专利名称：一种培育抗逆转基因水稻的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育抗逆转基因水稻的方法。
背景技术：
植物生长发育过程中的任何不适环境因素均可称为环境胁迫，一般分为生物胁迫(如病虫害)与非生物胁迫。后者包括水分(干旱与涝灾)，温度，盐碱，光照，营养等多方面的胁迫。
环境胁迫给农业生产带来的危害是世界性的，非生物胁迫，特别是干旱造成的危害尤重(Boyer JS.1982.Plant productivity and environment.Science218443-448)，可使农作物减产50％至80％。正因为如此，很多科学家都将植物非生物胁迫生物学作为研究重点，以期加速发现植物耐非生物胁迫的基因和分子机理，为基因工程改良农作物耐逆性抢占制高点。
我国是农业大国，非生物胁迫给我国农业带来的危害非常严重，其中干旱与土壤盐碱化是限制我国农业可持续性发展的主要因素。我国可耕农地的50％受干旱影响，即使在降水较多的华中和华南地区，由于雨量分布不均，这些地区的水稻几乎每年在扬花的关键时期都受干旱的影响，直接影响产量，情节严重时甚至颗粒无收。我国北方大部分地区的降雨量偏低，加重土壤的盐碱化，严重影响农业生产。
研究非生物胁迫生物学和分离克隆耐逆基因非常重要，全世界的植物生物学家也为此做了大量的工作，并取得很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展。专利申请号为200410000682.2的中国发明专利申请公开了一个拟南芥转录因子AtHD/START1，它与拟南芥的耐盐性相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗逆转基因水稻的方法。
本发明所提供的培育抗逆转基因水稻的方法，是将AtHD/START1基因通过植物表达载体导入水稻中，筛选得到抗逆性提高的水稻；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白质。
所述AtHD/START1优选为由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由722个氨基酸残基组成，自氨基末端第31位至第88位氨基酸残基为同源盒(homeo-box)结构域，自氨基末端第236位至第457位氨基酸残基为START结构域，在同源盒结构域和START结构域之间是亮氨酸拉链(自氨基末端第89位至第235位氨基酸残基)，可能和二聚化有关，同源盒结构域主要是和DNA结合。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述同源盒结构域和START结构域之外进行取代和/或缺失和/或添加。
所述AtHD/START1基因的编码序列优选为序列表中的序列1。
所述植物表达载体可为现有的任何植物表达载体。所述植物表达载体中启动外源基因转录的启动子优选为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或玄参花叶病毒(FMV)35S启动子或水稻肌动蛋白基因(Actin1)启动子。如，所述AtHD/START1基因可通过植物表达载体pCB2004C导入水稻中，所述AtHD/START1基因通过植物表达载体pCB2006导入水稻中。
所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
所述AtHD/START1基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对转所述AtHD/START1基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(Bar基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有所述AtHD/START1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的水稻经组织培育成植株，获得抗逆性提高的水稻植株。
实验证明，水稻转AtHD/START1基因株系(转化体)的耐旱性明显高于对照(未转基因水稻)株系。通过气孔的蒸腾作用失去水分是干旱耐受的一个重要决定因素，转AtHD/START1基因株系叶片下表皮的气孔密度和对照相比，降低了25％，气孔密度的大幅度降低，使得植物通过蒸腾作用从叶片失去水分的效率降低，这可以大大提高植物对水分的保持能力。根系的生长情况是干旱耐受的另一个重要决定因素，转AtHD/START1基因株系根的构型同样发生了明显变化主根变长、侧根数增加、根的生物学重量增加，说明突变体的根系更加发达，这样可以使植株在受到干旱胁迫时能持续不断的从土壤吸水。而且转AtHD/START1基因株系的分蘖数明显高于对照。
图1为水稻胚性愈伤组织的诱导和植株再生照片图2为转化体和对照PCR结果图3a为转化体和对照southern blot图谱图3b为转化体和对照的RT-PCR结果图4为转化体和对照干旱胁迫及复水照片图5a为转化体和对照干旱胁迫9天复水3天的存活率统计结果图5b为转化体和对照干旱胁迫9天复水8天的存活率统计结果图6a为干旱胁迫幼苗期转化体和对照中SOD酶活性统计结果图6b为干旱胁迫拔节期转化体和对照中SOD酶活性统计结果图7a为干旱胁迫幼苗期转化体和对照中脯氨酸含量统计结果图7b为干旱胁迫拔节期转化体和对照中脯氨酸含量统计结果图8a为干旱胁迫幼苗期转化体和对照中总糖含量统计结果图8b为干旱胁迫拔节期转化体和对照中总糖含量统计结果图9为转化体和对照气孔密度比较照片图10a为转化体和对照气孔密度统计结果图10b为转化体和对照气孔大小统计结果图11为转化体和对照根系比较照片图12a为转化体和对照根长的统计结果图12b为转化体和对照根数的统计结果图12c为转化体和对照根重的统计结果图12d为转化体和对照根冠比的统计结果图13为转化体和对照分蘖数比较照片图14为转化体和对照分蘖数的统计结果图15为转化体和对照光合速率比较的统计结果图16为转化体和对照蒸腾速率比较的统计结果图17为转化体和对照水分利用率比较的统计结果图18为转化体和对照气孔导度比较的统计结果图19a为pCB2006/AtHD/START1的BamHI酶切鉴定图谱图19b为pCB2006/AtHD/START1的EcoRI酶切鉴定图谱图19c为pCB2004C/AtHD/START1的BamHI酶切鉴定图谱图19d为pCBpCB2004C/AtHD/START1的HindIII和EcoRI双酶切鉴定图谱图20为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105/pCB2004C/AtHD/START1和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鉴定图谱具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、转AtHD/START1基因水稻的培育一、转基因表达载体的构建1、AtHD/START1的cDNA基因的获得利用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen公司，Cat.No.18080-093)从Columbia生态型拟南芥(可以从拟南芥生物资源中心Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)购得)中RT-PCR扩增得到核苷酸序列是序列表中序列1的AtHD/START1的cDNA基因，具体过程如下总量RNA的抽提采用Trizol试(INVITROGEN)，使用1微克总量RNA作为反转录反应的模板，d(T)25作为反转录的引物，每个反转录反应使用200单位的SUPERSCRIPT II反转录酶(INVITROGEN)并按照反转录酶产品使用指南进行。RT-PCR所用引物序列按照AtHD/START1基因的序列设计，其5’末端引物是5’atgagtttcgtcgtcggcgt3’，3’末端引物是5’tcaagctgtagttgaagctgt3’，，PCR反应使用1微升反转录反应液为模板，其它完全按照Takara公司的ExTaq酶的使用指南进行，淬火温度为56摄氏度，延伸时间为100秒，30个循环。PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收并克隆到pMD18-T Vector载体上，进行测序分析，测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列1的核苷酸序列，是AtHD/START1的cDNA基因。
2、转基因表达载体pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的构建(1)pCB2004C的构建pCB2004C按照如下方法构建将pCAMBIA3301(CAMBIA)用BstXI和SmaI消化，在pCAMBIA3301的BstXI和SmaI识别位点间插入由依次串联的BstXI，SstI，DraIII(a)，AscI，AvrII，SwaI，DraIII(b)，和SmaI识别序列组成的多克隆位点片段，得到重组载体pCB2002。其中SmaI识别位点是下述两个合成的多聚核苷酸5’AGCTCACGGGGTGGCGCGCCTAGGATTTAAATCACAAAGTGCCC3’和5’GGGCACTTTGTGATTTAAATCCTAGGCGCGCCACCCCGTGAGCTCATG3’在66℃退火60秒得到的。
将Gateway Conversion A试剂盒(Invitrogen，Gateway vector Conversionsystem Cat.No.11828-019)中的Conversion A通过平末端连接插入到pCB2002的SmaI和PmlI识别位点之间就得到基础载体pCB2003。
以pCAMBIA3301(CAMBIA)为模板，用引物5’GGGCACGGGGTGGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAA3’和5’GGGCACTTTGTGATTGTAAATAGTAATTGT3’PCR扩增烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子，将得到的烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子PCR产物用DraIII消化后，直接和用DraIII线性化后的pCB2003连接，得到质粒pCB2004。
将pCB2004使用BamHI消化后去掉氯霉素抗性基因，然后环化，得到pCB2004A。然后使用PCR引物5’-cctttggtcttctgagactgt-3’和5’-ttgagtcgtaagagactctg-3’以pSK015(Addgene Inc.质粒代号11570)为模板将4×35S增强子扩增出来，将该4×35S增强子片段使用NcoI和SacI消化后克隆至pCB2004A的NcoI和SacI之间，得到pCB2004C。
(2)pCB2006的构建以水稻的基因组DNA为模板，使用PCR引物5’-GGGCACGGGGTGTAGCTAGCATACTCGAGGTCA-3’和5’-GGGCACGTTTTGAGTAGATATCCTCGGCGTCAG-3’，PCR扩增水稻Actin1启动子，PCR产物经DraIII消化后，与用DraIII线性化的pCB2003在T4DNA连接酶的作用下环化得到pCB2006。
(3)pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的构建将步骤1中得到的AtHD/START1基因的cDNA基因利用GatewayRBP ClonaseTMIIEnzyme Mix试剂盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通过GatewayTMCloningTechnology重组克隆到pCB2004C或pCB2006的attR1和attR2之间，得到含有AtHD/START1基因的重组表达载体pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1。利用BamHI或EcoRI单酶切pCB2006/AtHD/START1进行结构鉴定，结果如图19a和19b所示，BamHI单酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小为1988bp(包括172bp Actin 1启动子部分和1812bp AtHD/START1cDNA 5’端)片段，9757bp的pCB2006/AtHD/START1两个BamHI位点间的载体骨架部分；EcoRI单酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小为2003bp的载体pCB2006/AtHD/START1两个EcoRI位点的部分(包括878bp Actin 1启动子部分和1125bp AtHD/START1cDNA 5’端片段)，和pCB2006/AtHD/START1两个EcoRI位点之间的9742bp载体骨架部分。说明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2006的attR1和attR2之间。利用BamHI单酶切pCB2004C/AtHD/START1、HindIII和EcoRI双酶切pCB2004C/AtHD/START1进行结构鉴定，结果如图19c和19d所示，BamHI单酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小为3764bp的片段(包括4x35S增强子、35S启动子和AtHD/START1cDNA的一部分)和8689bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1两个BamHI位点之间载体骨架部分)；HindIII和EcoRI双酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小为666bp的片段(AtHD/START1cDNA上EcoRI和HindIII位点之间的部分)，和11817bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1EcoRI和HindIII位点之间载体骨架部分)；说明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2004C的attR1和attR2之间。
图19a中，泳道1、2、3为BamHI单酶切pCB2006/AtHD/START1的结果，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10K)；图19b中，泳道1、2、3为EcoRI单酶切pCB2006/AtHD/START1的结果，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10K)；图19c中，泳道1、2、3为BamHI单酶切pCB2004C/AtHD/START1的结果，M为Fermentas DNAladder(250bp-10K)；图19d中，泳道1、2、3为HindIII和EcoRI双酶切pCB2004C/AtHD/START1的结果，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10K)。
二、农杆菌介导的遗传转化1、含有pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株的制备将-70℃保存的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105涂布在LB(含庆大霉素50ug/ml)28℃培养活化。然后取4-5个单菌落接种于3mlLB液体培养基(含庆大霉素50ug/ml)过夜培养。将过夜培养的菌液按1∶100的体积比接种于500ml的LB液体培养基(含庆大霉素50ug/ml)，250rpm，28℃，培养至OD600＝1.0左右。5000rmp离心收集菌体，然后用预冷的等体积的无菌去离子水重悬，重复七次，最终将菌体重悬于0.5ml的10％甘油中。取10ng的pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1质粒分别与50ul根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受态细胞(根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105感受态细胞按照英文影印版《拟南芥实验手册》.DetlefWeigel and Jane Glazebrook.化学工业出版社.2004年3月第1版，第1次印刷的方法制备)混合均匀后，加入到预冷的电极杯中(0.2mm，Biorad公司)。使用Agr电击程序(所购买的仪器自带的电击程序，在仪器的说明书上，说明书为MicroPulserTMElectroporation Apparatus Operation Instruction andApplications Guide，Catalog Number 165-2100)。电击后加入SOC培养基复苏4小时后，涂布含庆大霉素50ug/ml和卡那霉素50ug/ml的LB培养基，28℃，培养两天。取单菌落扩增AtHD/START1基因中的片段(引物序列为5’-GCA ACA TGA GAGAGC AGA TAA TA-3’和5’-TCA AGA AGC AAA TCT TTC ACA CAT T-3’)进行菌落PCR验证。PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段条带的pCB2004C/AtHD/START1转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105是含有pCB2004C/AtHD/START1的菌株，命名为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pCB2004C/AtHD/START1，PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段条带的pCB2006/AtHD/START1转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105是含有pCB2006/AtHD/START1的菌株，命名为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pCB2006/AtHD/START1。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pCB2004C/AtHD/START1和根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鉴定结果如图20所示，泳道1-9是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pCB2004C/AtHD/START1的PCR结果，泳道10-16是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pCB2006AtHD/START1的PCR结果，均得到1091bp AtHD/START1基因片段条带，M为Fermentas DNA ladder(250bp-10K)。
2、水稻成熟种子愈伤组织的诱导和继代1)成熟水稻中花11种子(安徽天禾水稻种业有限责任公司)，手工去种壳，备用；2)取种子于无菌三角瓶，70％乙醇浸洗30sec，倒去乙醇，无菌水清洗一遍；3)0.1％的升汞溶液浸泡消毒15-20min，无菌水清洗5-6遍，灭菌后的种子置于无菌滤纸上，尽量吸干水分；4)灭菌好的种子播种于诱导培养基(MS+2，4-D 2.5mg/L)，26±1℃暗培养4-6周；5)将长出的淡黄色颗粒状的愈伤组织转入继代培养基(J3+2，4-D 2.5mg/L)，继续于26±1℃暗培养2-3周，此时的愈伤组织即可用于转化。
3、水稻愈伤组织的转化和植株再生1)选取致密、干燥颗粒状胚性愈伤组织于预培养培养基(MS+2，4-D0.75mg/L)，26±1℃暗培养4天；2)挑取根癌农杆菌EHA105/pCB2004C/AtHD/START1或根癌农杆菌(Agrobacterium tumefac1ens)菌株EHA105/pCB2006/AtHD/START1单菌落接种于10ml含250μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中，28℃培养过夜至对数生长后期(约17hr)，于4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，用含250μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基稀释菌体至OD600为0.8-1.0，待用；3)预培养过的胚性愈伤组织转入稀释后的农杆菌菌液，共培养30min；4)共培结束，倒去菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸，吸去多余菌液；5)转移愈伤组织至共培培养基(MS+2，4-D 0.75mg/L+100μmol/L乙酰丁香酮)，19-20℃暗培养3天；6)3天后，将愈伤组织转入带盖50ml无菌管，用含400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸洗20-30min，无菌水清洗愈伤组织6-7遍；7)无菌滤纸尽量吸干愈伤组织外水分；8)吸干水的愈伤组织转入附加400mg/L羧苄青霉素和25mg/L除草剂草铵膦(glufosinate ammoniums)的选择培养基(J3+2，4-D 0.6mg/L)上生长，每2周继代一次，继代2-3次；9)在选择培养基上生长出的抗性愈伤组织转移至附加200mg/L羧苄青霉素和25mg/L除草剂的预分化培养基(N6+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L)，26±1℃暗培养5-7天；10)转移预分化培养基上的愈伤组织至附加200mg/L羧苄青霉素和25mg/L除草剂glufosinate ammonium的分化培养基(N6+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.05mg/L)，26±1℃光照培养；11)愈伤组织分化出的芽长至3-5cm时，切下芽，移入附加25mg/L除草剂glufosinate ammonium的生根培养基(MS0)，26±1℃光照培养生根；12)幼苗长至约8-10cm高，培养瓶开盖炼苗1-2天，洗去根部植物凝胶，种植于田间，常规管理，成熟收种。
结果表明去壳灭菌的种子播种于诱导培养基之后约3-4周，种胚处开始膨大并长出颗粒状愈伤组织，至7-8周时，已有大量的愈伤组织生成(图1中a)，将诱导生成的愈伤组织转移到继代培养基继续生长，3周后可以看到大量淡黄色颗粒状愈伤组织形成(图1中b)，选择表面干燥、胚性强的淡黄色颗粒状的愈伤组织继续预培养4天(图1中c)，即可进行转化。图1中d是在选择培养基上长出的抗性愈伤组织，从图1中d可看到，转化未成功的愈伤组织，在选择培养基上经过一定时间选择后，褐化、死亡，而有些愈伤组织在选择培养基上则可以进行生长，并在原来愈伤组织的周围长出小颗粒状的抗性愈伤组织。抗性愈伤组织2周继代一次，继代3次后，将抗性愈伤先置于预分化培养基培养1周(图1中e)，再转入分化培养基分化，图1中f即是在预分化培养基上分化出的苗，为确保得到的转化体是每个不同的个体，每块愈伤组织分化出的苗只保留一株；分化出的苗转入生根培养基，由于生根培养基中加入了20mg/L高浓度的除草剂，因此，分化的苗在转入生根培养基后，约有20％不能在生根培养基上生根，最后枯黄死去，而80％的分化苗都可以在生根培养基上生根(图1中g)，其生根速度非常快，在移入生根培养基24小时即可看到白色的根从分化苗的基部长出，一周即可长成；转化体(T0代)生根后，将培养瓶的封口膜打开炼苗，炼苗结束即可移入大田(图1中h)。移栽时一定要洗干净根部植物凝胶，否则很容易造成移栽幼苗因长菌而死亡，移栽至大田的水稻幼苗进行常规田间管理，转化体和对照均正常成熟(图1中i)、收种(图1中j)，得到T0代转化体的种子(T1代)。
图1中，a、诱导50天的愈伤组织；b、继代20天的愈伤组织；c、愈伤组织预培养；d、转化后在选择培养基上长出抗性愈伤组织；e、抗性愈伤组织预分化；f、抗性愈伤组织分化出苗；g、在含除草剂的培养基上生根；h、转化体移栽入大田；i、转化体在大田成熟；j、收获的转化体种子。
水稻中一些适合于被农杆菌转化的组织或细胞，包括分生组织(如茎尖和根尖等)，以及幼穗和幼胚或成熟胚来源的愈伤组织等，因为胚性愈伤组织分裂活动比较旺盛，细胞状态比较敏感，易于接收外源基因的导入和整合，实验中幼穗和幼胚的出愈率和愈伤组织的分化率都比成熟胚诱导的愈伤组织要高，但获得幼穗和幼胚的时间较短，取材受到很大限制，因此本实验选用的是水稻种子的成熟胚诱导愈伤，虽然成熟水稻种子由于其组织已经完全分化，细胞脱分化和再分化能力比幼穗和幼胚差，但种子保存较容易，取材不受限制，可以根据需要随时取用，因此可作为诱导愈伤组织和遗传转化的理想材料。
优化组织培养和共培养条件是水稻遗传转化成败的一个关键因素。本实验采用了Y.J.Lin等的诱导培养基(MS+2，4-D 2.5mg/L)，是基本培养基附加2.5mg/L的2，4-D；继代培养基和诱导培养基相同，但是糖类从蔗糖换成了麦芽糖；随后的预培养培养基、悬浮培养基、共培养培养基以及选择培养基都使用了麦芽糖，且始终使用了不同浓度的2，4-D，在选择培养过程中，固化培养基使用了琼脂糖，预分化和再生培养基中附加了高浓度的细胞分裂素，共培养培养基也附加了100μmol/L乙酰丁香酮，此外还增加了葡萄糖，添加乙酰丁香酮，增加诱导物的浓度以促进农杆菌vir区基因的活化与表达，对转化愈伤组织也是至关重要的。愈伤组织诱导所需要的激素浓度在不同品种的植物中差别很大，本实验选用2.0mg/L的2，4-D；培养基的pH值也是一个重要因素，低pH值有利于诱导vir基因的表达，因此农杆菌在侵染和与愈伤组织共培养时应处于较低的pH值条件下，本实验为5.2。
三、转化体的鉴定1、转化体的PCR鉴定在除草剂中生根的水稻幼苗，移栽至田间完全成活后，取叶片，CTAB法提取转化体(转pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的水稻中花11，在图中以转化体表示)以及对照(未转基因的水稻中花11，在图中以WT表示)基因组DNA，用于PCR鉴定。转化体的标记基因是Bar基因，引物设计根据Bar基因两端序列，上下游引物序列分别为P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA。PCR反应体系(50μl体系)DNA聚合酶Ex Taq(5U/μl)0.25μl，10×ExTaq buffer 5μl，dNTPs(四种dNTP，每种各10mM)4μl，P1(10μM)2μl，P2(10μM)2μl，基因组DNA 2μl，ddH2O 34.75μl。
PCR反应程序先95℃ 5min；然后94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，共40个循环；再72℃ 10min；最后4℃保存。PCR扩增产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
从结果如图2所示，转化体株系可以扩增出552bp的Bar基因目的条带，而对照未能扩出相应条带。图2中，MMarker；WT对照；其余泳道为不同转化单株。其中，8-1中转入的是pCB2004C/AtHD/START1，2-56、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1中转入的是pCB2006/AtHD/START1。
2、转基因植株Southern blot分析1)在除草剂中生根的水稻幼苗，移栽至田间完全成活后，取叶片，CTAB法提取转化体(转pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的水稻中花11，在图中以转化体表示)以及对照(未转基因的水稻中花11，在图中以WT表示)的基因组DNA，根据转入的外源基因AtHD/START1基因、Bar基因序列以及质粒本身酶切位点，选择SacI对水稻基因组DNA进行酶切消化，酶切完全后，用1×TAE缓冲液，0.8％琼脂糖凝胶电泳，电压1V/cm，电泳12-14hr；电泳结束，紫外灯下拍照记录；2)将DNA转移尼龙膜上，转移后的尼龙膜，装入杂交管，加入新配制的杂交液(杂交液的组成为SDS 7％，BSA(Casein)1％，EDTA 1mM，Na2HPO4·12H2O0.25M)10-15ml，于65℃预杂交至少6hr；3)加入变性过的放射性标记探针(该探针为Bar基因)，65℃杂交16-20hr；杂交结束，含探针的杂交液倒入指定废液缸；4)加入100ml 2×SSC+0.1％SDS，旋紧盖子，翻转管子几次，洗膜，整个操作在室温下进行，洗后的溶液倒入盛放放射性物质的废液缸；5)加入200ml 2×SSC+0.1％SDS，于杂交炉室温洗膜5min，其余同4)；6)加入200ml 0.2×SSC+0.1％SDS，杂交炉室温洗膜5min，其余同5)；7)加入200ml 0.1×SSC+0.1％SDS，杂交炉室温洗膜5min，其余同5)；8)加入200ml 65℃预热的0.1×SSC+0.1％SDS，65℃杂交炉中洗膜10-30min，其余同5)；9)将膜置于一塑料盒，用SURVEY METER检测放射性强度，依放射性强度的大小，边检测边用65℃预热的0.1×SSC+0.1％SDS洗，直至合适强度。
10)洗膜结束，滤纸吸干膜上多余洗液，保鲜膜包裹尼龙膜；暗室中曝光，将膜固定在有高速增感屏的压片夹中，-80℃超低温冰箱放射自显影，拍照。
其中，探针按照如下方法制备①微量离心管中配制下列反应液，95℃加热3min，迅速置于冰中冷却，放置5min。
模板 10ng-1μg随机引物(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自带) 2μldH2O直到14μl。
其中，模板是以pCB2004C为模板，用P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；和P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA得到的PCR产物。
②加入10×Buffer(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自带)，dNTP Mixture(四种dNTP，每种各0.2uM/μl)2.5μl，用于标记的dCTP*2(50μCi)5μl。
③加入1μl Exo-free Klenow Fragment(2U/μl)，37℃反应60-120min；④65℃加热5min使酶失活；⑤95℃加热3min后迅速置于冰中冷却；⑥取反应液直接作为探针使用。
结果如图3a所示，转化体可以杂交出条带，对照没有，进一步证明水稻转化成功。图3a中，WT对照；其余泳道为不同转化单株。
3、AtHD/START1基因在转化体中的表达分析取经步骤1的PCR鉴定和步骤2的Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系的T0代幼苗和对照幼苗(在图中以WT表示)进行RT-PCR。
在转化体和对照营养生长阶段，取叶片用Trizol法抽提RNA，反转录cDNA，进行RT-PCR，以水稻tubulin作内标，检测转入基因在转化体内的表达情况。
(1)Trizol试剂盒提取水稻叶片RNA1)分别取50mg生长旺盛转化体和对照叶片，加入1ml Trizol，室温研磨，放置5min；2)4℃，12000g，离心10min，取上清，室温放置5min；3)上清加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min；4)4℃，12000g，离心15min，取上清并加入500μl异丙醇；5)室温放置10min，4℃，12000g，离心10min；6)弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，7500g，离心5min；7)弃上清，沉淀晾5min，10μl DEPC-H2O溶解；8)紫外分光光度计测定A260、A280，检查RNA质量并计算浓度，备用。
(2)RT-PCR1)向管中加入RNA 3μg、Oligo d(T)2550pmol、dNTP(10mM)1μl、再加入dH2O 直到14μl，混匀，65℃，5min，取出置冰上至少1min；同管中加入5×FS buffer(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase试剂盒自带，该试剂盒的商品目录号为Cat.No.18080-093)4μl、0.1M DTT 1μl、SSRTase III(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase试剂盒自带，该试剂盒的商品目录号为Cat.No.18080-093)1μl、至总体积20μl，50℃水浴，60min，得到cDNA的第一链。
2)以反转录得到的cDNA为模板，扩增水稻tubulin，上下游引物序列为P3GGAGATCCTCCACATCCAG；P4CAGAAAGGGTAGCATTGTAAG；以rTaq PCR试剂盒(Takara公司)进行PCR扩增，PCR扩增体系(总体积20μl)为rTaq(U/μl)0.1μl，10×ExTaq buffer 2μl，dNTPs(四种dNTP，每种各10mM)1.6μl，P3(10μM)2μl，P4(10μM)2μl，模板1μl，dH2O 11.3μl。PCR扩增条件先95℃ 3min；然后94℃ 30sec、68℃ 1min，35个循环；再72℃ 10min；最后4℃保存。
3)调整内标，扩增AtHD/START1基因，引物序列为P5AT GAG TTT CGT CGTCGG CGT；P6TCA CTT TAG TGC ACT ATT ATC TGC T；以rTaq PCR试剂盒(Takara公司)进行PCR扩增，PCR扩增体系除将引物替换为P5和P6外，其他同tubulin的PCR扩增体系；PCR扩增条件先95℃ 3min；然后94℃ 30sec、56℃ 30sec、72℃ 30sec，40个循环；再72℃ 10min；最后4℃保存。结果如图3b所示，表明转入的基因在转化体内均有表达，但在不同的转化体中表达量稍有不同2-56和14-16转化单株的表达量比其他几个株系略高，而别的转化单株的表达量基本没有区别。图3b中，WT对照；其余泳道为不同转化单株。
实施例2、转AtHD/START1基因水稻的抗旱性检测及其生理生化特性测定将经实施例1的PCR鉴定和Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系的种子得到的幼苗和对照(在图中用WT表示)幼苗进行如下抗旱性检测及其生理生化特性测定，每个转化体株系和对照均40株。
1、转化体抗旱性鉴定将收获的T0代水稻种子播种在MS0(不含任何激素的MS)含20mg/L除草剂glufosinate ammonium培养板上，每个转基因株系和对照播种40粒，在除草剂板上全部萌发的株系作为纯合体，将在除草剂板上萌发的幼苗移栽至同样大小的花盆中(花盆中花土已称重，花土重量相同，以尽量保证生长环境条件一致)，每盆栽9株，在幼苗完全成活并旺盛生长后，选取生长状态良好并一致的转化体和对照，充分吸透水，然后进行干旱胁迫处理(持续不浇水)，并在干旱胁迫不同时间后进行耐旱相关生理生化指标的测定及复水后的形态观察。
选取生长状态一致、生长良好的转化体和对照同时进行干旱胁迫实验，干旱胁迫5天时，对照大部分叶片已卷曲、干枯，下部叶片开始枯黄、死亡，只有少量叶片还保持展开状态，而转化体只是最外层叶片开始卷曲，大部分叶片仍保持挺立姿态继续生长(图4中a)；干旱胁迫9天后，对照叶片几乎全部卷曲枯黄，几乎无绿色叶片，转化体虽然也因失水叶片发生了卷曲，但植株叶片仍为绿色，只是失水导致的叶绿素被破坏而致叶尖发黄，对转化体和对照进行复水，复水3天后，对照仅有少量的植株恢复存活，存活的状态不好，只有心叶是绿色，但转化体叶片大部分都开始重新挺立，仅仅外部叶片还是卷曲状态，未能完全恢复(图4中b)，复水8天，有更多转化体叶片挺立，整株植株基本恢复干旱胁迫前的生长状态，也有个别单株死亡，对照只是有个别单株恢复生长，大部分都已死亡(图4中c)。将干旱胁迫9天后，复水3天和复水8天的植株进行存活率统计，统计结果表明，复水3天时，只有10％对照复活，而转化体有85％存活，复水8天，对照存活率上升至18％，转化体达到93％，可见转化体的耐旱性远远大于对照，干旱胁迫9天后，复水3天和复水8天的转化体的存活率与对照均呈现极显著差异(p＜0.01)(图5a和图5b、表1、表2)。
表1干旱胁迫9天复水3天不同转化株系存活率
表2干旱胁迫9天复水8天不同转化株系存活率
图4只是一个转化体株系12-35的照片。图4中，a、干旱胁迫5天；b、干旱胁迫9天，复水3天；c、干旱胁迫9天，复水8天。3个图片中，左边的三盆均为对照，右边的三盆均为转化体。
表1和2中，WT为40株对照的统计结果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1为7个转化体株系、每个株系40株的统计结果。图5a和图5b中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。
2、转化体抗旱性相关生理指标的测定(方法见《植物生理学实验指南》.中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会编。科学出版社。2004年)(1)SOD酶活性测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中SOD酶活性。具体方法如下1)粗酶液制备分别取每株转化体和对照水稻幼苗叶片0.5g，加入5倍于样品量的50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液[含0.1mM EDTA；0.3％(0.3g/100ml)TritonX-100；4％(4g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮(pvpp，polyvinylpolyrrolidone)]，研磨后倒入离心管中，以10,500g离心20min，上清液为粗酶液。
2)酶活性测定在盛有3ml反应混合液(在54ml 14.5mM dl-甲硫氨酸中分别加入均以50mM pH7.8磷酸缓冲液配制的3μMEDTA，2.25mM NBT和60μM核黄素各2ml，溶液均在用前配制，避光放置)的试管中，加入SOD粗酶液，混合后放在试管架上，在光照培养架内照光10min，取出试管，迅速测定OD560值，以不加酶液的照光管为对照。
3)计算酶活性＝酶单位/样品量＝反应被抑制％/(50％)×3ml反应混合液中加入的样品量。
转化体和对照干旱胁迫开始后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中SOD酶活性，结果表明干旱胁迫3天时，转化体SOD酶活性比对照SOD酶活性已有升高，但未表现出明显差异，幼苗期和拔节期基本一致，干旱胁迫5天，幼苗期转化体的SOD酶活性比对照高了近一倍，而拔节期的差异却比较小，两者之间只有很小差别；干旱胁迫7天时，幼苗期对照的SOD酶活性只有转化体的三分之一，拔节期的差异还是比较小，而且干旱胁迫7天后，无论是幼苗期还是拔节期的SOD酶活性都呈现下降的趋势(图6a和图6b)，可能是因为在干旱胁迫7天后，无论是对照还是转化体的叶片都发生了卷曲，特别是对照，叶片由于严重失水象枯草一样，因此也就导致了酶的活性下降。图6a和图6b中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。
(2)游离脯氨酸的测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中脯氨酸含量。具体方法如下1)脯氨酸提取分别取每株转化体和对照水稻幼苗叶片0.1g，用3％(3g/100ml)磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为5ml，匀浆液转入离心管中，沸水浴浸提10min。冷却后，以3000rpm离心10min，取上清液待测。
2)含量测定(a)标准曲线制作在1-10μg/ml脯氨酸浓度范围内制作标准曲线。取标准溶液各2ml，加入2ml 3％磺基水杨酸、2ml冰乙酸和4ml 2.5％(2.5g/100ml)茚三酮溶液，置沸水浴中显色60min。冷却后，加入4ml甲苯萃取红色物质。静置，取甲苯相测定520nm处的吸收值，依据脯氨酸量和相应吸收值绘制标准曲线。
(b)样品测定取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等显色试剂，同标准曲线程序进行显色、萃取和比色。
结果表明干旱胁迫3天时，无论是幼苗期还是拔节期，转化体脯氨酸含量比对照都略有升高，但未表现出明显差异，干旱胁迫5天和干旱胁迫7天，幼苗期和拔节期转化体脯氨酸含量仍比对照中脯氨酸含量高，但差异都未达显著水平；幼苗期和拔节期，不同干旱胁迫时间脯氨酸含量在转化体和对照间呈现较一致的趋势，未见有大的差异，但胁迫发生后，在转化体体内积累了更多的脯氨酸，以帮助其抵抗胁迫。(图7a和图7b)。图7a和图7b中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。
(3)可溶性总糖的测定转化体和对照开始干旱胁迫后，依照干旱胁迫不同时间取转化体和对照叶片，测定样品中总糖含量。具体方法如下1)试剂(a)葡萄糖标准液准确称取分析纯无水葡萄糖0.2000g，蒸馏水溶解并定容至200ml，使用时稀释10倍，其浓度为100μg/ml；(b)蒽酮试剂称取蒽酮1g溶于72％H2SO4溶液1000ml(98％浓H2SO4760ml+蒸馏水240ml)，贮于棕色瓶，冰箱保存，可用2-3周；2)标准曲线绘制取干燥洁净的试管6支(0-5号)，依次加入葡萄糖标准溶液0(空白)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml(各管葡萄糖量依次为0、20、40、60、80、100μg)和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5ml，摇匀后沸水中10min，取出冷却后于620nm下比色，记录OD620值，绘出标准曲线。
3)样品提取分别取每株转化体和对照水稻幼苗新鲜叶片1.0g，加入少量石英沙及去离子水研磨至匀浆，连同残渣用去离子水定容至100ml，室温下静置60min(经常摇动)，过滤弃残渣。
4)样品测定取干洁试管，分别加入样液1ml和蒽酮试剂5ml，摇匀后，沸水浴10min，冷却后620nm比色(标准曲线空白做零点)，记录OD620值。
5)结果计算按照公式C＝AN/W计算。
其中C-样品可溶性糖含量(μg/g叶片)；A-标准曲线查得的可溶性糖(μg)；W-样品重量(g)；N-样品提取液占样品反应液的倍数。
结果表明干旱胁迫3天，无论是幼苗期还是拔节期，转化体的总糖含量比对照株中的总糖含量都略有升高，但未表现出明显差异，干旱胁迫5天和干旱胁迫7天时，幼苗期和拔节期转化体的总糖含量都还是比对照中的总糖含量高，但差异都未达显著水平；幼苗期和拔节期，不同干旱胁迫时间的总糖含量在转化体和对照之间呈现比较一致的趋势，未见有大的差异，和脯氨酸的变化趋势一致(图8a和图8b)。图8a和图8b中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。
实施例3、转AtHD/START1基因水稻的相关生物学性状观察将经实施例1的PCR鉴定和Southern blot分析结果均为阳性的T0代转化体2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系的种子得到的幼苗和对照(在图中用WT表示)幼苗进行如下生物学性状观察，每个转化体株系和对照均40株。
将收获的T0代水稻种子播种在MS0(不含任何激素的MS)含20mg/L除草剂glufosinate ammonium培养板上，每个转基因株系和对照播种40粒，在除草剂板上全部萌发的株系作为纯合体，将在除草剂板上萌发的幼苗移栽至同样大小的花盆中(花盆中花土已称重，花土重量相同，以尽量保证生长环境条件一致)，每盆栽9株，在幼苗完全成活并旺盛生长后，选取生长状态良好并一致的转化体和对照进行相关生物学指标的观察。
1、叶片气孔密度和大小观察1)选取生长状态一致的转化体和对照，取同样叶位的同样部位；2)在载玻片上均匀涂抹恒固502强力胶水，将选定的水稻叶片区域下表皮紧贴于涂有胶水的载玻片上，用力按压；3)胶水凝固后，将叶片剥离载玻片，水稻叶片下表皮气孔即被拓于载玻片；4)显微镜下观察气孔，记录每一视野中气孔数，每个叶片至少记录50个视野，根据测微尺计算每个视野面积，计算叶片气孔密度(个/mm2)。
5)记录气孔数的同时，测微尺测量气孔长度和宽度，气孔长度以气孔纵轴最长处计算，气孔宽度以垂直于纵轴最宽处计算。
图9中a和b分别为对照和转化体叶片下表皮气孔的200倍光镜照片，图9中c和d分别为对照和转化体叶片下表皮气孔的400倍光镜照片，从200倍和400倍的气孔光镜照片，很难看出对照和转化体在气孔密度上是否存在差异，在统计至少50个视野气孔数量后，计算气孔密度并做统计分析，发现不仅转化体和对照之间在气孔的数量上存在极显著差异(p＜0.01)(图10a，表3)，而且在气孔大小上也存在极显著差异(p＜0.01)(图10b)。由于水稻叶片气孔很难观察，因此只能用拓片的方法将气孔拓下来进行观察、记录，这样就无法观察与统计表皮细胞变化情况，也难以计算出气孔指数，从水稻转化体和对照气孔变化情况可看出，转化体和对照的差异要小于在水稻中观察到的气孔变化。
表3不同转化株系气孔密度
图9只是一个转化体株系2-56的照片。图9中，a、对照下表皮气孔(200倍)；b、转化体下表皮气孔(200倍)；c、对照下表皮气孔(400倍)，d、转化体下表皮气孔(400倍)。图10a和图10b中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。表3中，WT为40株对照的统计结果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1为7个转化体株系、每个株系40株的统计结果。
2、根系的观察选取生长状态一致的转化体和对照，旺盛生长期时小心挖出各植株，小心洗去根部附着的泥土，观察根系情况，同时记录每盆中所有植株的根长(以最长的一根计算)、根数，称量记录每株根重、冠重。
在旺盛生长期时将转化体和对照每盆中苗全部挖出，观察根系情况，苗从盆中挖出后，将所有苗归拢在一起，可以明显看出转化体根的群体比对照要粗、壮、长，单株拍照可以明显看出这点(图11)，每盆中单株都测量其根长并数其根数后做统计分析，可看出转化体和对照之间根长差异达到显著水平(p＜0.05)(图12a)，而根数差异则达到极显著差异水平(p＜0.01)(图12b)；将根从茎的基部剪下，分别称量根重和地上部分重量，然后计算其根冠比，转化体和对照之间的根重差异达到了显著差异水平(p＜0.05)(图12c)，而根冠比在转化体和对照之间同样也表现出了显著差异(p＜0.05)(图12d)。
表4不同转化株系根系情况
图11只是一个转化体株系64-1的照片。图11中，a、群体比较；b、单株比较；a和b中均是左为转化体，右为对照。图12a、图12b、图12c和图12d中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。表4中，WT为40株对照的统计结果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1为7个转化体株系、每个株系40株的统计结果。
3、分蘖的观察选取生长状态一致的转化体和对照，旺盛生长期时记录每株苗的分蘖数。
表5不同转化株系分蘖数
结果表明转化体的苗几乎都有多个分蘖(图13中a、b和c)，出转化体的分蘖数明显高于对照(图13、14)，记录每盆中每株苗的分蘖情况，进行数据统计分析，转化体和对照之间的分蘖差异达到了显著水平(图14和表5)。图13只是一个转化体株系64-1的照片。图13中，a是对照分蘖情况，b是转化体分蘖情况，c是单株对比(左为转化体，右为对照)。图14中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。表5中，WT为40株对照的统计结果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1为7个转化体株系、每个株系40株的统计结果。
4、转化体光合指标的测定选取生长状态一致的转化体和对照，测定相同叶位的光合速率(μmol CO2/m2s)、蒸腾速率(μmolH2O/m2s)、水分利用率(mg/g)和气孔导度(mmol/m2s)，测定时，每盆中的每株苗都必须测定，统计测定结果。所用仪器为PB0402光合蒸腾仪。
在水稻营养生长阶段，用光合测定仪对各植株进行光合指标的测定。每盆中的每株苗都测，结果表明转化体的光合速率高于对照，且差异达到了显著水平(p＜0.05)(图15)，转化体的水分利用率也比对照要高(图17)，但并未达到显著差异的水平；而对照的蒸腾速率和气孔导度则都比转化体要高(图16、图18)，但也没有达到显著差异水平。
表6不同转化株系光合指标
图15-18中，转化体为2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7个转化体株系、每个株系40株的统计结果，对照是40株的统计结果。表6中，WT为40株对照的统计结果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1为7个转化体株系、每个株系40株的统计结果。
序列表<160>2<210>1<211>2169<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgagtttcg tcgtcggcgt cggcggaagt ggtagtggaa gcggcggaga cggtggtggt 60agtcatcatc acgacggctc tgaaactgat aggaagaaga aacgttacca tcgtcacacc 120gctcaacaga ttcaacgcct tgaatcgagt ttcaaggagt gtcctcatcc agatgagaaa 180cagaggaacc agcttagcag agaattgggt ttggctccaa gacaaatcaa gttctggttt 240cagaacagaa gaactcagct taaggctcaa catgagagag cagataatag tgcactaaag 300gcagagaatg ataaaattcg ttgcgaaaac attgctatta gagaagctct caagcatgct 360atatgtccta actgtggagg tcctcctgtt agtgaagatc cttactttga tgaacaaaag 420cttcggattg aaaatgcaca ccttagagaa gagcttgaaa gaatgtctac cattgcatca 480aagtacatgg gaagaccgat atcgcaactc tctacgctac atccaatgca catctcaccg 540ttggatttgt caatgactag tttaactggt tgtggacctt ttggtcatgg tccttcactc 600gattttgatc ttcttccagg aagttctatg gctgttggtc ctaataataa tctgcaatct 660cagcctaact tggctatatc agacatggat aagcctatta tgaccggcat tgctttgact 720gcaatggaag aattgctcag gcttcttcag acaaatgaac ctctatggac aagaacagat 780ggctgcagag acattctcaa tcttggtagc tatgagaatg ttttcccaag atcaagtaac 840cgagggaaga accagaactt tcgagtcgaa gcatcaaggt cttctggtat tgtcttcatg 900aatgctatgg cacttgtcga catgttcatg gattgtgtca agtggacaga actctttccc 960tctatcattg cagcttctaa aacacttgca gtgatttctt caggaatggg aggtacccat 1020gagggtgcat tgcatttgtt gtatgaagaa atggaagtgc tttcgccttt agtagcaaca 1080cgcgaattct gcgagctacg ctattgtcaa cagactgaac aaggaagctg gatagttgta 1140aacgtctcat atgatcttcc tcagtttgtt tctcactctc agtcctatag atttccatct 1200ggatgcttga ttcaggatat gcccaatgga tattccaagg ttacttgggt tgaacatatt 1260gaaactgaag aaaaagaact ggttcatgag ctatacagag agattattca cagagggatt 1320gcttttgggg ctgatcgttg ggttaccact ctccagagaa tgtgtgaaag atttgcttct 1380
ctatcggtac cagcgtcttc atctcgtgat ctcggtggag tgattctatc accggaaggg 1440aagagaagca tgatgagact tgctcagagg atgatcagca actactgttt aagtgtcagc 1500agatccaaca acacacgctc aaccgttgtt tcggaactga acgaagttgg aatccgtgtg 1560actgcacata agagccctga accaaacggc acagtcctat gtgcagccac cactttctgg 1620cttcccaatt ctcctcaaaa tgtcttcaat ttcctcaaag acgaaagaac ccgtcctcag 1680tgggatgttc tttcaaacgg aaacgcagtg caagaagttg ctcacatctc aaacggatca 1740catcctggaa actgcatatc ggttctacgt ggatccaatg caacacatag caacaacatg 1800cttattctgc aagaaagctc aacagactca tcaggagcat ttgtggtcta cagtccagtg 1860gatttagcag cattgaacat cgcaatgagc ggtgaagatc cttcttatat tcctctcttg 1920tcctcaggtt tcacaatctc accagatgga aatggctcaa actctgaaca aggaggagcc 1980tcgacgagct caggacgggc atcagctagc ggttcgttga taacggttgg gtttcagata 2040atggtaagca atttaccgac ggcaaaactg aatatggagt cggtggaaac ggttaataac 2100ctgataggaa caactgtaca tcaaattaaa accgccttga gcggtcctac agcttcaact 2160acagcttga 2169<210>2<211>722<212>PRT<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Ser Phe Val Val Gly Val Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly1 5 10 15Asp Gly Gly Gly Ser His His His Asp Gly Ser Glu Thr Asp Arg Lys20 25 30Lys Lys Arg Tyr His Arg His Thr Ala Gln Gln Ile Gln Arg Leu Glu35 40 45Ser Ser Phe Lys Glu Cys Pro His Pro Asp Glu Lys Gln Arg Asn Gln50 55 60Leu Ser Arg Glu Leu Gly Leu Ala Pro Arg Gln Ile Lys Phe Trp Phe65 70 75 80
Gln Asn Arg Arg Thr Gln Leu Lys Ala Gln His Glu Arg Ala Asp Asn85 90 95Ser Ala Leu Lys Ala Glu Asn Asp Lys Ile Arg Cys Glu Asn Ile Ala100 105 110Ile Arg Glu Ala Leu Lys His Ala Ile Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro115 120 125Pro Val Ser Glu Asp Pro Tyr Phe Asp Glu Gln Lys Leu Arg Ile Glu130 135 140Asn Ala His Leu Arg Glu Glu Leu Glu Arg Met Ser Thr Ile Ala Ser145 150 155 160Lys Tyr Met Gly Arg Pro Ile Ser Gln Leu Ser Thr Leu His Pro Met165 170 175His Ile Ser Pro Leu Asp Leu Ser Met Thr Ser Leu Thr Gly Cys Gly180 185 190Pro Phe Gly His Gly Pro Ser Leu Asp Phe Asp Leu Leu Pro Gly Ser195 200 205Ser Met Ala Val Gly Pro Asn Asn Asn Leu Gln Ser Gln Pro Asn Leu210 215 220Ala Ile Ser Asp Met Asp Lys Pro Ile Met Thr Gly Ile Ala Leu Thr225 230 235 240Ala Met Glu Glu Leu Leu Arg Leu Leu Gln Thr Asn Glu Pro Leu Trp245 250 255Thr Arg Thr Asp Gly Cys Arg Asp Ile Leu Asn Leu Gly Ser Tyr Glu260 265 270Asn Val Phe Pro Arg Ser Ser Asn Arg Gly Lys Asn Gln Asn Phe Arg275 280 285Val Glu Ala Ser Arg Ser Ser Gly Ile Val Phe Met Asn Ala Met Ala290 295 300Leu Val Asp Met Phe Met Asp Cys Val Lys Trp Thr Glu Leu Phe Pro305 310 315 320Ser Ile Ile Ala Ala Ser Lys Thr Leu Ala Val Ile Ser Ser Gly Met325 330 335
Gly Gly Thr His Glu Gly Ala Leu His Leu Leu Tyr Glu Glu Met Glu340 345 350Val Leu Ser Pro Leu Val Ala Thr Arg Glu Phe Cys Glu Leu Arg Tyr355 360 365Cys Gln Gln Thr Glu Gln Gly Ser Trp Ile Val Val Asn Val Ser Tyr370 375 380Asp Leu Pro Gln Phe Val Ser His Ser Gln Ser Tyr Arg Phe Pro Ser385 390 395 400Gly Cys Leu Ile Gln Asp Met Pro Asn Gly Tyr Ser Lys Val Thr Trp405 410 415Val Glu His Ile Glu Thr Glu Glu Lys Glu Leu Val His Glu Leu Tyr420 425 430Arg Glu Ile Ile His Arg Gly Ile Ala Phe Gly Ala Asp Arg Trp Val435 440 445Thr Thr Leu Gln Arg Met Cys Glu Arg Phe Ala Ser Leu Ser Val Pro450 455 460Ala Ser Ser Ser Arg Asp Leu Gly Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Gly465 470 475 480Lys Arg Ser Met Met Arg Leu Ala Gln Arg Met Ile Ser Asn Tyr Cys485 490 495Leu Ser Val Ser Arg Ser Asn Asn Thr Arg Ser Thr Val Val Ser Glu500 505 510Leu Asn Glu Val Gly Ile Arg Val Thr Ala His Lys Ser Pro Glu Pro515 520 525Asn Gly Thr Val Leu Cys Ala Ala Thr Thr Phe Trp Leu Pro Asn Ser530 535 540Pro Gln Asn Val Phe Asn Phe Leu Lys Asp Glu Arg Thr Arg Pro Gln545 550 555 560Trp Asp Val Leu Ser Asn Gly Asn Ala Val Gln Glu Val Ala His Ile565 570 575Ser Asn Gly Ser His Pro Gly Asn Cys Ile Ser Val Leu Arg Gly Ser580 585 590
Asn Ala Thr His Ser Asn Asn Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Ser Thr595 600 605Asp Ser Ser Gly Ala Phe Val Val Tyr Ser Pro Val Asp Leu Ala Ala610 615 620Leu Asn Ile Ala Met Ser Gly Glu Asp Pro Ser Tyr Ile Pro Leu Leu625 630 635 640Ser Ser Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Gly Asn Gly Ser Asn Ser Glu645 650 655Gln Gly Gly Ala Ser Thr Ser Ser Gly Arg Ala Ser Ala Ser Gly Ser660 665 670Leu Ile Thr Val Gly Phe Gln Ile Met Val Ser Asn Leu Pro Thr Ala675 680 685Lys Leu Asn Met Glu Ser Val Glu Thr Val Asn Asn Leu Ile Gly Thr690 695 700Thr Val His Gln Ile Lys Thr Ala Leu Ser Gly Pro Thr Ala Ser Thr705 710 715 720Thr Ala
权利要求
1.一种培育抗逆转基因水稻的方法，是将AtHD/START1基因通过植物表达载体导入水稻中，筛选得到抗逆性提高的水稻；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因的编码序列是序列表中的序列1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表达载体中启动外源基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通过植物表达载体pCB2004C导入水稻中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表达载体pCB2004C的的attR1和attR2之间。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表达载体中启动外源基因转录的启动子是水稻actin1启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通过植物表达载体pCB2006导入水稻中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表达载体pCB2006的的attR1和attR2之间。
9.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
10.根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述水稻为水稻中花11。
全文摘要
本发明公开了一种培育抗逆转基因水稻的方法。该方法是将AtHD/START1基因通过植物表达载体导入水稻中，筛选得到抗逆性提高的水稻；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)相同活性的由(a)衍生的蛋白质。转AtHD/START1基因水稻株系(转化体)的耐旱性明显高于对照(未转基因水稻)株系。
文档编号C12N15/82GK1944646SQ20061011432
公开日2007年4月11日 申请日期2006年11月6日 优先权日2006年11月6日
发明者向成斌, 陈曦 申请人:中国科学技术大学