专利名称：稳定化胆碱酯酶底物溶液的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及的领域是在生物样品中测量酶活性。更具体地说，本发明涉及用于使胆碱酯酶底物溶液稳定化的极性有机溶剂的用途，以及用于在样品中确定胆碱酯酶活性的所述溶液的用途。此外，提供了用于确定胆碱酯酶活性的方法和试剂盒。
背景技术：
胆碱酯酶是酶活性的通用名称，其催化酰酯水解为醇和羧酸根。胆碱酯酶作用于多种具有醇部分(如苯酚(phenyl-alcohol)、吲哚醇(indoxyl-alcohol)并且优选胆碱)和羧酸根部分的底物(如碳酸、重碳酸(dicarbonic acid)、苯甲酸)(Brown等，Adv.Clin.Chem.，221-123(1981))。基于其对羧酸根部分的专一性，胆碱酯酶被细分为两类。“真胆碱酯酶”或乙酰胆碱酯酶(乙酰胆碱乙酰基水解酶，EC 3.1.1.7)显示了对乙酰基部分(moiety)的显著选择性，而“伪胆碱酯酶”或酰基胆碱酯酶(酰基胆碱酰基水解酶，EC 3.1.1.8)优选水解具有更大羧酸根部分(如丁酰基或苯甲酰基)的底物。
乙酰胆碱酯酶在神经系统中和在神经与肌肉之间的信号转导中起着很重要的作用。其还存在于红血球中。该酶由于神经毒气如沙林的作用以及杀虫剂中毒而不可逆地失去活性。
酰基胆碱酯酶的生物学功能是未知的。酰基胆碱酯酶可存在于胰腺、心脏、肠粘膜、血清、脑白质和肝脏中。
胆碱酯酶和其活性的确定尤其在临床上引起了关注。由于其明显源于肝脏，这种关注主要在于酰基胆碱酯酶。其作为肝功能指数进行检测，该酶还用作疑似杀虫剂中毒的临床指标。通过手术前筛选酰基胆碱酯酶，可以识别出具有非典型形式的酶的病人，旨在预防长时间的呼吸暂停(其由于肌肉迟缓(muscle relaxans)的迟发型退化所造成)。酰基胆碱酯酶的水平下降可能发现与有机磷化合物引起的中毒、肝炎、肝硬化、心机梗塞、急性感染和酶的非典型表型有关。
用于在生物样品中检测胆碱酯酶活性的方法在现有技术(Burtis和Ashwood(编辑)，Tietz fundamentals of clinical chemistry，第四版，ISBN0-7216-3763-9)中进行了描述。共同的试验原则是基于使用硫代胆碱酯如乙酰基硫代胆碱、丙酰基硫代胆碱、丁酰基硫代胆碱和琥珀酰基二硫代胆碱。在这些当中，只有乙酰基和丙酰基硫代胆碱可用于确定乙酰胆碱酯酶。虽然血清酰基胆碱酯酶对于所有这些底物具有活性，但优选使用琥珀酰基二硫代胆碱并且尤其是丁酰基硫代胆碱来确定血清酰基胆碱酯酶。因为硫酯键的水解，使得所有这些硫酯在水溶液中是不稳定的。被冷藏的试剂溶液的低稳定性已经被数位作者证实，例如乙酰基硫代胆碱，7天(Whittaker M.Cholinesterases.InBergmeyer HU，ed；Methods of Enzymatic Analyses，第三版，WeinheimVerlag Chemie，198452-74)；丙酰基硫代胆碱，1天(Dietz等Colorimetric Determination of Serum Cholinesterase and Its GeneticVariance by the Propionylthiocholine-Dithiobis(nitrobenzoic Acid)Procedure.Clinical Chemistry 1973；191309-1313)；丁酰基硫代胆碱，30天(Schmidt E.等Proposal of Standard Methods for theDetermination of Enzyme Catalytic Concentrations in Serum andPlasma at 37℃。Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1992；30163-170)。虽然酰基胆碱酯酶的上述底物中的一些还被乙酰胆碱酯酶、芳基酯酶(芳基酯水解酶，EC 3.1.1.2)、甚至白蛋白分解，但是丁酰基硫代胆碱(BTC；Knedel and B_ttger，Klin Wschr 45325-327(1967))不受这些缺陷的影响。因而BTC通常被认为是最特异底物之一并且被选作国家推荐的胆碱酯酶分析法(Association of Clinical Biochemists，News Sheet Assoc.Clin.Biochemists，Suppl.20231s-36s(1980)；Cholinesterase，InKommentare zum Arzneibuch der Deutschen Demokratischen Republik，Heft 2Enzym-Aktivit_tsbestimmung in der Laboratoriumsdiagnostik，Akademie-Verlag，Berlin，56-65(1988))。取决于酰基胆碱酯酶活性，BTC被水解为硫代胆碱和丁酸根。硫代胆碱与5，5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸酯(DTNB)反应，形成黄色染料5-巯基-2-硝基苯甲酸酯。
硫代胆碱+ 5-巯基-2-硝基苯甲酸盐DTNB ————→ +2-硝基苯甲酸-巯基硫代胆碱5-巯基-2-硝基苯甲酸酯的形成速率与酰基胆碱酯酶的催化活性成正比，这根据在波长480nm下的消光增加而确定。由于底物的专一性，用血清进行的试验未受乙酰胆碱酯酶的干扰，乙酰胆碱酯酶是由于边际溶血(marginal hemolysis)而从红血球中释放的。
在另一个酰基胆碱酯酶分析中，对试验原则(Knedel和B_ttger，Klin.Wschr.45325-327(1967))进行了改进，作为反应(由酰基胆碱酯酶驱动)产物的硫代胆碱将黄色的六氰基高铁酸盐(III)迅速还原成几乎无色的六氰基高铁酸盐(II)，因此可以直接进行反应的光谱测定监控。
对于测量人血清中的酰基胆碱酯酶的催化活性的最优化反应条件已经被研究并确定[Schmidt等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30(3)163-170(1992)]。这些条件考虑了酶促反应动力学和人工与机械性能的技术方面。虽然它们不必提供最大可能的转化率，但要保证该方法最大程度的耐用性(robustness)。
然而，一个重要的然而未解决的问题是BTC的低稳定性，因为作为硫酯化合物的丁酰基硫代胆碱易于自动水解。因此，在分析条件下，总要从BTC的转化数(turnover)中除去BTC的自发解离以得到真实的酰基胆碱酯酶活性。众所周知，通过最优化底物浓度和缓冲条件，可以将该试剂空白反应最小化至一定程度。因为随着存储时间的增加，溶液中BTC的稳定性显著地降低，由此，重要的前提是提供新鲜制备的BTC溶液。目前，这仅可以通过重构(reconstitution)BTC颗粒来实现，该方法复杂且耗时。
在现有技术中不能获得这样的试剂，其使得不存在任何酶的情况下，在没有增加自动水解活性的条件下，在更长的时间内存储被溶解的胆碱酯酶底物如BTC。由于需要提供新鲜溶解的底物以在胆碱酯酶试验中最小化试剂空白反应，在平行的更大套数样品中检测胆碱酯酶活性将是复杂和低效的。在众多样品中简单和有效的检测胆碱酯酶活性，例如通过在自动分析器中进行高处理量的方法，在此时是不可能的。
因此，本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定化的胆碱酯酶底物溶液。
发明内容
本发明的目的是一种稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
本发明还涉及稳定化胆碱酯酶底物溶液的用途，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。本发明还涉及极性有机溶剂用于使胆碱酯酶底物溶液稳定化的用途，其中在缓冲溶液中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。此外，本发明还包括用于确定样品中胆碱酯酶活性的稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
此外，本发明涉及一种用于确定样品中胆碱酯酶的活性的方法，所述方法包括以下步骤在适于酶活性的条件下将怀疑含有该酶的样品和含稳定化胆碱酯酶底物溶液的试剂组合，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定，和监控该酶的活性。
本发明还包括用于确定样品中胆碱酯酶的活性的试剂盒，其包括在封装的组合中的第一试剂，其包括适于胆碱酯酶活性的缓冲溶液，和第二试剂，其包括稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。此外，本发明还涉及一种进行确定样品中胆碱酯酶的活性的方法的试剂盒，该方法包括以下步骤在适于酶活性的条件下将怀疑含有该酶的样品和含稳定化胆碱酯酶底物溶液的试剂组合，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定，和监控该酶的活性。
图1显示了由用DMSO(25体积％)稳定的新鲜制备的CHE底物溶液得到的和由同样的稳定化溶液(在35℃控温18天)得到的胆碱酯酶(CHE)的催化浓度的比较。
图2显示了根据DGKC[Deutsche Gesellschaft für KlinischeChemie，见Schmidt等人，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30(3)163-170(1992)]的建议由新鲜制备的CHE底物溶液得到的和由同样的溶液(35℃控温21天)得到的胆碱酯酶(CHE)的催化浓度的比较。
具体实施例方式
令人惊讶地，已经发现至少一种胆碱酯酶底物和至少一种极性有机溶剂物质的组合得到了一种稳定化的胆碱酯酶底物溶液。因此，本发明提供了一种稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
术语“稳定化”是指可以在不存在任何酶活性的情况下储藏根据本发明的胆碱酯酶底物溶液，而没有明显的底物失活。
“没有明显的底物失活”是指例如在35℃在至少18天的时间内存储稳定化溶液后或者在典型实验室条件(即在4-8℃冷藏)下存储达至少15个月后，没有BTC损失发生，结果在使用新鲜制备和培养的底物溶液获得的CHE催化浓度的图中，直线的截距为约小于+/-300U/l和斜率小于+/-3％。
术语“胆碱酯酶”包括酶活性，其催化酰酯水解为醇和羧酸根。在本发明中，包括任何胆碱酯酶，优选EC 3.1.1.7定义的乙酰胆碱酯酶和EC 3.1.1.8定义的酰基胆碱酯酶。还应理解的是“胆碱酯酶”是指覆盖了胆碱酯酶以及其生物学活性的亚型、片段和亚基，其在生物学意义上如同胆碱酯酶那样行为，即水解酰酯成为醇和羧酸根。
同至今已知的胆碱酯酶底物溶液(其必须在使用前由颗粒重构)相比，根据本发明的稳定化胆碱酯酶底物溶液具有显著的优点。作为一种液体试剂，对于根据本发明的稳定化底物溶液，不再需要由颗粒重构。这对于检测胆碱酯酶活性的恒定准确度来说是重要的前提。重构，即将颗粒放入溶液中，通常耗时且易于出错。在每次重构后，必须进行附加的校准分析以检验由独立重构的底物溶液得到的试验数据。相反，提供稳定化胆碱酯酶底物溶液使得试剂批次中所有瓶的组成是均一的，由此保证准确度的提高和减少校准分析的次数。
在本发明的一种实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液是稳定化酰基胆碱酯酶底物溶液。在本发明的另一种实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液是稳定化乙酰胆碱酯酶底物溶液。
术语“胆碱酯酶底物”包括所有被胆碱酯酶水解的底物，其包括属于酰酯类型的底物。在本发明的一种实施方案中，至少一种稳定化胆碱酯酶底物溶液的底物是胆碱酯。在另一种实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液的至少一种底物是硫酯，优选丁酰基硫代胆碱(BTC)或者乙酰基硫代胆碱(ATC)。
术语“极性有机溶剂”是指由有机化合物组成的溶剂，所述有机化合物包含碳原子并且具有亲水的性能，这是由于在该有机化合物中电荷分布不平均，使得各个分子的一端比另一端正电性更强。在本发明的一种实施方案中，所述至少一种极性有机溶剂物质是极性质子有机溶剂。术语“极性质子有机溶剂”是指这样的有机溶剂，该有机溶剂中的有机化合物包含一个或多个酸性氢原子，与″极性无质子有机溶剂″相反。在本发明的优选实施方案中，所述至少一种极性质子有机溶剂物质是醇。
术语“醇”是指一无醇，即只具有一个羟基的醇，以及含一个以上羟基的多元醇。优选地，所述至少一种极性质子有机溶剂物质是选自链长为1-7个碳原子的醇。在本发明中，链长为1-7个碳原子的醇包括具有分支碳链的醇如3-甲基己-3-醇以及具有直碳链的醇如乙醇。在本发明的优选实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液的特征在于至少一种底物被选自甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇的醇稳定。在本发明的另一个优选的实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液被甘油稳定。
根据本发明，所述至少一种极性有机溶剂物质还可以包括羧酸。术语“羧酸”是指有机酸，其特征为存在羧基。“羧酸”还包括羧酸的盐和阴离子，其也称为“羧酸根(盐)”(carboxylates)，以及每分子具有两个或更多羧酸基团的羧酸。
在本发明的一种实施方案中，所述至少一种极性有机溶剂物质是极性无质子有机溶剂(polar aprotic organic solvent)，其优选地选自羰基化合物或者杂羰基化合物。在本发明更优选的实施方案中，所述羰基化合物或者杂羰基化合物选自含1-12个碳原子的羰基化合物或者杂羰基化合物。在本发明的另一个优选的实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液特征在于至少一种底物被羰基化合物或者杂羰基化合物稳定，所述羰基化合物或者杂羰基化合物选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙酰丙酮、乙腈和六甲基磷酰三胺(HMPT)。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述至少一种极性无质子有机溶剂物质是醚。术语“醚”是指这类化合物，其包含醚基团，即连接到两个取代烷基的氧原子。在本发明的更优选的实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液特征在于至少一种底物被选自含1-12个碳原子的醚的醚稳定。在本发明中，包括任何含1-12个碳原子的醚，例如环醚、以及具有支化或线性碳链的醚。在本发明的一种实施方案中，稳定化胆碱酯酶底物溶液特征在于至少一种底物被环醚，优选四氢呋喃(THF)或者二氧杂环己烷(dioxan)稳定。
本发明还包括稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中在该反应混合物中至少一种极性有机溶剂物质的浓度至少为0.25vol％和最大100vol％。
在本发明的优选实施方案中，在稳定化胆碱酯酶底物溶液中的至少一种极性有机溶剂物质的浓度是对DMSO至少0.25vol％和最大100vol％，优选地至少0.25vol％和最大20vol％，对乙醇至少0.25vol％和最大100vol％，优选地至少0.25vol％和最大20vol％，对异丙醇至少0.5vol％和最大95vol％，优选地至少0.5vol％和最大20vol％，和/或对THF至少0.5vol％和最大100vol％，优选地至少0.5vol％和最大20vol％。
本发明的另一种方面是稳定化胆碱酯酶底物溶液的用途，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。本发明的其它方面是极性有机溶剂在使胆碱酯酶底物溶液稳定中的用途，其中在缓冲溶液中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。此外，本发明还包括用于确定样品中胆碱酯酶活性的稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
术语“样品”是指任何怀疑含胆碱酯酶的样品。样品典型地是水溶液。在本发明的一种实施方案中，样品是生物样品，如来自宿主的体液，例如，尿、全血、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、泪液、粘液等，但是优选地是血浆或者血清。如果期望的话，样品可以进行预先处理，并且可以在任何不妨碍分析的合适介质中制备。水介质是优选的。
胆碱酯酶的活性可以通过定量、半定量和定性方法以及全部其它用于确定胆碱酯酶的方法来确定。例如，仅在疑似含胆碱酯酶的样品中检测胆碱酯酶的存在或不存在的方法被认为包括在本发明的范围之内。术语“检测”、“监控”和“测量”以及用于“确定”意思的其它常见同义词预计在本发明的范围内。
根据本发明确定胆碱酯酶活性可以通过速率分析法(其中测量每单位时间胆碱酯酶活性的产物的吸光率变化)或终点法(其中在一定时间以后，使反应淬灭)进行。根据本发明，确定胆碱酯酶活性还可以通过测量产物吸光率变化来进行，所述产物是由实际酶促反应的产物中的一种开始的二次反应获得的。本发明方法可容易地应用于实验室或者临床分析所用的自动分析仪。在本发明的一种实施方案中，监控胆碱酯酶活性是通过确定硫代胆碱的形成，优选地通过分光光度测定法来测量六氰基高铁酸盐(III)还原为六氰基高铁酸盐(II)而进行的。在本发明的另一个优选的实施方案中，硫代胆碱的胆碱酯酶依赖性形成是通过分光光度测定法测量作为硫代胆碱与5，5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸酯的反应产物的5-巯基-2-硝基苯甲酸酯的形成而确定的。根据本发明，监控胆碱酯酶的活性可以通过使用自动分析仪来进行。
此外，本发明还涉及一种确定样品中胆碱酯酶的活性的方法，该方法包括以下步骤在适于酶活性的条件下将疑似含有该酶的样品和含稳定化胆碱酯酶底物溶液的试剂组合，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定，和监控该酶的活性。
为了强化本发明的通用性，用于本发明方法的试剂可以在封装的组合中、在相同或单独的容器中、以液体或冻干形式提供，以便各试剂的比值提供了方法和分析的显著优化。试剂可以各自位于单独容器中，或者各种试剂可以在一个或多个容器中组合，这取决于各试剂的交叉反应性和稳定性。因此，本发明的一个方面涉及用于方便地进行用于确定胆碱酯酶活性的本发明分析方法的试剂盒。
本发明包括用于确定样品中胆碱酯酶的活性的试剂盒，在封装的组合中包括第一试剂，其包括适于胆碱酯酶活性的缓冲溶液，和第二试剂，其包括稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。此外，本发明还涉及一种进行确定样品中胆碱酯酶的活性的方法的试剂盒，该方法包括以下步骤在适于酶活性的条件下将疑似含有该酶的样品和含稳定化胆碱酯酶底物溶液的试剂组合，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定，和监控该酶的活性。在本发明的一种实施方案中，用于进行确定样品中胆碱酯酶的活性的所述方法的所述试剂盒在封装的组合中包括第一试剂，其包括适于胆碱酯酶活性的缓冲溶液，和第二试剂，其包括稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
试剂可以保持液态或者冻干状态。试剂盒还可以包括其它的封装的校准材料，如含已知量胆碱酯酶的校准试剂。校准材料是指任何含有已知量的待测分析物的标准或者参比材料。在相似条件下，分析疑似含分析物的样品和校准材料。然后通过比较由未知样品获得的结果和由标准获得的结果来计算分析物浓度。在优选实施方案中，所述试剂盒包括为胆碱酯酶活性所优化的缓冲溶液和由至少0.25vol％和最大100vol％的DMSO、至少0.25vol％和最大100vol％的乙醇、至少0.5vol％和最大95vol％的异丙醇和/或至少0.5vol％和最大100vol％的THF稳定的胆碱酯酶底物溶液。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述试剂盒包括为胆碱酯酶活性所优化的缓冲溶液和由至少0.25vol％和最大20vol％的DMSO、至少0.25vol％和最大20vol％的乙醇、至少0.5vol％和最大20vol％的异丙醇和/或至少0.5vol％和最大20vol％的THF稳定的胆碱酯酶底物溶液。
根据本发明，各种辅助材料将常用于底物溶液或者分析中。例如，缓冲液将通常存在于分析介质中，以及用于分析介质的稳定剂和分析组分。通常，除这些添加剂以外，可以包括附加的蛋白质如白蛋白，或者表面活性剂，特别是非离子表面活性剂等。
现通过以下实施例或附图更详细地描述本发明，其当然不起限制作用。
实施例实施例1确定胆碱酯酶活性根据以下反应流程基于硫代胆碱的形成和检测而确定胆碱酯酶(CHE)活性
2硫代胆碱 二硫代双(胆碱)+2OH-+[Fe(CN)6]3-——→+H2O+2[Fe(CN)6]4-取决于胆碱酯酶活性，从丁酰基硫代胆碱特异地释放硫代胆碱。硫代胆碱迅速地将黄色的六氰基高铁酸盐III还原为几乎无色的六氰基高铁酸盐II。消光降低可以在波长405纳米和温度37℃下以分光光度法测量。由六氰基高铁酸钾III的摩尔吸收系数(92.7+/-0.4m2/mol)计算胆碱酯酶浓度。
特别地，按如下过程来确定胆碱酯酶活性两个试剂溶液，R1和R2，新鲜制备R191.5mM焦磷酸盐2.44mM六氰基高铁酸钾用柠檬酸将pH调节至7.7R210mM HEPPS45.7mM碘化丁酰基硫代胆碱用磷酸将pH调节至4.0极性有机溶剂，例如10％(体积)DMSO血清、肝素或者EDTA血浆作为样品材料或者0.9％(w/v)NaCl，R1和R2，根据以下方案移液至小管中，所得最终浓度为75.2mM焦磷酸盐、2.0mM六氰基高铁酸盐(III)、7.5mM丁酰基硫代胆碱和1.6mMHEPPS。
表1试剂空白和样品的移液方案
所述全部试剂和溶液用作37℃控温(tempered)的工作液。因此，再次控制小管中混合物的温度以保证移液后温度为37±0.05℃。
然后，添加180μl R2并且通过彻底混合样品来开始反应。
根据以下条件，使用手动光度计，恰在添加R2后90、120、150和180秒进行分光光度测量温度 37+0.05℃波长405nm带宽2nm光路10mm延迟时间90秒测量时间90秒此外，考虑以下的样品材料的稀释极限ΔE/分钟＝0.380(测量时间60秒)对于更高活性100μl样品与100μl 0.9％(w/v)NaCl溶液混合，重复测量，结果放大到2倍。
对于活性ΔE/分钟＜0.007，样品体积加倍(30μl)，减去试剂空白，结果放大至33914倍。
相对于空气进行测量以确定消光的降低。对于各个系列的测量，确定5次空白反应值，并且在任何一次，空白反应值被从真实酶促反应值中减去。
因而，样品中的胆碱酯酶的转换速率等于样品反应和空白反应之差(ΔE/分钟)CHE＝(ΔE/分钟)样品-(ΔE/分钟)试剂空白通过将转换速率(ΔE/分钟)CHE乘以因子78749来计算胆碱酯酶的催化浓度(U/L)
其中1000U/L＝16.67μkat/L；1μkat/L＝60U/L，具有因子78749的公式是基于以下计算在波长405nm和测量温度37℃下，催化浓度是
b=A·Vϵ·l·v]]>-在405nm六氰基高铁酸钾的摩尔吸收系数ε＝92.7m2·mol-1(见DGKC建议)-光程长，l0.01m-反应体积，V 1.095·10-3L(R10.900·10-3·L+R20.180·10-3L+样品)-样品体积，v 0.015·10-3L-A60秒的消光降低拟合b=A·1.095·10-392.7·0.01·0.015·10-3·L·mol·m2·m·L·min]]>b=A·78.7487·molm3·min]]>b=A·78749·UL]]>或b=A·1312.5·μkatL(1μkat=60U)]]>在波长415nm下，移液体积为R1180μl、样品3μl和R236μl，使用自动Roche/Hitachi 917分析仪根据类似的程序进行以下实施例中的实验。
实施例2用不同的极性有机溶剂评定丁酰基硫代胆碱(BTC)的稳定性在试剂老化结果的变化中能够看出BTC的稳定化不足。为了评定BTC稳定性，用由控温的底物溶液(在35℃控温18-21天)得到的胆碱酯酶的催化浓度与由新鲜制备的底物溶液得到的胆碱酯酶的催化浓度进行比较。
类似于实施例1中所述的程序在Roche/Hitachi 917分析仪上进行测量。
以上“老化模型”适于快速评价不同的胆碱酯酶底物溶液，因为在35℃控温18-21天的试剂相当于在冷藏的常规条件下储藏15-18个月的试剂。
使用这种“老化模型”，不同的胆碱酯酶底物溶液-/+某些极性有机溶剂的稳定性根据使用新鲜制备的和控温的底物溶液获得的CHE催化浓度图(见例如图1、2)中的直线的截距和斜率来确定。这些参数(截距和斜率)与未稳定化胆碱酯酶底物溶液的参数比较，例如按照DGKC[Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie，见Schmidt et al.，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30(3)163-170(1992)]建议而制备的(见图2)或者根据实施例1(即R2没有极性有机溶剂)制备的。
因此，截距约小于+/-300U/l和斜率小于+/-3％是稳定化胆碱酯酶底物溶液的标准，其指出实际上在35℃培养21天内没有BTC损失。
相反，类似地用DGKC建议的或根据实施例1制备的(即R2没有极性有机溶剂)未稳定化的原始制剂(formulation)确定的这些参数值与指出BTC稳定化的参数值有很大的差别DGKC制剂y＝-1464+0.8105*x(见图2)新鲜试剂用Roche校准器CFAS校准，并且从新鲜试剂的校准曲线读取控温的试剂。
对用以下极性有机溶剂稳定的胆碱酯酶底物溶液进行测试并且该胆碱酯酶底物溶液满足BTC稳定化的要求(各体积百分比浓度在括号内指出)；极性有机溶剂(体积％)直线函数乙醇(20％) y＝-178+1.016*xDMSO(20％) y＝14+0.985*x(见图1)异丙醇(20％)y＝180+0.976*xTHF(5％)y＝252+0.982*x乙腈(20％) y＝187+0.995*x硫醇(sulfanol)(20％)y＝58+1.020*x甘油(20％) y＝302+0.976*x实施例3为丁酰基硫代胆碱(BTC)的稳定性而确定不同的极性有机溶剂的极限浓度基于实施例2中所述的“老化模型”，根据使用新鲜制备的和控温的底物溶液获得的CHE催化浓度图中的直线的截距和斜率来确定极性有机溶剂的最小浓度(以体积百分数计)。
表2为丁酰基硫代胆碱(BTC)的稳定性而确定不同的极性有机溶剂的极限浓度。
考虑稳定化胆碱酯酶底物溶液的标准，即截距约小于+/-300U/l和斜率小于+/-3％，具有稳定效果的最低浓度是对于乙醇和DMSO分别为1％(vol％)，对于THF和异丙醇分别为2％(vol％)。
实施例4不同的极性有机溶剂的组合来评定丁酰基硫代胆碱(BTC)的稳定性由表2中所概括的数据，可以认为BTC的稳定化溶液可以使用0.25％DMSO、0.25％乙醇、0.5％异丙醇和0.5％THF来制备。
根据实施例1制备试剂R1。根据实施例1制备试剂R2，包括极性有机溶剂DMSO，0.25％；ETOH，0.25％；异丙醇，0.5％；THF，0.5％。
一等分新鲜制备的R2在35℃储藏21天。另一等分在4-8℃冷藏储藏。在此老化阶段之后，对于至少30个CHE活性为3000-15000U/l的样品，将两等分与R1一起使用来根据实施例1确定胆碱酯酶活性。
老化的R2相对于冷藏储藏的R2的结果图预计给出这样的结果，其指出根据如上所定义的稳定化胆碱酯酶底物溶液的标准，实际上没有BTC损失。
权利要求
1.极性有机溶剂用于使胆碱酯酶底物溶液稳定化的用途，其中在缓冲溶液中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
2.权利要求1的用途，其中所述底物是胆碱酯。
3.权利要求1的用途，其中所述底物是硫酯。
4.权利要求3的用途，其中所述硫酯是丁酰基硫代胆碱(BTC)或者乙酰基硫代胆碱(ATC)。
5.权利要求1的用途，其中所述胆碱酯酶底物溶液是酰基胆碱酯酶底物溶液或者乙酰胆碱酯酶底物溶液。
6.权利要求1的用途，其中所述至少一种极性有机溶剂物质是极性质子有机溶剂。
7.权利要求6的用途，其中所述极性质子有机溶剂是醇。
8.权利要求7的用途，其中所述醇选自链长为1-7个碳原子的醇。
9.权利要求8的用途，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和甘油。
10.权利要求1的用途，其中所述至少一种极性有机溶剂物质是极性无质子有机溶剂。
11.权利要求10的用途，其中所述极性无质子有机溶剂选自羰基化合物和杂羰基化合物。
12.权利要求11的用途，其中所述羰基化合物或者杂羰基化合物选自含1-12个碳原子的羰基化合物或者杂羰基化合物。
13.权利要求12的用途，其中所述羰基化合物或者杂羰基化合物选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙酰丙酮、乙腈和六甲基磷酰三胺(HMPT)。
14.权利要求10的用途，其中所述极性无质子有机溶剂是醚。
15.权利要求14的用途，其中所述醚选自含1-12个碳原子的醚。
16.权利要求15的用途，其中所述醚是环醚。
17.权利要求16的用途，其中所述环醚选自四氢呋喃(THF)和二氧杂环己烷。
18.权利要求1的用途，其中所述至少一种极性有机溶剂物质的浓度是二甲亚砜至少0.25vol％和最大20vol％，乙醇至少0.25vol％和最大20vol％，异丙醇至少0.5vol％和最大20vol％，和/或THF至少0.5vol％和最大20vol％。
19.前述权利要求中任一项的用途，其中所述底物在存储于35℃至少18天后不明显失活。
20.权利要求1-18中任一项的用途，其中所述底物存储于4-8℃至少15个月后不明显失活。
21.一种用于确定样品中胆碱酯酶的活性的试剂盒，包括在封装的组合中的a.第一试剂，其包括适于所述酶的活性的缓冲溶液，b.第二试剂，其包含稳定化的胆碱酯酶底物溶液，其中在缓冲溶液中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。
22.权利要求21的试剂盒，所述试剂盒还包括含已知量所述酶的校准试剂。
23.权利要求21的试剂盒，其中所述样品是全血、血浆或者血清。
24.权利要求21的试剂盒，其中所述胆碱酯酶是酰基胆碱酯酶或者乙酰胆碱酯酶。
25.权利要求21的试剂盒，其中所述底物在存储于35℃至少18天后不明显失活。
26.权利要求21的试剂盒，其中所述底物存储于4-8℃至少15个月后不明显失活。
全文摘要
本发明涉及极性有机溶剂在使胆碱酯酶底物溶液稳定化中的用途，其中在缓冲溶液中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定，还涉及所述溶液用于确定样品中胆碱酯酶活性的用途。此外，本发明还包括用于确定样品中胆碱酯酶活性的稳定化胆碱酯酶底物溶液，其中至少一种底物被至少一种极性有机溶剂物质稳定。此外，本发明涉及用于确定样品中胆碱酯酶的活性的方法，以及用于确定样品中胆碱酯酶的活性的试剂盒和用于进行确定样品中胆碱酯酶的活性的方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/46GK1978660SQ20061016425
公开日2007年6月13日 申请日期2006年12月7日 优先权日2005年12月8日
发明者N·戈特沙尔克, H·-J·凯特兹亚, M·穆克克, R·纳格尔, F·韦伯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司