人工重组选择复制型腺病毒及应用的利记博彩app

专利名称：人工重组选择复制型腺病毒及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属生物技术，涉及人工重组肿瘤特异性杀伤腺病毒(rsAd-MK-TNFa)，可在制备治疗特异性杀伤腺病毒药物中的应用。
背景技术：
近年来人口老龄化，环境污染加重，吸烟等不健康生活方式的日益增多，恶性肿瘤的发病率也逐年增加，而对恶性肿瘤的治疗效果却鲜有提高，恶性肿瘤已经成为威胁人类健康和导致死亡的首要疾病，因此如何有效提高恶性肿瘤的治愈率是目前肿瘤研究中亟待解决的重要问题。常规的治疗方法是手术、化疗、放疗，外科手术虽然可以清除可切除部位的肿瘤细胞，但对远处转移的治疗无能为力。而放疗、化疗手段对机体损伤较大，杀伤肿瘤细胞的特异性不强。在一定程度上破坏了机体的体内平衡，抑制了机体自身的免疫系统。缺乏对肿瘤细胞有效的特异性抑制是导致治疗失败的主要原因，为此必须积极寻找新的治疗手段。
肿瘤的生物治疗是通过生物工程技术，发现、发明新的疗法和药物，激发机体的防御功能，抑制或杀伤肿瘤细胞，并使机体的内环境保持稳定、平衡的治疗方法。生物治疗具有独特的优势，可以通过各种途径区分正常细胞和肿瘤细胞，并对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用，即治疗的靶向性，治疗方案可个体化，对机体损害小，在临床实验中效果显著，部分治疗方法在临床应用中已成为重要的肿瘤辅助治疗手段，但总体而言疗效仍不理想。目前生物治疗种类主要有基因治疗，免疫治疗，小分子靶向治疗和病毒靶向治疗。
病毒靶向肿瘤治疗是近年来逐渐兴起的肿瘤治疗方法，人们发现携带特定基因的病毒可作为特异性治疗肿瘤的“武器”来加以应用，这种经人工改造后能特异性地在肿瘤细胞中复制并表达治疗基因产物、破坏和杀死肿瘤细胞的病毒由于具有靶向性特点，而被认为是较有希望的生物治疗手段。利用肿瘤细胞的固有特性，通过病毒来识别并杀灭肿瘤细胞的方法与以往的肿瘤治疗不同，具有以下特点1.应用范围广，凡是具有相同或类似特征的肿瘤细胞都可以接受这种治疗；2.现阶段对肿瘤细胞的研究结果可及时应用于临床治疗，并可借助分子生物学方法使病毒带有肿瘤细胞的选择性；3.可通过病毒在肿瘤细胞中的复制繁殖，破坏肿瘤细胞。但是作为其携带基因常需具有主动攻击被感染肿瘤细胞作用的特点，以发挥其治疗作用。

发明内容
本发明提供肿瘤特异性杀伤腺病毒(rsAd-MK-TNFa)，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，通过插入肿瘤特异性启动子启动的具有细胞毒作用的外源基因TNFα，并缺失了部分病毒早期转录因子，其中中期因子启动子位于1363-1954；肿瘤坏死因子α(TNFα)序列位于2002-2688bp，可以表达具有SEQ D NO.2的TNFα氨基酸序列。
本发明的人工重组选择复制型腺病毒(肿瘤特异性杀伤腺病毒)，通过以下步骤实现从人类基因库扩增获得TNFα、MidKine基因，采用同源重组的方法插入到腺病毒基因组中，在Ad293细胞中扩增获得。具体方法是通过腺病毒载体携带肿瘤特异性启动子调控外源基因特定细胞内表达，即携带有Midkine启动子调控TNFα基因的人工重组腺病毒在表达Mikine的恶性肿瘤细胞中特异性地进行病毒复制和外源插入基因表达，从而在表达Mikine的恶性肿瘤细胞中，因受Midkine启动子控制而特异性地进行病毒复制和TNFα基因表达，从而杀死恶性肿瘤细胞的技术。
具体是(1)病毒早期转录区部分基因缺失，可选择性在肿瘤细胞中复制；(2)携带人肿瘤坏死因子α(TNFα)基因；(3)人肿瘤坏死因子α(TNFα)基因是以中期因子启动子启动。
通过人工基因重组技术获得的具有特异性杀伤肿瘤细胞的缺陷型腺病毒，由于在其早期转录系统中插入通过Mikine启动子启动表达TNFα基因，同时缺失了E1b区和E3区，使该重组病毒获得了肿瘤特异性复制、表达插入基因序列，从而杀伤肿瘤细胞的特性。由于病毒只能在P53功能异常的肿瘤细胞中复制，其次通过病毒介导的肿瘤细胞内特异性(病毒选择复制和肿瘤特异性启动子启动TNFα表达)TNFα表达，诱导受攻击肿瘤细胞凋亡，同时通过病毒的在肿瘤细胞中的复制提高在肿瘤区域内的TNFα的浓度，并结合病毒直接复制裂解肿瘤细胞，另外缺失了E3区的病毒可使受感染肿瘤细胞增强MHC-I类分子的表达，更容易受到机体免疫细胞的攻击，通过三者结合可进一步增强对肿瘤的综合治疗作用。避免TNFα全身应用的副作用，具有良好的应用前景。所构建的重组选择复制型腺病毒(rsAd-MK-TNFa)，其基因组序列见文件rsAd-MK-TNFa sequence.doc。
本发明的另一个目的是提供人工重组肿瘤特异性杀伤腺病毒在制备治疗特异性杀伤腺病毒药物中的应用。
本发明的有益之处是通过携带由肿瘤特异性启动字Midkine启动表达肿瘤坏死因子α基因的重组腺病毒在恶性肿瘤组织中特异性复制和表达TNFα，在肿瘤局部产生杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的作用，避免了肿瘤坏死因子全身应用的严重毒副作用。为恶性肿瘤生物治疗提供新的药物。


图1-1 rsAd-MK-TNFa对RKO细胞抑制作用的生长曲线图。
图1-2不同浓度的rsAd-MK-TNFa对RKO细胞抑制作用差别(第5天)。
图2-1 rsAd-MK-TNFa对smmc7721细胞抑制作用的生长曲线图。
图2-2不同浓度的rsAd-MK-TNFa对smmc7721细胞抑制作用差别(第5天)。
图3-1 rsAd-MK-TNFa作用3天对实体瘤和白血病细胞系的生长抑制作用。
图3-2 rsAd-MK-TNFa作用5天对实体瘤和白血病细胞系的生长抑制作用。
图3-3 rsAd-MK-TNFa对Bcap37的生长抑制作用。
具体实施例方式
实例一rsAd-MK-TNFa(ZUCI008)对RKO细胞(结肠癌细胞株)的杀伤作用选取5个病毒浓度分别是MOI＝0.02、0.2、2、20、200和空白对照，加入到细胞指数生长期的RKO细胞中，采用MTT的方法观察其对RKO细胞生长的作用，我们观察到病毒对肿瘤细胞的抑制作用存在时间效应，随着作用时间的延长其对肿瘤细胞的抑制作用增强(参见图1-1)。用药5天肿瘤细胞生长即出现明显受抑制，肿瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖性，且随浓度增高对细胞的抑制作用增强(参见图1-2)。
实例二rsAd-MK-TNFa对smmc7721细胞(肝癌细胞株)的杀伤作用选取5个病毒浓度分别是MOI＝0.02、0.2、2、20、200和空白对照，加入到细胞指数生长期的smmc7721细胞中，采用MTT的方法观察其对RKO细胞生长的作用，我们观察到病毒对肿瘤细胞的抑制作用存在时间效应，随着作用时间的延长其对肿瘤细胞的抑制作用增强(参见图2-1)。用药5天肿瘤细胞生长即出现明显受抑制，肿瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖性，且随浓度增高对细胞的抑制作用增强(参见图2-2)。
实例三rsAd-MK-TNFa对不同肿瘤细胞的抑制率观察从实施例一和实施例二的实验我们看到，在MOI＝0.02、0.2、2时rsAd-MK-TNFa对肿瘤细胞的抑制作用较弱，因此我们在本实验中选择MOI＝10、100、1000三个浓度梯度，采用MTT的方法观察rsAd-MK-TNFa对肿瘤细胞的抑制作用，由于在前面的生长曲线实验中我们发现rsAd-MK-TNFa对肿瘤细胞的作用在第3天以后开始出现，因此我们分别观察rsAd-MK-TNFa作用第3天和第5天结果，参见图3-1和图3-2。我们观察到rsAd-MK-TNFa对肿瘤细胞的存在一定的抑制作用，而且对不同肿瘤细胞的抑制作用存在很大的区别，在试验的实体瘤细胞系中对sw480的抑制作用最大，其次是Bcap37，而对白血病细胞系中对HL60的抑制作用最大，对KV812和Jurkit细胞系也存在很大的抑制作用，但是对K562细胞系即使在MOI＝1000时也几乎没有作用。另外抑制作用的强度rsAd-MK-TNFa作用浓度和时间存在一定的关系，在MOI＝100以上时，才出现较明显的抑制，而且对实体瘤细胞系在第5天才出现较强抑制，而对白血病细胞系在第3天时即可出现一定的抑制作用。rsAd-MK-TNFa在MOI＝10、100、1000时对Bcap37细胞的作用显微镜下观察参见图3-3。
本发明设计的序列<110>浙江大学<120>人工重组选择复制型腺病毒及应用<160>2<210>1<211>34649<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工重组选择复制型腺病毒全长核酸序列<400>11 ttataagcat aagacggact acggccatgc cggcgtgacc gtaaaaaaac tggtcaccgt
61 gattaaaaag caccaccgac agctcctcgg tcatgtccgg agtcataatg taagactcgg121 taaacacatc aggttgattc atcggtcagt gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga181 atacataccc gcaggcgtag agacaacatt acagccccca taggaggtat aacaaaatta241 ataggagaga aaaacacata aacacctgaa aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc301 tcccgctcca gaacaacata cagcgcttca cagcggcagc ctaacagtca gccttaccag361 taaaaaagaa aacctattaa aaaaacacca ctcgacacgg caccagctca atcagtcaca421 gtgtaaaaaa gggccaagtg cagagcgagt atatatagga ctaaaaaatg acgtaacggt481 taaagtccac aaaaaacacc cagaaaaccg cacgcgaacc tacgcccaga aacgaaagcc541 aaaaaaccca caacttcctc aaatcgtcac ttccgttttc ccacgttacg taacttccca601 ttttaagaaa actacaattc ccaacacata caagttactc cgccctaaaa cctacgtcac661 ccgccccgtt cccacgcccc gcgccacgtc acaaactcca ccccctcatt atcatattgg721 cttcaatcca aaataaggta tattattgat gatnnnttaa ttaaggatcc nnncggtgtg781 aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc841 tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg901 cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag961 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc1021 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag1081 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga1141 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc1201 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgttcgctccaag ctgggctgtg1261 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt1321 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca1381 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca1441 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag1501 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca1561 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg1621 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa1681 aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta1741 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag1801 cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga1861 tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac1921 cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc
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权利要求
1.人工重组选择复制型腺病毒，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，其特征是通过插入肿瘤特异性启动子启动的具有细胞毒作用的外源基因TNFα，并缺失了部分病毒早期转录因子，其中中期因子启动子位于1363-1954；肿瘤坏死因子α序列位于2002-2688bp，表达具有SEQ ID NO.2的TNFα氨基酸序列，通过以下步骤实现从人类基因库扩增获得TNFα、MidKine基因，采用同源重组的方法插入到腺病毒基因组中，在Ad293细胞中扩增获得，具体方法是通过腺病毒载体携带肿瘤特异性启动子调控外源基因特定细胞内表达，即携带有Midkine启动子调控TNFα基因的人工重组腺病毒在表达Mikine的恶性肿瘤细胞中特异性地进行病毒复制和外源插入基因表达，从而在表达Mikine的恶性肿瘤细胞中，因受Midkine启动子控制而特异性地进行病毒复制和TNFα基因表达。
2.根据权利要求1所述的人工重组选择复制型腺病毒，其特征是具体步骤为(1)病毒早期转录区缺失了E1b区和E3区部分基因，可选择性在肿瘤细胞中复制；(2)携带人肿瘤坏死因子α基因；(3)人肿瘤坏死因子α基因是以中期因子启动子启动。
3.根据权利要求1所述的人工重组选择复制型腺病毒在制备治疗特异性杀伤腺病毒药物中的应用。
全文摘要
人工重组选择复制型腺病毒，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，通过病毒选择性感染肿瘤细胞并在其中复制，同时携带Midkine启动的TNFα基因，可在Midkine高表达的肿瘤细胞产生TNFα，引起肿瘤细胞凋亡。病毒的复制、所表达的TNFα和因病毒感染激发机体抗病毒细胞免疫均可对特定肿瘤细胞产生杀伤作用，这种杀伤作用是肿瘤特异性，对人体正常细胞毒性小，无骨髓抑制和免疫抑制作用。发明对Midkine不表达、但对腺病毒敏感的恶性肿瘤也可通过腺病毒的复制产生治疗效果，可在制备治疗特异性杀伤腺病毒药物中的应用，为生物治疗肿瘤提供新方法。
文档编号C12N15/28GK101016537SQ20061015535
公开日2007年8月15日 申请日期2006年12月20日 优先权日2006年12月20日
发明者陆巍, 郑树 申请人:浙江大学