专利名称：作为毒性效应标志的脂肪酸结合蛋白4的利记博彩app
基因表达模式控制着细胞发育和生理，并且被包括疾病和对毒性刺激应答的病理情况所影响。鉴于此，很明显在临床前安全性实验中对基因和蛋白质表达的研究可以帮助毒物学家更好的了解化学品接触对哺乳动物生理的影响。一方面，对接触毒物后某些受调节基因和/或蛋白质的鉴定使得可以鉴定出可替代当前所用标志的新的预测性和更加敏感性的生物标志。关于特定毒性机理的标志基因方面的知识与飞速增长的对人类基因组结构的理解共同构成了鉴定新生物标志的基础。这些标志可用于预测有毒倾向、区分物种-物种应答以及鉴定反应者群体和非反应者群体。基因表达分析是检测对于特定毒性机制的新的、特异性和敏感性标志的强有力的工具(Fielden，M.R.和Zacharewski，T.R.(2001).Challenges and limitationsof gene expression profiling in mechanistic and predictive toxicology.Toxicol Sci 60，6-10)。这些标志应该会提供对于入选早期动物研究的另外的终点，从而使鉴定所开发化合物的毒性潜能所需的时间、费用和动物数量最低。
本发明是基于在小鼠中具有意外毒性的PPARα/γ共激动剂。其主要靶器官是肝脏，在肝脏中显示出剂量依赖性的凝固坏死。此外，化合物还会引起心肌和骨骼肌以及褐色脂肪的退化。对肝脏的基因表达分析显示了对脂解的影响，包括对脂肪酸结合蛋白4的强烈诱导，而其在对照中则检测不到。
脂肪酸结合蛋白(FABP)是小的、高度保守的胞质蛋白质家族，其结合长链脂肪酸及其他疏水配体上。据认为，FABP的作用包括脂肪酸摄取、转运和代谢。FABP4通常在肝脏细胞中不表达但在脂肪细胞中表达以增强脂解。
本发明提供了作为鉴定候选化合物的至少一种毒性效应的生物标志的FABP4。优选地，至少一种毒性效应为肝脏毒性效应。在优选的实施方案中，预测的肝脏毒性为肝脏坏死。
此外，本发明提供了FABP4作为鉴定候选化合物的至少一种毒性效应的生物标志的用途。优选地，毒性效应为肝脏毒性效应。更优选地，毒性效应为肝脏坏死。
本发明还提供了预测候选化合物的至少一种毒性效应的方法，其包括a)检测接触化合物的组织或细胞样品中FABP4基因的表达水平；b)将基因表达水平与其在对照组织或细胞样品中的表达水平相比较，其中基因的差异表达预示着该化合物存在至少一种毒性效应。
优选地，基因的差异表达为表达增加。更优选地，与对照样品相比，接触化合物的组织或细胞样品中FABP4基因表达的增加预示着该化合物存在至少一种毒性效应。对照样品是未接触候选化合物的样品。
术语“接触候选化合物的组织或细胞样品”是指用候选化合物处理的组织或细胞样品或者样品所来源的动物。
在此用到的“毒性效应”是指化合物的存在对于活的生物体、器官系统、个体器官、组织、细胞或亚细胞单位的有毒效应。毒性效应可以是生理的或身体的表现症状或紊乱，如细胞或器官的坏死。
在此用到的“候选化合物”是指应测试其毒性的任何化合物。
本领域的技术人员熟悉测定RNA或蛋白质水平的不同方法。术语“水平”指的是RNA或蛋白质或其片段在个体或从个体中得到的样品中的量或浓度。测定FABP4的RNA或蛋白质水平也包括测定RNA或蛋白质的片段或变体。
测定FABP4的RNA水平的方法包括例如RNA印迹法、通过光密度测定法对条带定量。优选的方法包括微列阵分析(基因芯片)、点渍法或差异定量PCR法。更优选地，微列阵分析用于测定FABP4基因的表达水平。
测定FABP4蛋白质水平的方法包括例如沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电产生的化学发光)、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心酶免疫测定、电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)、解离-增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)、闪烁亲近测定法(SPA)、浊度测定法、比浊法、乳胶增强浊度测定法或比浊法、固相免疫测定、以及质谱分析法如SELDI-TOF、MALDI-TOF、或毛细管电泳-质谱分析法(CEMS)。
本领域已知的其他方法(如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法)可以单独应用或与标记或其他检测方法组合应用。
FABP4可以作为标志在任何哺乳动物中如人、大鼠、小鼠、或猴中应用(人FABP4SEQ.ID NO1，大鼠FABP4SEQ.ID NO2，小鼠FABP4SEQ.ID NO3)。优选地，FABP4作为标志在小鼠和大鼠中应用。
本文中的RNA“变体”指与所述RNA基本相似的核苷酸。术语“基本相似”是本领域的技术人员所完全理解的。特别地，变体可以是与各自种群中最普遍的RNA同种型的核苷酸序列相比显示具有核苷酸变换的同种型或等位基因。优选地，此种基本相似的RNA与最普遍的RNA同种型的序列相似性为至少80％，优选地为至少85％，更优选地为至少90％，最优选地为至少95％。基本相似物还可为仍然可被诊断方法和直接针对各自全长RNA的配体所识别的降解产物，例如核酸酶降解产物。
本文中的蛋白质“变体”指与所述蛋白质基本相似的蛋白质或多肽。术语“基本相似”是本领域的技术人员所完全理解的。特别地，变体可以是与各自种群中最普遍的多肽同种型的氨基酸序列相比表现出具有氨基酸变换的同种型或等位基因。优选地，此种基本相似的多肽与最普遍的蛋白质或多肽同种型的序列相似性为至少80％，优选地为至少85％，更优选地为至少90％，最优选地为至少95％。基本相似物还可为仍然可被诊断方法和直接针对各自全长蛋白质或多肽的配体所识别的降解产物，例如蛋白水解降解产物。术语“变体”也指剪接变体。
术语“变体”也指翻译后修饰的蛋白质，如糖基化的蛋白质。“变体”还可以是在样品收集后通过例如将标记、特别是放射性标记或荧光标记共价或非共价连接至蛋白质而已经被修饰的多肽。
现已概括描述了本发明，通过参考特定实施例并结合附图可以更好地理解本发明，除非另外明确说明，本文包括的实施例仅用于解释说明的目的并且不旨在限制本发明。
附图简述
图1显示了用Affymetrix微列阵(MEA230 plus)测定的、在用不同剂量PPARα/γ共激动剂3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸(已知以测试量向动物重复施用后引起肝脏坏死)处理的CD1和C57B1/6小鼠的肝脏FABP4(SEQ.ID No3)表达水平的图示。
1对照(0mg/kg)，20.2mg/kg；33mg/kgA初始处理24小时后B初始处理10天后(每天施用)实施例除非另外说明，实施例中提到的商业可得试剂根据产品说明书使用。
实施例1动物和剂量CD-1小鼠(Charles River Laboratories，英国)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理1天；剂量为0、0.2和3mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理10天；剂量为0、0.2和3mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理14天；剂量为0、0.6和15mg/kgC57BL6小鼠(RCC Ltd，Füllinsdorf)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理1天；剂量为0、0.2和3mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理10天；剂量为0、0.2和3mg/kgWistar大鼠(RCC Ltd，Füllinsdorf)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理14天；剂量为0、0.3和1.2mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理28天；剂量为0、0.1、0.5和2.5mg/kg食蟹猴(Macaca fascicularis)●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理28天；剂量为0、0.015、0.09和0.31mg/kg●用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸处理16周；剂量为0、0.015、0.1、0.3和1mg/kg将3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸溶解于20％的丙二醇/磷酸盐缓冲液(pH8)。向所处理动物口服(p.o.)给药。
小鼠FABP4(SEQ.ID NO3)的表达水平用Affymetrix微列阵(MEA230 plus，探针集1417023_a_at，1424155_at，1425809_at，1451263_a_at)或者Applied Biosystems Assays on Demand(分析IDMm00445880_ml)测定。大鼠FABP4(SEQ.ID NO2)的表达水平用Affymetrix微列阵(RGU34A，探针集rc_AI169612_at)或者Applied Biosystems Assays onDemand(分析IDRn00670361_ml)测定。未测定猴FABP4表达水平。
结果在用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸(PPARα，γ-共激动剂)处理的小鼠中发现，在≥大约50倍的所预测的人接触量的剂量下存在剂量依赖性的严重毒性。主要的靶器官为肝脏，显示出剂量依赖性的凝固坏死。此外，化合物还会引起心肌和骨骼肌以及褐色脂肪的退化。在≥0.6mg/kg/天时出现小鼠死亡。
在大鼠和猴的组织(肝脏、心脏、骨骼肌、褐色脂肪)中，在类似接触水平下没有观察到这种毒性。
比较大鼠和小鼠在施用3-{1-[2-(2-氯-苯基)-5-甲基-唑-4-基甲基]-1H-吲哚-5-基}-2-乙氧基-丙酸后肝脏中的基因表达。比较显示，小鼠中脂肪酸结合蛋白4的表达被强烈诱导(见图1)。在大鼠中FABP4未被诱导。
在大鼠中引起肝脏毒性的其他化合物(吲哚美辛(见实施例2)、脂多糖(LPS)、四氯化碳(CCl4))在大鼠肝脏组织中诱导FABP4表达。
实施例2动物和剂量Wistar大鼠(RCC Ltd，Füllinsdorf)●用吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸，SigmaI7378)处理，一次剂量p.o(口服)；剂量为0、2、10和20mg/kg●用吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸，SigmaI7378)处理7天；剂量为0、2和5mg/kg/天吲哚美辛溶解在玉米油中。向所处理动物口服(p.o.)给药。
大鼠的FABP4(SEQ.ID NO2)的表达水平用Affymetrix微列阵(RGU34A，探针集rc_AI169612_at)或Applied Biosystems Assays onDemand(分析IDRn00670361_ml)测定。
结果在吲哚美辛处理的肝脏中观察到了剂量依赖模式的微小的组织病理学改变(肝细胞过度生长)。在一次施用10或20mg/kg或者连续7天多次施用5mg/kg/天后，在实验处理的动物中肝细胞糖原沉积减少。这些结果伴随着预示肝脏改变的不同临床生物化学参数的改变，尤其是在一次剂量施用吲哚美辛10和20mg/kg剂量组中和重复处理的5mg/kg/天剂量组中。
施用吲哚美辛后肝脏中的基因表达用Affymetrix基因阵列测定，并且在用10或20mg/kg吲哚美辛一次剂量处理24小时后的大鼠和连续7天用5mg/kg/天吲哚美辛处理的大鼠肝脏中观察到了对脂肪酸结合蛋白4表达的强烈诱导(见表1)。对于诱导量最高的处理组(20mg/kg处理24小时和5mg/kg/天处理7天)，FABP4 mRNA的诱导用PCR证实(见表1)。
表1一次或连续7天用不同剂量吲哚美辛处理的WISTAR大鼠肝脏中大鼠FABP4(SEQ.ID NO2)的平均相对表达，用Affymetrix微列阵(RG U34A)或PCR(Applied Biosystems Assays on Demand；分析IDRn00670361_ml)测定。所给出的表达结果是相对于各个时间匹配的仅用载体处理对照动物中表达的结果(n.d.＝未测定)。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>作为毒性效应标志的FABP4<130>23334<160>3<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>619<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1tgcagcttcc ttctcacctt gaagaataat cctagaaaac tcacaaaatg tgtgatgctt60ttgtaggtac ctggaaactt gtctccagtg aaaactttga tgattatatg aaagaagtag 120gagtgggctt tgccaccagg aaagtggctg gcatggccaa acctaacatg atcatcagtg 180tgaatgggga tgtgatcacc attaaatctg aaagtacctt taaaaatact gagatttcct 240tcatactggg ccaggaattt gacgaagtca ctgcagatga caggaaagtc aagagcacca 300taaccttaga tgggggtgtc ctggtacatg tgcagaaatg ggatggaaaa tcaaccacca 360taaagagaaa acgagaggat gataaactgg tggtggaatg cgtcatgaaa ggcgtcactt 420ccacgagagt ttatgagaga gcataagcca agggacgttg acctggactg aagttcgcat 480tgaactctac aacattctgt gggatatatt gttcaaaaag atattgttgt tttccctgat 540ttagcaagca agtaattttc tcccaagctg attttattca atatggttac gttggttaaa 600taactttttt tagatttag619<210>2<211>600<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
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1.FABP4的用途，其作为确定候选化合物的至少一种毒性效应的生物标志。
2.根据权利要求1所述的用途，其中毒性效应为肝脏毒性效应。
3.预测候选化合物的至少一种毒性效应的方法，其包括a)检测接触化合物的组织或细胞样品中FABP4基因的表达水平；b)将基因表达水平与其在对照组织或细胞样品中的表达水平相比较，其中基因的差异表达预示着该化合物存在至少一种毒性效应。
4.根据权利要求3所述的方法，其中与对照相比，接触化合物的组织或细胞样品中FABP4基因的表达更高则预示着该化合物存在至少一种毒性效应。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中至少一种毒性效应为肝脏毒性效应。
全文摘要
本发明涉及作为确定目的化合物的至少一种毒性效应标志的FABP4。
文档编号C12Q1/68GK1936584SQ20061013931
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月22日 优先权日2005年9月23日
发明者F·伯斯, L·苏特尔－迪克 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司