专利名称：副溶血性弧菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本文涉及一种微生物显色培养基、检测试剂盒及检测方法，尤其涉及副溶血性弧菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于食品微生物安全监测领域。
背景技术：
“民以食为天”，食品是人类赖以生存的物质基础，食品安全是关系人类健康和社会发展的重大问题。近年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生，尤其以沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等引起的食源性疾病最为突出。据统计，发达国家每年约有1/3的人患食源性疾病，美国每年约有7600万例食源性疾病患者，食源性疾病已成为国内外普遍关心的问题。
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称VP)是人类常见的重要食源性致病菌之一，广泛存在于世界各国的沿海地区，是一种嗜盐性细菌。消费者多因食用了污染此菌的海产品如鱼、虾、贝、蟹等引起食物中毒。由副溶血性弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占的比例非常高，仅次于大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌。我国沿海地区每年都有副溶血性弧菌食物中毒的报道，中毒症状有腹泻、水样便、腹部痉挛、恶心、呕吐等，给人类健康造成很大威胁，同时也给我国的经济和对外贸易带来很大的负面影响。
为有效控制病原的发生和扩散，准确及时的检测手段是预防和控制副溶血性弧菌传播的关键。目前，副溶血性弧菌的检测方法很多，传统的检测方法需要分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等多个步骤，检测周期长，整个过程大约4-7d，且操作复杂，已不能满足食品中致病菌快速检测的现实需要，而且当有溶藻弧菌、霍乱弧菌等其他杂菌存在时会影响副溶血性弧菌在传统硫代硫酸钠-柠檬酸钠-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS)平板上检出。近年来，聚合酶链反应(PCR)、免疫学等方法的应用，使副溶血性弧菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术也存在一定缺陷，如技术要求较高，设备操作复杂，需要专业的技术人员进行操作，以及检测费用昂贵等。PCR方法需要先进行细菌富集，不能区分活菌和死菌，容易产生假阳性；免疫学方法还需要制备高纯度的抗体，因此这些技术很难满足企业和政府监管部门对大批食品样本检测需要。
目前法国科玛嘉公司已开发出副溶血性弧菌的显色培养基，但是价格昂贵，配套产品和试剂需要进口，检测成本很高，因此，国内一些基层检测机构很少采用。
发明内容本发明旨在提供一种选择性高、检测周期短、成本低、可操作性强，适用于处理大通量样本的副溶血性弧菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法。
所述的副溶血性弧菌显色培养基，其配方为蛋白胨10～15g、酵母粉3～5g、NaCl 9～11g、蔗糖类18～20g、单糖0.11～0.13g、柠檬酸钠9～11g、硫代硫酸钠9～11g、胆盐5～8g、混合显色底物Y-glucoside 0.05～0.95g、琼脂12～15g、NaCO31～1.5g。
上述显色培养基优选的配方为蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖类20g、单糖0.11g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆盐8g、混合显色底物Y-glucoside 0.35g、琼脂12g、NaCO31g。
所述的副溶血性弧菌检测试剂盒，其组成为上述副溶血性弧菌显色培养基、增菌液A和B。
其中，增菌液A为灭菌处理的胰酪胨液体培养基(TSB)；
增菌液B为高压灭菌的氯化钠多粘菌素B肉汤(3.5％NaCL PolyB)。
所述的副溶血性弧菌检测方法，其具体步骤为(1)制备显色平板每1000mL水中加入77～98g显色培养基干粉，混合均匀后煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；(2)一步增菌(非选择性增菌)将样品置于增菌液A中，混合均匀后37℃培养6～8h；(3)二步增菌(选择性增菌)取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均匀后37℃培养15～17h；(4)接种培养将二步增菌液接种显色平板上，37℃培养18～24h；(5)结果分析若显色平板上出现光滑、略凸起、直径2-3mm、边缘整齐的紫色菌落，说明该样品存在副溶血性弧菌。
本发明针对现有技术中的不足，从生物化学的角度出发，利用细菌特异性酶对其进行快速检测。首先，在分析副溶血性弧菌特异性生化反应的基础上，筛选出细菌特异性酶，然后通过在分离培养基上加入细菌特异性酶的显色底物，研制出显色培养基，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴定，同时结合高效的样本前处理技术，建立特异性显色生化检测方法，并开发配套的试剂盒，用于副溶血性弧菌的快速诊断和监控，可大大节省检测成本和时间，具有更广泛的应用前景。
本发明通过筛选副溶血性弧菌特异性酶及显色底物，开发了副溶血性弧菌的显色培养基，克服了已有显色培养基价格昂贵和传统培养基选择性差等缺点；并通过对比各种标准方法的样本处理技术，建立了一套系统的副溶血性弧菌显色生化快速检测方法，提高了检测效率；所建立的副溶血性弧菌显色生化快速检测方法和试剂盒，可对食品和环境中副溶血性弧菌进行全面、系统、准确的检测和鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明所述的试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏高，周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生、环境监测等领域。
具体实施方式实施例1本发明所述的副溶血性弧菌显色培养基特异性的验证1、副溶血性弧菌显色培养基的配制取蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖类20g、单糖0.11g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆盐8g、混合显色底物Y-glucoside(美国sigma公司)0.35g、琼脂12g、NaCO3 1g、水1000mL，混合后加热至琼脂完全溶解，煮沸1～2min，调pH 8.6±0.2，待冷却至40～50℃，倒平板，备用。
2、接种将副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)在3.5％NaCl营养琼脂，大肠杆菌(Eschetichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)在营养琼脂，单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)在脑心浸液琼脂复苏24h后，分别划线接种上述显色培养基平板，36℃培养18～24h。
3、结果及分析在副溶血性弧菌的显色平板上，出现紫色菌落；霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌的显色平板上均出现蓝绿色菌落，溶藻弧菌的显色平板上出现白色菌落，大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的显色平板上均无生长现象，说明显色培养基对副溶血性弧菌具有较高的特异性。
实施例2本发明所述的副溶血性弧菌显色培养基灵敏度及特异性的验证
1、副溶血性弧菌显色培养基的配制取蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖类20g、单糖0.11g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆盐8g、混合显色底物Y-glucoside(美国sigma公司)0.35g、琼脂12g、NaCO3 1g、水1000mL，混合后加热至琼脂完全溶解，煮沸1～2min，调pH 8.6±0.2，待冷却至40～50℃，倒平板，备用。
2、接种将副溶血性弧菌在3.5％NaCl营养琼脂中复苏24h后，接种环挑取1环，加入到10mL 0.85％生理盐水中配成原液，然后进行10倍梯度稀释，取10-4-10-6浓度菌液各1mL，分别涂布上述显色培养基平板、传统的TCBS平板及科玛嘉公司生产的副溶血性弧菌显色培养基，36℃培养18～24h。
将副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌混合，进行梯度稀释，取104-105cfu/mL混合菌液，分别涂布步骤1制备的显色培养基平板，观察。
3、结果及分析纯菌液涂布各平板结果如表1，对30-300之间的菌落数进行方差分析，表明本发明所述的副溶血性弧菌显色培养基与传统的TCBS平板、科玛嘉公司生产的副溶血性弧菌显色培养基的副溶血性弧菌检出率没有显著差异(P＞0.05)，三种培养基可以达到相同的检测限。
表1副溶血性弧菌在各培养基上的菌落数(均值±Sd)
混合菌液涂布平板上，副溶血性弧菌仍呈特殊的紫色菌落，其他弧菌呈现蓝色或白色菌落。表明其他弧菌基本不影响副溶血性弧菌的检测，显色培养基对副溶血性弧菌的特异性高。
实施例3本发明所述的副溶血性弧菌检测方法与国家标准检测法(简称国标法)的比较从市场采集大量海产品、淡水鱼等，分别采用国标法(GB/T4789.7-2003，食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验)和本发明所述的检测方法对副溶血性弧菌进行检测，检测阳性样本用法国梅里埃细菌鉴定系统-API试剂条进行验证，比较两种检测方法的灵敏度。
(1)国标法样本—氯化钠多粘菌素B肉汤(或氯化钠结晶紫)增菌24h--划线接种TCBS平板—蓝绿色菌落--生化鉴定。
(2)本发明所述的检测法样本—含3.5％NaCl的TSB肉汤前增菌6h-氯化钠多粘菌素B肉汤选择性增菌16h—划线接种本发明所述的显色培养基—直接观察有无紫色菌落。
通过325份市场和超市海产品、淡水鱼类等代表性食品中副溶血性弧菌的国标法和本发明所述的检测方法，结果如表2，说明用本发明所述的副溶血性弧菌检测方法比国标法具有更高的检出率，且检测时间更短。
实施例4鱼肉中副溶血性弧菌检测的模拟试验
1、制备显色平板称取89.36g显色培养基干粉，加入1000mL水，煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，备用。
2、一步增菌称取25g鱼肉样品，将1～10cfu副溶血性弧菌加入25g样品中，模拟实际样品混合2h，无菌操作将样品放到盛有225mL TSB增菌液的三角瓶，37℃一步增菌(非选择性增菌)培养6h。
3、二步增菌取1mL样品一步增菌液加入到9mL氯化钠多粘菌素B肉汤中进行二步增菌，37℃培养16h。
4、接种培养取1环二步增菌液，划线接种显色培养基，37℃培养18～24h，观察记录菌落大小、颜色和形态。
5、结果观察和分析显色培养基上呈现光滑、略凸起、直径2-3mm、边缘整齐的紫色菌落。检测过程中，一步增菌需6h，二步增菌16h，显色平板培养18～24h，阳性结果时间最长需46h。检测检测灵敏度可以达到1～10cfu。
实施例5贝类中副溶血性弧菌的检测1、制备显色平板称取89.36g显色培养基干粉，加入1000mL水，煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，备用。
2、一步增菌在无菌条件下，称取25g贝肉，剪碎，加入到盛有225mL TSB增菌液的三角瓶中，37℃一步增菌(非选择性增菌)培养6h。
3、二步增菌取1mL样品一步增菌液加入到9mL氯化钠多粘菌素B肉汤中进行二步增菌(选择性增菌)，37℃培养16h。
4、接种培养接种环取1环二步增菌液，划线接种显色培养基，37℃培养18-24h，观察记录菌落颜色和形态。以副溶血性弧菌标准菌株划线接种显色培养基作对照，对比分析检测结果。
4、结果分析显色平板上呈现紫色、光滑、边缘整齐、直径2-3mm的紫色菌落，菌落颜色和形态与标准菌株相符，说明贝类样品中存在副溶血性弧菌。
权利要求
1.一种副溶血性弧菌显色培养基，其特征在于所述培养基的配方为蛋白胨10～15g、酵母粉3～5g、NaCl 9～11g、蔗糖类18～20g、单糖0.11～0.13g、柠檬酸钠9～11g、硫代硫酸钠9～11g、胆盐5～8g、混合显色底物Y-glucoside 0.05～0.95g、琼脂12～15g、NaCO31～1.5g。
2.如权利要求1所述的副溶血性弧菌显色培养基，其特征在于所述培养基的配方为蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖类20g、单糖0.11g、柠檬酸钠10g、硫代硫酸钠10g、胆盐8g、混合显色底物Y-glucoside 0.35g、琼脂12g、NaCO31g。
3.一种副溶血性弧菌检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括增菌液A胰酪胨液体培养基，增菌液B氯化钠多粘菌素B肉汤，及如权利要求1或2所述的显色培养基干粉。
4.一种使用如权利要求3所述的试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备显色平板每1000mL水中加入77～98g显色培养基干粉，混合后煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，备用；(2)一步增菌将样品置于增菌液A中，混合均匀后37℃培养6～8h；(3)二步增菌取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均匀后37℃培养15～17h；(4)接种培养将二步增菌液接种显色平板上，37℃培养18～24h；(5)结果分析若显色平板上出现光滑、略凸起、直径2-3mm、边缘整齐的紫色菌落，说明该样品存在副溶血性弧菌。
全文摘要
本文涉及一种副溶血性弧菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于食品微生物安全监测领域。检测试剂盒由加入了0.05～0.95g细菌特异性酶的混合显色底物Y－glucoside的显色培养基与增菌液A胰酪胨液体培养基，增菌液B氯化钠多粘菌素B肉汤组成；检测时，先后利用增菌液A、B对样品进行增菌培养，最后将二次增菌液接种至显色培养基上培养，若出现光滑、略凸起、直径2－3mm、边缘整齐的紫色菌落，说明样品存在副溶血性弧菌。所述的显色培养基成本低廉，试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏高，周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生、环境监测等领域。
文档编号C12R1/63GK1974784SQ20061012407
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者曾婧, 张淑红, 张菊梅, 傅岚 申请人:广东实验中学, 广东省微生物研究所