专利名称：一种快速检测哈维氏弧菌的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的试剂盒，进一步涉及使用哈维氏弧菌快速检测的试剂盒快速检测哈维氏弧菌的方法。
背景技术：
哈维氏弧菌(V.harveyi)是一种广布于世界各地的靠海河道、海湾和 海岸线区域以及海产品中的发光弧菌。此菌是一种条件致病菌，在--定条 件下可暴发流行。近年来，随着养殖环境的日益恶化，我国沿海地区因哈 维氏弧菌引起海产品发病或大面积死亡的报道日益增多。目前已知哈维氏 弧菌可感染舻鱼、大黄鱼、斑节对虫下、墨吉对虾、石斑鱼等多类水产品， 给水产养殖业带来较大的危害。哈维氏弧菌引起的细菌性疾病具有暴发 快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此 对哈维氏弧菌病应以预防为主，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对 弧菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生理生化 '姿定法、兔疫学方法(主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法(ELISA))、 免疫电镜技术、分子生物学方法(主要有分子杂交技术、限制性内切酶长 度多态夂RELP))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。 有些所需的材枓制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强， 因此广大医务人员和水产养殖业主掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。
早期快速检测哈维氏弧菌，是目前预防此类弧蔺病暴发流行的主要措 施和水产经济动物养殖业减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性 好又灵敏度高的检测试剂盒及其检测方法是广大医务工作者和水产养殖 番急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR技术)，是上 世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有
快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。
发明内容
本发明的目的是利用哈维氏弧菌耐热直接溶血毒素(gyr5)基因保 守序列设计的一对引物，建立哈维氏弧菌PCR反应体系，在此基础上优 化和设计，提供一种快速检测哈维氏弧菌的试剂盒及检测方法。该试剂盒 可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高可用于海洋水 产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，也还可以用于海洋水体环境监 测，避兔病菌传播流行，具有很高的实用价值。
本发明的主要原理为试剂A和B将样品中的细菌进行裂解,释放出 细菌DN入试剂C和D为多聚酶链式反应技术试剂，通过试剂D中所含 的哈维氏弧菌特异DNA片断引物和试剂C中的热聚合酶等成分，对样品 释放出的DNA进行特异性的扩增，由于我们设计的引物为哈维氏弧菌所 特有,因此，如果样品中含有哈维氏弧菌，那么它的DNA的特异片断在经 过扩增后，浓度将达到1()Smol(.克分子)以上，这样，在电泳和溴化乙锭染色 后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有哈维氏弧 菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。
为实现上述目的本发明采取的技术方案是:该快速检测哈维氏弧菌的 试剂盒，由如下试剂组成
(a) DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B,
试剂A:含有NaCl 0. 1-0. 3M、 pH8. 0的三羟基甲基氨基甲烷 丄i00inM、 pH8. 0的乙二胺四乙酸0. 1-10mM和V/V浓度为0-20%的曲 拉通X-100;
试剂B:含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8. 0、浓度为.1-lOOmM 的三羟基甲基氨基甲烷；
(b) 聚合酶链式反应试剂:含有反应预混试剂C和反应引物试剂D, 试剂。含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2. 5-5. 0ul、 0. 5-2. 5个单位和18-35. 5ul;
试剂D:含有特异引物对VhF和VhR、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl2,含量分别为0. 2-1MM和0. 2-1MM、 20-200MM及0. 5-.tOmM: (c.)电泳和显色试剂,含有试剂E和试剂F，
试剂E:为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和 乙二胺四乙酸,浓度分别为0. 04M和0. 001M;
试剂F:含W/V为0. 8-2%的琼脂糖和0. 5-2Cmg/ml溴化乙锭；
试剂D中的特异引物对VhF和VhK为进行PCR反应的特异引物和 必需成分，VhF特指5'-TCTAACTATCCACCGCGG; VhR特指5'-AGC AATGCC ATCTTCACGTTC 。
每管反应试剂的最佳组成为试剂C: iOxPCK Buf f er， 0.5plTaqE ( 浓度 5U/I4), 35. SylddHsO, 试剂 D:4. 0WdNTP(2. 5mM each)， 3. 0| tlMgCl2(25mM),10pM VhF, 10pM VhR',
试剂A为DNA提取缓冲液，为DNA的提取提供适宜的缓冲环境并抑 制DNA的降解;试剂B为细胞裂解试剂，使细菌裂解并释放出DNA;试 剂C为PCR反应预混试剂，为PCR反应试剂的主要成分之 一，试剂D为 PCR引物试剂，也是PCR反应的主要成分，包含有本试剂盒最为关键的 特异引物VhF和VhR。试剂E为50倍TAE(电泳缓冲液)，为样品电泳提 供合适的pH值、离子强度等的缓冲体系;试剂F为电泳介质琼脂糖i 显色剂溴化乙锭。
使用快速检测哈维氏弧菌的试剂盒快速检测哈维氏弧菌的方法依 次包括下列步骤
(a)样品处理取0. 1-0. 5克样品，用100-400W试剂A悬浮样品，并将样 品充分混匀；10000-l'2000g离心'2-5分钟，弃上清；
(b) DNA提取用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-试剂B 混勾，室温放置2分钟以上,再在沸水浴中保温1-IO分钟,使细胞完全破 裂，释放出DNA; 10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2 倍即的无水乙醇沉淀DNA;室温放置5-10分钟， 10000-12000g离心3-8分钟;去上清，75%乙醇洗涤一次,让乙醇彻底挥 发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液；
(c) PCK扩增以0. 5-1M1提取的DNA作为聚合酶链式反应扩增的模板；取
21-42ul试剂C与4-试剂D混合;在热循环仪上对提取的DNA模板 进行扩增，通过94'C-98'C解链2-5分钟；然后用93-95'C变性30秒-1分 钟，60-64'C复性30秒-1分钟，72'C延伸30秒-1.5分钟，如此循环30-35次， 最后在72t:保温8-10分钟，将哈维氏弧菌的特异片断增加到108mol以
上；
(d)电泳和显色检测取5-10W扩增后的样品，与2-6WV/V为0. 25%的溴 酚蓝混合,W/V'为0. 8-1. '2%的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否 有一条363核苷自的条带，如果有一条363核苷酸对的条带，说明样品 有哈维氏弧菌感染或污染,反之则没有。
本发明的优点和积极效果
基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术(聚合酶链式反应枝 术)，相对其它的弧菌病原检测技术和其它的病原检测技术而言,本方法有 几个显著的优点:首先，该方法检测十分快速,3-4小时即可得知检测结果, 而其它方法则至少需要3天或一个星期以上;其次,该方法检测灵敏度极 高，检测下限低至10个左右的细菌,其它方法必须要有一定时间的纯培养 增殖达到105后才能进行检测。本发明可用于检测海洋水产动物各时期养 殖过程中的受哈维氏弧菌感染的情况，也还可以监测海洋水体环境中的病 原哈维氏弧菌，还可以检测各种水产品是否受哈维氏弧菌污染u
具体实施例方式
下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
实施例1:
按以下配方制作快速检测哈维氏弧菌的试剂盒 试剂A: 0. 1M NaCl, 10mM Tris. Cl (pH8. 0), 1mM EDTA(pH8. 0) ， 5%Tri ton X-100 ;
试剂B: 10nig/ml溶菌酶，10mM Tris. Cl(pH8. 0);
试剂C: 5. 10xPCR Buffer, 0. 5WTaqE (浓度5U/Ml), :35. 54函20', 试剂D:4. 0Pld證(2. 5mM each), 3. 0,gCl2 (25mM〉, 10pM VhF， 10pM VhK ;
试剂E: 50x TAE ;
试剂F:琼脂糖(1%)+溴化乙锭(0.5化/ml)。
按照以下程序进行操作
1.样品处理和DNA的提取:取虾组织约0. i-0.5克，在样品中加入 40014试剂A,灭菌牙签捣碎，l'2000g离心2分钟，弃上清，用试剂A 和试剂B重新悬浮沉淀,混匀。室温放置5分钟，10(TC水浴5分钟， 冷却至室温。12000g离心10分钟，取上清,加入800H1无水乙醇,室温放 置5分钟，彻底去上清，75%乙醇洗涤一次,让乙醇挥发,将沉淀溶于30fii 灭菌双蒸水，即为DNA提取液。
2. 哈维氏弧菌的特异片断扩增
在 一管试剂C中加入1WDNA提取瓶再加入试剂1)， 10000g离心 30秒，在PCR热循环反应仪上进行如下反应
94°C加热变性4分钟；然后在95'C解链1分钟,62'C复性45秒,72°C延 伸30秒，共循环35次；在72'C保温8分钟后停止反应。
3. 电泳和显色检测反应结束后，取5-反应液，与V/V为 ':).25%溴酚蓝混合,用W/V为1%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下检测，如果有- 条363核苷酸对的条带，说明样品有哈维氏弧菌感染或污染；反之则没有。
实施例2:
按以下配方制作快速检测哈维氏弧菌的试剂盒
试剂A: [). 3M NaCl, 10mM Tris. Cl (pH8. 0)， 1mMEDTA(pH8. 0), 5%'rrito" X-100 ;
试剂B: 5mg/ml溶菌酶，lOraM Tris. Cl (pH8. 0):
试剂C:丄5"1 10xPCK Buffer, 0. 25WTaqE (浓度5U/H] )， 35. 5口副20
试剂D: 2. 0,NTP(2. 5mM each), l. 5WMg(:U ('25mM)，
l()pM VhF， 10pM VhR :
试剂E: 50 x TAE :
试剂F:琼脂糖(1.2%)+溴化乙锭(0.8Pg/ml)。
按照以下程序进行操作
1.样品处理和DNA的提取:取鱼组织约0.1-0.5克,在样品中加入200W试剂A,灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清,用试剂A 和试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，IO(TC水浴5分钟， 冷却至室温。12000g离心10分钟，取上清，加入400W无水乙醇，室温放 置5分钟,彻底去上清，75%乙醇洗涤一次,让乙醇挥发，将沉淀溶于 灭菌双蒸水，即为DNA提取液。
2.哈维氏弧菌的特异片断扩增
在一管试剂C中加入miDNA提取瓶再加入试剂1)， lOOOOg离心 30秒，在PCR热循环反应仪上进行如下反应
94。C加热变性3分钟；然后在95'C解链45秒,62r复性30秒，72°C 延伸30秒，共循环30次；在7'2。C保温8分钟后停止反应。
3。电泳和显色检测反应结束后，取5-10m反应液，与441 V/'V为 0. '25%溴酚蓝混合,用W/V为L 2%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下检测，如果有 -条兆3核苷酸对的条带,说明样品有哈维氏弧菌感染或污染；反之则没 有。
权利要求
1.一种快速检测哈维氏弧菌的试剂盒，由如下试剂组成(a)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，试剂A含有NaCl0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；试剂B含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；(b)聚合酶链式反应试剂含反应预混试剂C和反应引物试剂D，试剂C含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl试剂D含有特异引物对VhF和VhR、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl2，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM(c)电泳和显色试剂，含有试剂E和试剂F，试剂E为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M试剂F含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙锭VhF特指5′-TCTAACTATCCACCGCGG；VhR特指5′-AGCAATGCCATCTTCACGTTC。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测哈维氏弧菌的试剂盒，其特征是每 智'反应试剂的配方为5. 0M110倍聚合酶链式反应缓冲液,2. 5单位热聚 合酶，35. 5W灭菌双蒸水4.5 mMdJVTP， 3. Opl 25mMMgCU lOpM Vhf, ()pirf VM。
3. —种使用权利要求1所述的试剂盒快速检测哈维氏弧菌的方法，依次按 下列歩骤(1)按照下列配方配制试剂 试剂A:含有NaCl 0. 1-0. 3M、 pH8. 0的三羟基甲基氨基甲烷i-lOOmM、pH8. 0的乙二胺四乙酸0. l-10mM和V/V浓度为0-20%的曲拉通X-100: 试剂B:含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8. 0、浓度为1-lOOmM的三羟基甲基氨基甲烷；试剂C:含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水,含 量分别为2. 5-5. 0M1、 0. 5-2. 5个单位和18-35. 5Hl; 试剂D:含有特异引物对VhF5'-TCTAACTATCCACCGCGG和VhR 5'-AGCAATGCCATCTTCACGTTC、 dNTP (四种脱氧核苷酸的混合物) 及MgCU含量分别为0. 2-l.MM和0. 2-1MM、 20-200141及0. 5-lOmM; 试剂E:为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0. 04M和0. 001M, 试剂F:含W/V为0. 8-2%的琼脂糖和0. 5-2C^g/ml溴化乙锭、 (2)按照下列步骤依次进行检测、a)样品处理:取0. 1-0. 5克样品，用试剂A悬浮样品，并将样 品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；(b) DNA提取用100-300W试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-IO(KI试剂B 混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破 裂，释放出DNA; 10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2 倍即240-80CHA1的无水乙醇沉淀DNA;室温放置5-10分钟， 10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75%乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥 发，将沉淀溶于10-50Hi灭菌双蒸水中，即为DNA提取液；":)聚合酶链式反应扩增以O. 5-114提取的DNA作为聚合酶链式反应扩增 的模板;取21-试剂C与4-试剂D混合;在热循环仪上对提取的 DNA模板进行扩增,通过94'C-98t:解链2-5分钟；然后用93-95'C变性 30秒-1分钟,60-64'C复性30秒-1分钟，72'C延伸30秒-L5分钟.如此循 环30-35 欠最后在72'C保温8-10分钟,将哈维氏弧菌的特异片断增加到 108mol以上；(d)电泳和显色检测:取5-10W扩增后的样品，与2-6WV/V为0. 25%的溴 酚蓝混合,W/V为0. 8-1. 2%的琼脂糖电泳和显色,在紫外光下检测是否 有一条363核苷酸对的条带,如果有一条363核苷酸对的条带,说明样品 有哈维氏弧菌感染或污染，反之则没有。
全文摘要
本发明提供一种快速检测哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)的试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以哈维氏弧菌耐热直接溶血毒素(gyrB)基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对海洋水产病原菌—哈维氏弧菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于水产动物各时期养殖过程中的哈维氏弧菌跟踪检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK101200756SQ20061012427
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日
发明者周银环, 孙成波 申请人:广东海洋大学