保存经2％琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为A45。
第二轮PCR扩增，如上采用100μl反应体系10×pfu缓冲液 10μldNTP(2.5mM) 8μl引物PA3(10μmol/L)2μl引物PA6(10μmol/L)2μlA45模板 1μlpfu DNA聚合酶 0.5μl
ddH2O 76.5μl总计 100μl反应参数如下94℃4min 72℃2min4℃ 保存如上用DNA胶回收试剂盒纯化回收，回收产物命名为A36。其后，以A36为模板，以PA2及PA7作引物，经PCR扩增得PCR产物A2/7；再以A2/7为模板，以PA1及PA8作引物，扩增得PCR产物A1/8；如此进行，直至合成改造后的insulin全长基因。
将PCR产物insulin经BamH I及EcoRI双酶切后连接到pUC19上，得到pUC-insulin。重组质粒pUC-insulin的DNA序列测序结果表明，本发明设计合成的insulin核苷酸序列正确。
实施例2油体表达的中间载体构建以白菜型油菜的总DNA为模板，以其oleosin基因启动子的序列设计引物，引物1含有Hind III酶切位点，引物2引入Pst I酶切位点，经PCR扩增获得了约900bp的oleosin基因启动子(PCR反应条件为94℃，5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟；25个循环结束后72℃延伸5分钟)，PCR产物用Hind III和PstI双酶切后，将其连接到pUC19上，得到pUCON，其测序结果表明克隆产物为油菜油体蛋白基因的启动子。
以大豆24kD oleosin油体蛋白基因序列设计引物引物1序列为5′-GAA TCT AGA GAT GAT GAT GAT AAG ATG ACC ACA CAAGTA CC，引物2序列为5′-GCC GGT ACC ATC ATC ATC ATC CTTGGT TGT TGC TGT CAC TG。引物1含有Pst I酶切位点，引物2引入BamH I酶切位点，以大豆的基因组DNA为模板，经PCR扩增(PCR反应条件为94℃，5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟；25个循环结束后72℃延伸2分钟)，获得完整的大豆24kDa油体蛋白基因编码区序列，大小约为678bp。PCR产物用Pst I和BamH I双酶切后，将其连接到pUC19上，得到pUCOE。其测序结果表明，克隆产物为大豆油体蛋白基因oleosin。
将pUCON质粒用HindIII和Pst I双酶切后，将酶切片段油菜油体蛋白启动子连接到pCAMBIA1390(以下简称p1390R，图2是其结构示意图)(MscS-like Proteins Control Plastid Size and Shape inArabidopsis thaliana.Current Biology，Volume 16，Issue 1，Pages 1-11E.Haswell，E.Meyerowitz)中，重组质粒命名为p1390ON，经酶切鉴定正确后进行后续工作。将pUCOE质粒经Pst I和BamH I双酶切后，将酶切片段大豆油体蛋白基因与p1390ON连接，重组质粒命名为p1390ONE，此即油体表达载体。
实施例3含insulin基因的重组油体表达载体的构建提取pUC-insulin质粒DNA，用BamH I和EcoRI双酶切后，回收insulin酶切片段，连接到油体表达中间载体p1390ONE，得到重组植物油体表达载体p1390ONE-insulin。经BamH I和EcoRI双酶切鉴定，证实酶切片断大小约为180bp。
实施例4农杆菌介导的大豆、红花等遗传转化将重组油体表达质粒p1390ONE-insulin转入农杆菌。
取1μg p1390ONE-insulin质粒DNA加入到100微升LBA4404感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置5分钟；然后置液氮中冷冻5分钟后迅速转至37℃水浴中温育5分钟。加入1毫升LB液体培养基，在28℃摇床上180rpm振荡培养4小时。取适量菌液涂布到含链霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上，置28℃培养24～48小时，经抗性筛选、PCR及酶切鉴定获得带有p1390ONE-insulin质粒DNA的农杆菌单菌落。
含p1390ONE-insulin质粒的农杆菌的活化从平板上挑取含p1390ONE-insulin质粒的农杆菌单菌落，接种到5毫升LB液体培养基中(含卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)，振荡培养过夜，取100微升菌液接种到50毫升LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，链霉素50mg/L)中，28℃，180rpm振荡培养至OD600为1500rpm离心10分钟，菌体用浸染培养基重悬，使OD600为0.5。
大豆或红花等植物的遗传转化将大豆或红花等子叶或下胚轴在重悬的农杆菌菌液中浸泡15分钟，放到含适当激素配比的MS固体培养基上共培养3天，之后转到含有潮霉素15mg/L+头孢霉素250mg/L的MS固体培养基上进行抗性愈伤组织的筛选及进行芽分化选择培养，约8周左右有抗性芽出现，待抗性芽伸长至2～5厘米时转至生根培养基上，一般15～30天左右即可生根。
实施例5转基因大豆、红花等植物的PCR检测提取转基因大豆或红花等植物基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以insulin基因的一对引物扩增目的基因insulin、以大豆油体蛋白基因的一对引物扩增大豆油体蛋白基因、以大豆油体蛋白基因5`端引物和insulin基因的3`端引物扩增融合蛋白基因。扩增insulin基因的PCR反应条件为94℃5分钟；94℃35秒，58℃35秒，72℃35秒，25个循环；72℃延伸2分钟。扩增大豆油体蛋白基因的PCR反应条件为94℃5分钟，94℃35秒，58℃35秒，72℃1分钟；25个循环；72延伸5分钟。扩增融合蛋白基因的PCR反应条件为94℃5分钟，94℃35秒，58℃35秒，72℃1分钟；25个循环；72延伸5分钟。分别扩增出预期的200bp的insulin基因(含酶切位点和凝血酶切位点)、680bp的大豆油体蛋白基因及880bp的融合蛋白基因。重组表达载体经过测序鉴定，证实插入基因序列全部正确。
实施例6大豆和红花籽中融合目的蛋白的Western blot检测提取大豆中和红花籽中的油体蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至硝酸纤维素膜后，用山羊抗兔insulin的多克隆抗体进行Western blot分析，结果表明，在转基因大豆和红花的种子中有insulin蛋白的表达，表达产物大小约为30kD(融合蛋白为24KD+6.2KD)，与预期的大小一致，Western结果见附图1。
实施例7油体蛋白-insulin融合蛋白的分离纯化及生物学活性检测1.大豆和红花籽中油体蛋白-insulin融合蛋白的提取(1)取大豆种子10粒去掉外壳，加2.5倍体积的缓冲液A(0.15M Tricine-KOH pH7.5，10mM KCI，1mM MgCl2，1mMEDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000g、4℃离心15分钟。
(2)上清用含0.65M蔗糖的缓冲液A重悬。
(3)液面上覆以等体积的含0.12M蔗糖的缓冲液A。
(4)15000g、4℃离心25分钟，重复两次，取上清。
至此将油体与种子中的其它成份分开。
(5)上清中加2倍体积的乙醚，15000g离心8分钟，上部的乙醚层中多为中性脂类，磷脂留在下面的水相中，取中间的蛋白层。
(6)以适量含0.1M蔗糖的缓冲液A重悬蛋白，加入三倍体积的氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提3次。
(7)取中间蛋白层，用乙醚抽提一次，-70℃超低温冰箱中冻干保存。
2.油体蛋白与insulin蛋白的分离及纯化(1)将油体蛋白-insulin融合蛋白溶于无菌水中，加入0.2U凝血酶，37℃酶切过夜。
(2)将酶切反应液利用AKTA蛋白纯化系统，通过亲和层析法来纯化。将酶切反应液上Harpin-Sepharose CL-6B亲和层析柱，用平衡缓冲液(10mmol/L PBS，PH7.0，0.1mol/L NaCl)洗至基线，用含0.2mol/L NaCl洗除杂蛋白，再用含0.4-1.0mol/L NaCl的PBS缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液的流速为1ml每分钟。收集活性峰。经SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析得到insulin纯品，纯度达97％。
用上述相同的方法可以从红花种子中获得insulin纯品。目前，在红花种子提取得到的重组人胰岛素占红花种子总蛋白的1.1％，超过了重组药物蛋白在植物中表达的最低商业化要求(1％)，因此，利用植物油体蛋白系统来实现重组人胰岛素的产业化，具有可行性和广阔的应用前景。
用20只，两个月龄的雄性B6小鼠构建I型糖尿病模型。然后在给小鼠喂食后，给小鼠注射剂量为1U/kg体重的胰岛素，然后在0，15，30，60分钟的时候测定其血糖水平，同时用胰岛素标准品作为阳性对照，用生理盐水作为阴性对照。结果显示，从油体蛋白-insulin融合蛋白中分离纯化得到的insulin，具有明显的生物学功能，其活性与已商业化的胰岛素非常接近。(见图8)
序列表<110>吉林农业大学<120>利用植物油体表达人胰岛素的方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>179<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(177)<400>1atg gcc ctg tgg atg cgc ctc ctg ccc ctg ctg gcg ctg ctg gcc ctc 48Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu1 5 10 15tgg gga cct gac cca gcc gca gcc ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc 96Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly20 25 30tca cac ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc144Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly G1u Arg Gly Phe35 40 45ttc tac aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag177Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu50 55<210>2<211>59<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly20 25 30Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe35 40 45Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu50 5权利要求
1.人胰岛素基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因与油体蛋白基因的融合基因的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述油体蛋白基因为大豆油体蛋白基因。
4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的启动子为油菜油体蛋白启动子。
5.如权利要求2～4所述的表达载体，其为p1390ONE-insulin。
6.权利要求2～5所述的表达载体在制备人胰岛素中的应用。
7.一种利用植物种子油体生产人胰岛素的方法，其包括如下步骤1)用权利要求2～5所述的表达载体转化受体植物，筛选得到转含有目的基因的转基因植物；2)将上述转基因植物栽培得到植物种子；3)从上述种子中分离纯化得到人胰岛素。
8.如权利要求7所述的方法，其中受体植物为油菜、大豆或红花。
9.如权利要求7所述的方法，其中转化受体植物的方法是采用农杆菌介导法。
全文摘要
本发明提供了一种利用植物油体表达人胰岛素的方法。本发明方法按照植物密码子的偏好性设计合成了人胰岛素基因，将所述人胰岛素基因与油体蛋白基因融合，构建了含有该融合基因的表达载体，将该表达进一步转化受体植物，得到转化植株，该转化植株的种子可以高效表达人胰岛素。本法明利用植物生物反应器来生产人胰岛素，避免了动物病原体及大肠杆菌内毒素的可能产生的侵害，同时可以大大简化目的蛋白的分离纯化过程，降低生产成本，有利于人胰岛素的产业化。
文档编号C12N15/09GK101037692SQ20061016980
公开日2007年9月19日 申请日期2006年12月28日 优先权日2006年12月28日
发明者李校堃, 柯实, 肖业臣, 曲勍, 王晓慧 申请人:吉林农业大学