辣根过氧化物酶基因与血管内皮生长因子基因的连接及克隆的利记博彩app

文档序号:430918阅读:342来源:国知局
专利名称:辣根过氧化物酶基因与血管内皮生长因子基因的连接及克隆的利记博彩app
技术领域
本发明涉及一种具有杀伤肿瘤细胞作用的融合蛋白质的基因构成,具体涉及人血管内皮生长因子基因 与辣根过氧化物酶基因的连接及克隆。
背景技术
许多酶和前体药物被用于杀伤肿瘤细胞,并且取得了很多成功。辣根过氧化物酶正在被用于杀灭肿瘤 细胞。吲哚-3-乙酸(IAA)作为一种普遍存在的植物生长激素,可被辣根过氧化物酵催化形成活性氧携带分 子,包括活性氧自由基(ROS),自甴基会导致脂质过氧化,引起细胞膜结构改变,导致细胞内损伤和凋亡, 从而产生动物细胞毒性作用。又由于IAA不能被动物细胞内源性过氧化物酶氧化,对正常细胞的生长无影 响,因此,可以成为酶介导抗癌药物治疗的候选药物。
血管内皮生长因子(VEGF)能与血管内皮生长因子受体(VEGFR)特异性结合,是刺激血管内皮细胞增殖 和移行的重要因子,并可影响血管通透性。VEGF受体表达高的细胞其VEGF检出率高于受体表达低的细胞, 提示了 VEGF多集中在与耙细胞结合的部位,肿瘤血管对VEGF的反应要比正常血管强。
利用VEGF或VEGF的单克隆抗体与VEGFR或VEGF结合,阻断VEGF与受体的结合,达到抑制其促 进血管生长的作用,发挥抗肿瘤的效应。使用抗体中和VEGF可间接抑制肿瘤的生长。可溶性VEGF受体 能特异地结合VEGF,间接阻断VEGF与其受体作用。Drake等在鸟胚胎内注入可溶性VEGFR l,结果导致胚 胎血管畸形和大血管生成障碍。
将VEGF与小分子毒性物质结合后,通过VEGF与肿瘤血管内皮细胞及肿瘤表面受体的特异性结合,发 挥抑制血管形成及杀瘤效应。Arora等将白喉毒素分子DT390分别与VEGF165和VEGF121结合。发现 两者均可抑制表达VEGFR的人脐静脉内皮细胞及卡波西肉瘤细胞的生长,且DT390 VEGF165的作用是 DT390VEGF121的3 4倍,对不表达VEGFR的主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞和B细胞则无毒性作用。 两者均有明显抑制肿瘤生长的作用。
VEGF受体flt-l/VEGFR-l和Flk-1/ KDR/VEGFR-2在肿瘤组织中表达量很高,通过融合的方法将 VEGF165或VEGF121与白喉毒素(DT)制成耙向的有毒物质,两个融合蛋白对繁殖中的内皮细胞有高度的 毒性作用,而对血管平滑肌细胞无毒性作用,与只用毒素的对照组相比,用VEGF和毒素的融合产物对肿 瘤组织有明显的抑制作用。
在本项研究中,将辣根过氧化物酶基因与VEGF基因进行连接与克隆,以为表达有生物活性的融合 蛋白做准备。将用甲醇酵母表达系统进行表达,以表达出产量高而且有生物活性的融合蛋白,用于杀灭肿 瘤细胞。

发明内容
首先获得血管内皮细胞生长因子基因与辣根过氧化物酶基因,然后将二者通过小分子连接肽基因进行 连接,再连接到毕赤酵母的表达载体pPlC9K上,在大肠杆菌中进行克隆,通过测序鉴定所构建重组基因 的正确性。本重组基因可用于表达具有肿瘤细胞杀伤作用的融合蛋白质。
本发明是通过如下技术方案实现的
1. 目的基因的获得辣根过氧化物酶基因的获得是通过首先提取辣根的基因组DNA,以其为模板进 行PCR,得到目的基因。
血管内皮细胞生长因子基因的获得是根据VEGF165基因序列进行引物设计与合成,提取病人肺肿瘤 组织总RNA,进行反转录获得相应cDNA,然后以其为模板进行PCR,获得VEGF165基因。
2. 目的基因的连接与克隆将两种目的基因通过连接肽SerSerSerGtySerSerSerSerGlySer的相应 DNA序列连接,在重组基因的3'连上表达六个连续组氨酸的碱基序列,以便于用镍柱进行分离纯化。连 接到pPIC9K上,保持正确的阅读框,构建成重组表达载体。经DNA测序和酶切鉴定正确后,将其转入
大肠杆菌,以克隆重组表达载体。


插入目的基因的重组质粒的酶切及PCR鉴定图 1 1Kb DNA Ladder DNA分子量标准物 2空载体的EcoRI和Sail酶切产物 3含目的基因的重组载体的EcoRI和Sail酶切产物 4以重组载体为模板的目的基因的PCR产物 5 DL2000 DNA分子量标准物
具体实施例方式
实施例1辣根过氧化物酶基因片段的扩增
以提取的辣根基因组DNA为模板,采用PCR的方法进行扩增其HRPC3基因中除去信号肽序列及终止密 码子序列的剩余部分,共864bp。在上下游引物两端分别加入酶切位点EcoRI和Bgl II,下游引物没有终 止密码子序列。5'端引物如序列表中的SEQ ID NO. 1, 3'端引物如序列表中的SEQ ID NO. 2。
实施例2 VEGF165基因片段的扩增
通过PCR扩增VEGF165基因片段,在上游引物5'端加入酶切位点BamHI,在下游引物5'端加入编码 六个连续组氨酸残基的DNA序列和酶切位点Notl。 5'端引物如序列表中的SEQ ID NO. 3, 3'端引物如序列 表中的SEQ ID NO. 4。
实施例3辣根过氧化物酶基因与连接肽基因连接
合成两条引物Linkl和Link2, Linkl的3'端有16个碱基与辣根过氧化物酶基因3'端互补。Linkl 的5'端与Link2的3'端有15bp的相同序列。在Linkl中有Bgl II酶切位点,在Link2的5'端有BamHI 酶切位点。以实施例1中扩增到的辣根过氧化物酶基因为模板,以SEQ ID NO. 1为上游引物,以Linkl为 下游引物进行PCR,再以该PCR产物为模板,以SEQ ID NO. 1和Link2为引物,应用Pyrobest DNA聚合 酶进行PCR,再用T叫DNA聚合酶和dATP进行DNA末端加A。引物Linkl如序列表中的SEQ ID NO. 5, 引物Link2如序列表中的SEQ ID NO. 6。
实施例4辣根过氧化物酶和连接肽基因的连接产物与VEGF165基因片段的连接
将实施例3中PCR产物及VEGF165基因的PCR产物分别进行BamHI酶切,回收目的片段,二者进行 连接反应后,再以SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.4进行PCR扩增,得到HRPC3-Link-VEGF165,其序列如序列 表中的SEQ ID NO. 7。
实施例5服PC3-Link-VEGF165与pPIC9K连接及转化大肠杆菌
分别对HRPC3-Link-VEGF165的PCR产物和质粒pPIC9K进行EcoRI和Notl双酶切,酶切产物电泳, 回收目的基因片段和pPIC9f,连接,转化大肠杆菌(ExoliDH5cc、筛选阳性克隆并对重组质粒并进行酶 切和PCR鉴定以及进行咖A测序鉴定,由英俊生物技术有限公司,以pPIC9K的3'AOX测序引物进行测序, 结果在A07. CS060904024—0099. BLUEGF. 3A0X. seq中,均证明HRPC3-Link-VEGF165与pPIC9K进行了正确 的连接与克隆。
序列表 SEQ ID NO. 1
序列特征(A)长度27bp; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类型
寡核苷酸。
序列描述
CCAGAATTC ATCCTTCGTCTTCACTTC SEQ ID NO. 2
序列特征(A)长度25bp; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类型
4
寡核苷酸。 序列描述
TCAGATCTGG CATAGAGCTAACAAA
SEQ ID NO.'3
序列特征(A)长度26bp; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类型 寡核苷酸。
序列描述CCGGATC CGATGAACTTTCTGCTGTC SEQ ID NO. 4
序列特征(A)长度45bP; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类型 寡核苷酸。
序列描述
ATGCGGCCGCATGGTGGTGATGGTGGTGCCGCCTCGGCTTGTCAC SEQ ID NO. 5
序列特征(A)长度40bp; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类型
寡核苷酸。
序列描述
GGAACCGGAGCTGGACAGATCTGGCATAGAGCTAACAAAG SEQ ID NO. 6
序列特征(A)长度40bP; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类型
寡核苷酸。
序列描述
TCGGATCCGGGGAACCGCTGGAGCTGGAACCGGAGCTGGA SEQ ID NO. 7
序列特征(A)长度1512 bp; (B)类型核酸;(C)链性单链;(D)拓扑结构线形;(E)分子类
型DNA。
序列描述
CCAGCGGTTCCCCGGATCCGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTCGAGCCTTGCCTTGCT
CCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTG<formula>complex formula see original document page 6</formula>
权利要求
1.两种基因的连接及克隆,其特征在于先分别获得人血管内皮生长因子基因和辣根过氧化物酶基因,然后将二者通过小分子连肽DNA序列进行连接,再连接到毕赤酵母的表达载体pPIC9K上,在大肠杆菌中进行克隆。
2. 如权利要求1所述的两种基因的连接及克隆,其特征在于,所述的辣根过氧化物酶基因为HRPC3基因中 除去信号肽DNA序列及终止密码子序列的剩余部分,共864bp。
3. 如权利要求1所述的两种基因的连接及克隆,其特征在于,所述的序列为Ser Ser Ser GlySer Ser Ser Ser Gly Ser的连接肽,其相应DNA序列为tccagctccggttccagctccagcggttcc。
4. 如权利要求1所述的两种基因的连接及克隆,其特征在于,所述的人血管内皮生长因子基因为VEGF165, 并在其下游连接有六个连续组氨酸对应的DNA序列。
5. 如权利要求1所述的两种基因的连接及克隆,用于表达具有肿瘤细胞杀伤作用的融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种具有杀伤肿瘤细胞作用的融合蛋白质的基因制备。本发明构建了一种靶向性融合蛋白的重组基因,其中有人血管内皮生长因子基因、辣根过氧化物酶基因及中间的连接肽DNA序列。该融合蛋白质的基因的制备方法包括1)分别获得血管内皮细胞生长因子基因与辣根过氧化物酶基因;2)将二者通过小分子连接肽基因进行连接;2)连接到毕赤酵母的表达载体pPIC9K上;4)将所连接成的重组载体在大肠杆菌中进行克隆。本发明重组基因可用于表达具有肿瘤细胞杀伤作用的融合蛋白质。
文档编号C12N15/62GK101195829SQ20061016444
公开日2008年6月11日 申请日期2006年12月5日 优先权日2006年12月5日
发明者邵金辉 申请人:邵金辉
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