专利名称：具有改善的l－赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物和利用棒杆菌微生物生产l－赖氨酸的方法
相关专利申请的交叉参考本申请要求2005年11月30日提交于韩国知识产权局的韩国专利申请10-2005-0115904的利益，其全部内容通过参考结合与此。
1.发明领域本发明涉及属于棒杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物，其具有增强的L-赖氨酸生产力，还涉及利用其生产L-赖氨酸的方法。
2.相关领域的描述棒杆菌属菌株，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是广泛用于生产L-氨基酸的微生物。L-氨基酸，特别是L-赖氨酸用于生产动物饲料和用于人类的药物，并且还用于制药业。L-氨基酸是通过发酵棒杆菌菌株而生产，但由于利用棒杆菌属生产L-氨基酸的方法很重要，已经广泛尝试改善该方法。
一种改善利用棒杆菌属的菌株生产L-氨基酸的这样的尝试是涉及利用重组DNA技术破坏或削弱特定基因的表达。例如，在美国专利号6,872,553中，提供了一种发酵制备L-氨基酸的方法，该方法包括a)棒杆菌的生长阶段，与未削弱的棒杆菌相比，在所述棒杆菌中编码烯醇丙酮酸磷酸(PEP)羧激酶(pck)的DNA被通过诱变的方法而削弱，所述诱变的方法选自由下述方法组成的组通过插入至少一个碱基对的插入诱变；缺失至少一个碱基对的缺失诱变；和结合无义突变的转换或颠换诱变，从而削弱了所述多肽的活性；b)在所述细菌的培养基或细胞中进行需要的L-氨基酸产物的浓缩阶段；和c)分离所述L-氨基酸产物的分离阶段。
另外，已经广泛研究扩增与单个L-氨基酸的生物合成相关的基因对于生产L-氨基酸的影响，并且研究了改善生产L-氨基酸的棒状杆菌菌株(Eggeling，Amino Acids 6，261-272(1994))。另外，已经尝试了引入不同细菌来源的外源基因。例如，在日本公开的专利申请号Hei 7-121228中，提供了一种培养属于棒杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)微生物的方法，所述微生物具有DNA片段和载体DNA的重组DNA，所述DNA片段具有与微生物的柠檬酸合酶有关的基因信息，还提供了在培养基中生产L-谷氨酸和L-脯氨酸的方法。
然而，依照所述方法，需要使用具有提高的L-赖氨酸生产力的菌株。
发明概述本发明提供了属于棒杆菌属、并且具有提高的L-赖氨酸生产力的微生物。
本发明还提供了利用棒杆菌属微生物生产L-赖氨酸的方法。
附图简述通过参考附图详细描述其示例性的实施方案，本发明的上述和其它特征及优势将变得更明显
图1是说明用约500bp的NCgl2053基因片段克隆的pCR-2053载体的图解。
发明详述依照本发明的一个方面，提供了属于棒杆菌属的微生物，其具有失活的固有的NCgl2053脱氢酶基因，并且生产赖氨酸。
固有的NCgl2053脱氢酶基因具有脱氢酶活性，并且在棒杆菌属微生物中天然存在(Nakagawa，Appl.Microbiol.Biotechnol.62(2-3)，99-109(2003))。从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的基因组的完整序列分析来评价脱氢酶的活性。脱氢酶基因可以具有SEQ IDNo1的核苷酸序列。
依照本发明的一个实施方案，属于棒杆菌属并且具有失活的固有(inherent)NCgl2053脱氢酶基因的微生物可以是谷氨酸棒杆菌ATCC13032，Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539，谷氨酸棒杆菌KFCC 10881或谷氨酸棒杆菌KFCC 11001，但不限于这些实例。
可以利用任何本领域已知的方法引入失活。在本发明的微生物中，术语“失活”是意图表示NCgl2053脱氢酶基因的表达低于野生菌株的表达或者根本不表达，或者即使NCgl2053脱氢酶基因表达成NCgl2053脱氢酶，但NCgl2053脱氢酶根本不具有活性或具有减弱的活性。
在本发明的一个实施方案中，可以利用诱变方法引入失活，所述诱变选自由下述诱变组成的组通过将至少一个碱基对插入到NCgl2053脱氢酶基因中的插入诱变，在NCgl2053脱氢酶基因中缺失至少一个碱基对的缺失诱变，和结合无义密码子的转换或颠换诱变。
在本发明的一个实施方案中，可以通过用具有抗生素标记和部分NCgl2053脱氢酶基因区域的载体转化属于棒杆菌属的细菌，并在抗生素条件下培养所述细菌来引入失活。例如，所述载体可以是pCR-2053，其包括部分NCgl2053基因，如SEQ ID No2所示。将具有部分所述基因的载体转化到微生物中并在选择标记存在的条件下培养导致部分所述基因序列和微生物固有基因的同源重组。通过同源重组，微生物的固有基因被重组，并且在具有重组基因的微生物中，仅具有上述标记的重组微生物被选择。结果，可以获得属于棒杆菌属、并且具有失活的固有的NCgl2053脱氢酶基因的微生物。然而，获得本发明微生物的方法并不限于该这种同源重组方法，可以使用本领域已知的任何方法。
所述微生物可以是谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102(保藏号是KCCM-10709P)。
依照本发明的另一个方面，提供了一种生产L-赖氨酸的方法，该方法包括培养本发明的微生物以在培养基或细胞中生产L-赖氨酸，从培养物中收集L-赖氨酸。
在本发明的方法中，可以使用本领域已知的任何培养条件和方法来培养棒杆菌属的微生物。用于培养棒杆菌属菌株的培养基的实例是是美国细菌学会的普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriologyby the American Society for Bacteriology)(Washington D.C.，USA，1981)中公开的培养基。可以用于培养基中的碳源包括下述碳源糖和碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，淀粉和纤维素；油和脂肪如大豆油，葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚麻酸；醇如乙醇；和有机酸如乙酸。上述提及的糖源的实例可以单独使用或组合使用。氮源实例包括下述物质蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。上述提及的氮源可以单独使用或组合使用。磷源的实例包括下述物质磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，或其相应的钠盐。另外，培养基可以包括金属盐如硫酸镁或硫酸铁，它们对于生长是必需的。另外，除了上述成分外，可以使用生长的必需物质如氨基酸和维生素。而且，可以在培养基中使用适当的前体。在分批或连续方式培养过程中可以向培养基中添加上述成分。
利用碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾或氨，或利用酸性化合物如磷酸或硫酸可以控制培养基的pH。另外，使用抗泡沫剂如脂肪酸聚乙二醇酯可以抑制泡沫的产生。为了维持有氧条件，可以将氧或含氧的气体如空气注入到培养基中。培养基的温度是20-45℃，优选25-40℃。可以进行培养直至产生所需量的L-赖氨酸，但进行培养10-160小时是理想的。
可以以各种方式包括分批、补料分批、重复补料分批和连续方式进行培养。这些方法在本领域是众所周知的，并且本发明并不局限于此。
可以通过阴离子交换层析和水合茚三酮衍生物产生来分离和分析L-氨基酸。
为了开发本发明的微生物和方法，本发明的发明人首先在存在L-赖氨酸的条件下培养谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，利用双向电泳分析从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032表达的蛋白水平，并将其于那些在无L-赖氨酸的条件下进行培养所表达的蛋白水平相比较。结果，我们鉴定了在存在L-赖氨酸的条件下过量表达的蛋白质，即可能由L-赖氨酸的存在而诱导的蛋白质。基于被鉴定蛋白质的信息，利用美国国家健康协会GenBank(NIHGenBank)确定上述蛋白质的基因信息，该蛋白质被证实是NCgl1835和NCgl2053。
另外，证实了是否上述基因是由于存在赖氨酸而实际诱导的。首先，通过PCR扩增认为是上述基因的启动子的核酸区域，然后将扩增的启动子核酸与去除启动子的LacZ基因融合，以获得上述鉴定基因的启动子-LacZ编码序列的融合基因。将获得的融合基因插入到载体中，并将载体引入到微生物中。在存在赖氨酸的条件下培养获得的微生物，通过测量β-半乳糖苷酶的活性证实是否表达了LacZ蛋白。结果，证实了赖氨酸诱导了上述基因的表达。
然而，不了解在产生赖氨酸的微生物中上述基因是如何与赖氨酸的生物合成相关联的。除了鉴定在存在赖氨酸的条件下基因过表达以外，本发明的发明人测量了通过灭活棒杆菌属微生物的固有NCgl2053基因而产生的赖氨酸的量，证实了所产生的赖氨酸的量实际上增加了。
实施例通过参考下述实施例将更详细地描述本发明。这些实施例仅是用于举例说明的目的，其不是意图限制本发明的范围。
在下述实施例中，通过灭活谷氨酸棒杆菌KFCC10881的固有NCgl2053基因来制备重组微生物，培养重组微生物以在培养物中产生赖氨酸，并测量所产生的赖氨酸的量。
实施例1产生载体以灭活棒杆菌属微生物的固有NCgl2053基因在本实施例中，为了产生具有抗生素标记和NCgl2053的部分DNA序列的载体，利用SEQ ID.NOS.3和4的寡核苷酸作为引物和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体作为模板，通过PCR扩增约500bp的NCgl2053基因片段(SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.1的170-650核苷酸)。通过在96℃的温度下变性30秒，在52℃的温度下退火30秒，在72℃的温度下聚合30秒，重复30次来进行PCR。通过使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen，US)将扩增的NCgl2053基因片段插入到大肠杆菌(E.coli)质粒pCF2.1中，以产生pCR-2053质粒。图1显示了pCR-2053载体，其中克隆了约500bp的NCgl2053基因片段。
实施例2产生具有灭活的谷氨酸棒杆菌KFCC10881固有NCgl2053基因的L-赖氨酸生产菌株利用在Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52541-545中举例说明的转化方法，通过电脉冲方法用在实施例1中产生的pCR-2053转化L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881，然后在含25mg/L卡那霉素的选择培养基中培养转化的微生物。在培养的第二天利用转化菌株的染色体DNA作为模板进行PCR以证实是否NCgl2053基因被破坏。通过利用SEQ ID.NO.5和6的寡核苷酸作为引物和转化菌株的染色体DNA作为模板进行PCR以扩增含有pCR-2053质粒，且具有约5150bp长度的NCgl2053的基因片段(SEQ ID.NO.1的118-775核苷酸)。结果，获得破坏了上述基因的谷氨酸棒杆菌KFCC10881菌株，然后命名为谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102。认为通过同源重组将pCR-2053质粒结合到染色体DNA的固有NCgl2053基因当中破坏了上述基因。
将谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102菌株于2005年11月16日保藏在韩国微生物保藏中心，其为布达佩斯条约承认的国际保藏机构(保藏号KCCM-10709P)。
实施例3利用谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102生产L-赖氨酸通过培养在实施例2中产生的谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102菌株生产L-赖氨酸。
首先，将谷氨酸棒杆菌亲本菌株KFCC10881接种到具有25ml的下述接种培养基(seed culture medium)的250ml弯头-挡板烧瓶(corner-baffledflask)，将得到的物质于30℃下200rpm搅拌培养20小时。将1ml得到的培养溶液接种到含24ml下述生产培养基的250ml弯头-挡板烧瓶(corner-baffled flask)中，将得到的物质于30℃下200rpm搅拌培养120小时。培养完成后，利用HPLC(Waters 2457)测量产生的L-赖氨酸的量。结果，确定谷氨酸棒杆菌KFCC10881和KFCC10881-CJP5102分别在培养物中产生盐酸盐形式的45g/l和49g/l的L-赖氨酸。
接种培养基(pH7.0)(每升的蒸馏水)原糖(raw sugar)20g蛋白胨 10g酵母提取物 5g
尿素1.5gKH2PO44gK2HPO48gMgSO47H2O0.5g生物素 100μg硫胺HCl1000μg钙-泛酸 2000μg烟碱2000μg生产培养基(pH7.0)(每升的蒸馏水)原糖100g(NH4)2SO440g大豆蛋白2.5g玉米浆 5g尿素3gKH2PO41gMgSO47H2O0.5g生物素 100μg盐酸硫胺素 1000μg钙-泛酸 2000μg烟碱3000μgCaCO330g实施例4谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102菌株的培养基中收集L-赖氨酸通过将盐酸加入到1L赖氨酸发酵肉汤中将发酵肉汤的pH调节到pH2.0，所述赖氨酸发酵肉汤通过在含糖蜜和原糖的培养基中培养谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5102而获得，钙离子转化为CaSO4和CaCl2。然后，将培养物质向上方流入阳离子交换树脂(Diaion SK-L10)，该树脂以铵离子的形式再生，将赖氨酸吸附到树脂上。通过用软化水洗涤去除阳离子交换树脂中残留的细菌，通过用2N-氢氧化铵洗脱树脂收集高度浓缩的赖氨酸。将pH调整至5.0，浓缩收集的溶液，并通过冷却至20℃结晶。通过离心分离结晶完全的淤浆获得第一批湿产物，通过分批浓缩和结晶母液获得第二批湿产物。通过合并第一批和第二批湿产物并干燥合并的产物获得46.5g干燥的赖氨酸产物，其赖氨酸含量是98.5％。
尽管参考本发明的示例性实施方案已经具体显示和描述了本发明，本领域的普通技术人员可以理解可以对本发明进行各种形式和细节变化而不背离如后附的权利要求所限定的本发明的精神和范围。
序列表<110>CJ株式会社<120>具有改善的L-赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物和利用其生产L-赖氨酸的方法<160>6<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>888<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032<220>
<221>基因<222>(1)..(879)<223>NCgl2053基因<400>1atgatttcat tgctaaatga tccacgtacg ctattcccga aagtcgatcc cccaaagcaa60agccagccgg aaccaggcct agatataaaa ctttcccccc aagccgatat tggtctctcc120agctatcaag gaagtggaag gcttaagggc cgcaaggctc ttattactgg tggcgattct180gggattggag ctgccgtagc aatcgcttat gctcgcgagg gggcagatgt tgcgatcgct240tacttgcccg aagaacaagc cgatgctgac agagtgctcc aagcaatcga ggaaacaggt300caaaaagctt tttctttccc tggtgatctc cgtgatccag aatactgtcg ctcgctggtc360
caagagacgg tgaacgcttt aggtggccta gacatcttgg tcaacaacgc gtcacgtcag420gtgtgggcac ctggtttgac cgaaattacc gacgaaaact tcgaccagac tttgcaggtt480aacctctatg gtagttttcg ggttaccaaa gcagctatac ctcatctgaa gcccggatca540tcgataatct ttacatcgtc cattcaggcg taccaacctt cggaaaccct cttggattac600gccatgacta aggcggcatt gaacaatttg tcaaagggct tggcaagtag tctgataggc660gatggcattc gggtaaattc tgtagcccca ggtcctttct ggacgccgtt gcaacccagc720catggtcagc cacaagagaa aatagaagga tttggccagc acgctccgat tggaagagcg780ggtcaccctg ttgagttggc aggtgcgtac gtttttctcg cttctgacga agccagctat840gtggtaggag aaaccctggg agtcacaggt gggacgccca ccccatag 888<210>2<211>500<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032NCgl2053基因的片段<400>2gtggcgattc tgggattgga gctgccgtag caatcgctta tgctcgcgag ggggcagatg60ttgcgatcgc ttacttgccc gaagaacaag ccgatgctga cagagtgctc caagcaatcg120aggaaacagg tcaaaaagct ttttctttcc ctggtgatct ccgtgatcca gaatactgtc180
gctcgctggt ccaagagacg gtgaacgctt taggtggcct agacatcttg gtcaacaacg240cgtcacgtca ggtgtgggca cctggtttga ccgaaattac cgacgaaaac ttcgaccaga300ctttgcaggt taacctctat ggtagttttc gggttaccaa agcagctata cctcatctga360agcccggatc atcgataatc tttacatcgt ccattcaggc gtaccaacct tcggaaaccc420tcttggatta cgccatgact aaggcggcat tgaacaattt gtcaaagggc ttggcaagta480gtctgatagg cgatggcatt500<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>扩增NCgl2053基因的部分区域(170-650nt)的引物1<400>3gtggcgattc tgggattgga20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>扩增NCgl2053基因的部分区域(170-650nt)的引物2<400>4aatgccatcg cctatcagac20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>扩增NCgl2053基因的部分区域(118-775nt)的引物3<400>5tccagctatc aaggaagtgg20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>扩增NCgl2053基因的部分区域(118-775nt)的引物4<400>6
ttccaatcgg agcgtgctgg20
权利要求
1.微生物，其属于棒杆菌属，具有灭活的固有的NCgl2053脱氢酶，并且产生赖氨酸。
2.权利要求1的微生物，其通过诱变的方法获得，所述诱变选自由下述诱变组成的组通过将至少一个碱基对插入到NCgl2053脱氢酶基因中的插入诱变，在NCgl2053脱氢酶基因中缺失至少一个碱基对的缺失诱变，和结合无义密码子的转换或颠换诱变。
3.权利要求1的微生物，其是通过转化具有抗生素标记和部分NCgl2053脱氢酶基因的载体并在抗生素条件下培养而选择的。
4.权利要求1的微生物，其中NCgl2053脱氢酶基因具有SEQ ID No1的核苷酸序列。
5.权利要求1的微生物，其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881-CJP5102(保藏号KCCM-10709P)。
6.一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括培养依照权利要求1-5任一项的微生物以在培养基或细胞中产生L-赖氨酸；和从培养物中收集L-赖氨酸。
全文摘要
本发明提供了属于棒杆菌属、具有灭活的固有的NCgl2053脱氢酶基因的微生物，和一种利用该微生物生产L－赖氨酸的方法。通过使用该微生物，L－赖氨酸的产率提高，原因在于固有的NCgl2053脱氢酶基因被灭活。依照该方法，可以高产率地生产L－赖氨酸。
文档编号C12N15/09GK1974761SQ20061016370
公开日2007年6月6日 申请日期2006年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者朴英薰, 具贤敏, 林相曹, 文准玉, 梁荣烈 申请人:Cj株式会社