专利名称：一种豇豆锈病抗性的分子标记检测方法
技术领域：
本发明涉及蔬菜分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用分子标记技术准确、快速检测豇豆锈病抗性的检测方法。
背景技术：
豇豆锈病(Uromyces vignae Barclay)为豇豆生产上普遍发生的一种全国性病害，主要危害叶片和豆荚，叶片发病导致叶片变形，提前脱落，严重影响产量；豆荚染病后不堪食用。温度20～25℃，相对湿度90％左右时易发此病。盛发期在华北地区为7～8月份，华南地区为5～10月份(汪雁峰.豇豆.中国农业科学技术出版社，北京2004.)。施用药剂防治、实行轮作换茬对豇豆锈病的防治有一定的效果，但药剂防治在生产上会造成农药残留，实行轮作换茬在豇豆主产区很难实现，因此选育抗锈病品种是防治豇豆锈病发生的最经济、安全和有效的途径。
目前豇豆抗锈病育种中主要依赖于田间接种鉴定和植株表型选择，这要求育种家有丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间。豇豆锈病由真菌豇豆单孢锈病菌侵染引起，属于专性寄生菌，只能在活体上存活，无法进行人工培养，因此，豇豆锈病的发生受季节限制，在非发病季节对该病的田间鉴定工作则较难进行(王汉荣等.豇豆品种(系)对豇豆锈病的抗性鉴定与评价研究.中国农学通报，200016(2)60-61)；接种时豇豆植株的大小会直接影响到抗性鉴定的准确性；由于豇豆锈病的发生适宜在温度20～25℃、相对湿度90％左右的气候条件，因此，豇豆锈病的抗性鉴定需创造特殊环境进行。总之，传统的田间接种鉴定由于受病原菌来源、发病季节、接种环境和植株大小等因素的影响，导致传统的豇豆抗锈病鉴定准确性差、抗锈病育种周期长(长达数年至十几年)，而且育种成本较高。因此，豇豆育种和生产上急需一种能早期、周年、快速、准确鉴定豇豆锈病抗性的方法。
分子标记辅助育种(molecular marker-assisted selection，简称MAS)是现代分子生物学与传统遗传育种学相结合，借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，从而可以快速选择得到具有目的性状的后代(方宣钧，吴为人，唐纪良.作物DNA标记辅助育种.北京科学出版社，2001.)。通过找到与抗病基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因的存在与否，而且可以在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这种间接的迅速、稳定、可靠的选择方法，因不受其它效应和环境因素的影响，可使育种家摆脱对表型性状抗性的依赖，在早世代进行选择，快速地将多个抗病基因聚合，培育出持久抗病品种，从而大大提高育种效率。应用MAS，理论上只要回交3代就可以选择到理想的材料。因此，研究开发实用性强、成本低、准确性高的与豇豆抗锈病基因连锁的分子标记，可以显著加快豇豆抗锈病育种速度，提高选择的效率和准确性，在豇豆抗锈病育种中极具应用价值。但目前尚未见与豇豆抗锈病相关基因连锁的分子标记研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对已有豇豆锈病抗性鉴定方法中存在的费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种基于PCR技术的具有快速、简便、成本低廉、灵敏度高等特性的豇豆锈病抗性分子标记检测技术。
本发明的主要依据是根据已获得的和豇豆抗锈病基因紧密连锁的AFLP分子标记，将其转化为基于PCR、简便、快速、成本低廉、稳定性好的SCAR分子标记。研究已表明豇豆的锈病抗性为质量性状，由单显性基因控制(张衍荣，方木王，黄健坤.长豇豆锈病抗性遗传研究.中国蔬菜，1997，(6)10-12)。所以可以通过检测豇豆基因组内是否存在和抗锈病基因紧密连锁的特异片段来判定其锈病抗性，即如果检测出特异片段，则说明被检植株为抗性株；如果没有检测出特异片段，则说明被检植株为感病植株。
本发明目的通过以下技术方案来实现一种豇豆锈病抗性的分子标记检测方法，包括以下步骤1)、待检测豇豆叶片样品的采集取豇豆植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.2-0.3克，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；2)、阴性对照品种(之豇282)植株和阳性对照品种(南辰豆角2号)植株叶片样品的采集取豇豆顶部较为幼嫩的叶片，每份0.2-0.3克，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；3)、样品基因组DNA的提取采用常规的CTAB法或基因组提取试剂盒提取基因组DNA，TE溶解或双蒸水融解，现用或在-20℃冷冻保存；4)、根据已获得的和豇豆抗锈病基因紧密连锁的AFLP标记全序列设计一对引物，扩增片段长度为98bp，引物序列为引物I5’---TCAACAGTGTCAGACCAAAC---3’引物II5’---GTTGAAGATTGTGGAAAGCT---3’5)、最佳扩增体系的建立利用正交试验，摸索建立和豇豆抗锈病基因连锁特异片段的最佳扩增体系；6)、样本检测与判定根据待检测样品和对照样品的特异片段的扩增结果，对被检测豇豆植株是否为抗性株进行判定。
本发明的有益效果为1、简便易行只需采集待检豇豆植株的幼嫩叶片0.2-0.3克，采用实验室常规PCR技术，通过一次PCR扩增，就可以判断出所检测的豇豆品种或单株是否为抗锈病品种或植株，而无需进行田间接种抗性鉴定，因此，周年均可在实验室内进行。
2、快速、灵敏、特异性检测从取样到检测扩增结果，一般只需8个小时左右，通过特异性扩增产物的有无即可进行准确、直观的判断，具备简单分子生物学技术的人员就可以应用；而常规田间接种鉴定，在具备病原菌、接种所需温、湿度的前提下，仅培养幼苗就需时3周左右，加上接种后2周才能进行判定，可见常规接种鉴定需时在5周以上，期间影响发病的因素较多，容易影响结果的准确性。
3、成本低廉按检测100个样本推算，应用本发明检测一个样本的成本低于1.5元，常规田间接种鉴定需10元以上，因此应用该发明可以大幅度降低抗性鉴定的成本。
4、通过早期检测，可缩短豇豆抗锈病育种或市场种子鉴定周期前者在豇豆发芽期即可对其锈病抗性进行早期检测，显著缩短豇豆抗锈病育种周期；后者可以快速准确鉴定和确认市场上销售的豇豆品种对锈病的抗性，为豇豆品种纠纷提供科学的检测依据，有效打击商业欺诈行为，保障菜农的权益，有利于规范豇豆种子市场。
因此，本检测技术具备快速、简便、准确、成本低廉等特点，易于在豇豆抗性育种机构和豇豆种子市场推广使用。
图1、豇豆叶片基因组DNA提取琼脂糖凝胶检测结果2、豇豆抗锈病特异片段扩增结果图MDNA Marker；1-10F2代感病植株；11-20F2代抗病植株；21阴性对照；22阳性对照；具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。
实施例(以豇豆幼嫩叶片组织为样品对豇豆锈病抗性进行检测的方法)步骤1待检豇豆幼嫩叶片样品的采集植株叶片采自浙江省农业科学院海宁基地，共22份样品。其中，亲本各一份，母本为抗性品种‘南辰豆角2号’，父本为感病品种‘之豇282’；F2代单株20份，其中10份为抗病株，10份为感病株。各采植株顶部幼嫩叶片0.2克，-20℃冻存；步骤2叶片样品的基因组DNA提取采用常规的CTAB法提取叶片样品的基因组DNA，在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测为高质量的基因组DNA后(见图1)，用TE溶解，最后在-20℃冻存。
步骤3特异片段引物设计与扩增根据已获得的和豇豆抗锈病基因紧密连锁的AFLP标记的全序列(150bp)GACTGCGTACCAATTCAAGGTAATGTACAAATATTCAACAGTGTCAGACCAAACAATTtCCAACAATGATGCTTTCAATGTGAGATATTTCATGGTAGCCCAGTCCAAATGCAGCTTTCCACAATCTTCAACAGTTACTCAGGACTCATC
设计一对引物作为特异片段的引物。扩增片段长度为98bp，由上海生物工程公司合成，引物序列为引物I5’---TCAACAGTGTCAGACCAAAC---3’引物II5’---GTTGAAGATTGTGGAAAGCT---3’PCR最佳扩增体系为模板DNA 1.0μL，引物I 2μL(30ng·μL-1)，引物II2μL(30ng·μL-1)，dNTPs 0.4μL(10mM)，10×PCR Buffer 2μL，MgCl21.6μL(25mM)，TaqE 0.2μL(5U·μL-1)，ddH2O 11.3μL，总体积为20μL。
PCR扩增程序先94℃预变性4min，然后进行94℃30s，62℃30s，72℃1min；共28个循环；最后72℃延伸7min。
PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳检测，获得98bp的扩增条带(见图2)。
步骤4样本检测与判定根据被检测样品的抗锈病特异片段的扩增结果，对被检测样品的锈病抗性进行判定，其具体判定过程为所用样品共有22个；其中，将经过多年育种实践确定的感锈病品种“之豇282”定为阴性对照，编号为21；将抗锈病品种“南辰豆角2号”定为阳性对照，编号为22；另将该亲本组合的20个F2代统一进行了田间接种鉴定，病原菌为当年采集的锈菌(Uromyces vignae Barclay)夏孢子，经鉴定明确感病植株有10株，分别编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10；抗病植株有10株，分别编号为11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。
从基因组DNA提取结果看(图1)，得到的DNA质量完全可以满足特异片段的PCR扩增要求；接着用设计的特异引物对基因组DNA进行扩增；从图2中可以看出，21号阴性对照没有扩增产物，而22号阳性对照则扩增出98bp的特异片段；在所检测的20个F2代单株样品中，样品1，2，3，4，5，6，7，8，9，10均没有扩增出特异片段，而样品11，12，13，14，15，16，17，18，19，20均扩增出该特异片段。上述检测结果表明，阴性对照与编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的植株均没有扩增出98bp的特异片段，而阳性对照与编号为11，12，13，14，15，16，17，18，19，20的植株均扩增出该片段，这与田间接种鉴定结果完全符合，说明本发明所建立的检测方法能准确、快速的鉴定出豇豆样品对锈病的抗性能力。
本发明为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、灵敏、特异、成本低廉的检测豇豆锈病抗性的技术。
权利要求
1.一种豇豆锈病抗性的分子标记检测方法，其特征在于包括以下步骤1)、待检测豇豆叶片样品的采集取豇豆植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.2-0.3克，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；2)、阴性对照品种植株和阳性对照品种植株叶片样品的采集取豇豆顶部较为幼嫩的叶片，每份0.2-0.3克，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；3)、样品基因组DNA的提取采用常规的CTAB法或基因组提取试剂盒提取基因组DNA，TE溶解或双蒸水融解，现用或在-20℃冷冻保存；4)、根据已获得的和豇豆抗锈病基因紧密连锁的AFLP标记全序列设计一对引物，扩增片段长度为98bp，引物序列为引物I5’---TCAACAGTGTCAGACCAAAC---3’引物II5’---GTTGAAGATTGTGGAAAGCT---3’；5)、最佳扩增体系的建立利用正交试验，摸索建立和豇豆抗锈病基因连锁特异片段的最佳扩增体系；6)、样本检测与判定根据待检测样品和对照样品的特异片段的扩增结果，对被检测豇豆植株是否为抗性株进行判定。
全文摘要
本发明公开了一种豇豆锈病抗性的分子标记检测方法，属于蔬菜分子遗传育种技术领域。该方法包括待检测豇豆和阴性对照及阳性对照植株样品的采集；样品基因组DNA的提取；引物的设计；最佳扩增体系的建立；样本检测与判定等步骤。本发明具简便易行，快速、灵敏、特异性强，一般只需8个小时左右，成本低廉，检测一个样本低于1.5元，通过早期检测，可明显缩短豇豆抗锈病育种或市场种子种性鉴定的周期等特点。该方法可在豇豆抗锈病育种或市场种子种性鉴定中应用。
文档编号C12Q1/68GK1995392SQ20061015547
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者李国景, 朱祝军, 刘永华, 吴晓花, 汪宝根, 鲁忠富 申请人:浙江省农业科学院