用于检测蛔虫卵的实时荧光pcr引物和探针的利记博彩app

专利名称：用于检测蛔虫卵的实时荧光pcr引物和探针的利记博彩app
技术领域：
本发明属于流行病学和食品卫生检测领域，具体而言，本发明涉及用于检测植物源性产品中寄生虫卵的实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方法，更具体地说，是对植物源性产品中携带的蛔虫卵进行检测的实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方法。
背景技术：
人类寄生虫的数量高达数百种，对人类健康构成潜在威胁。很多动物寄生虫也可危害人类健康。人类食入被寄生虫卵污染的蔬菜后，可引起幼虫移行症等发生，日本已经报道多起人感染猪蛔虫的事件。国内曾开展线虫污染蔬菜情况的调查，发现国内市场销售的多种所谓“清洁蔬菜”也携带寄生虫，因此，人及动物的寄生虫卵可能是一类对我国蔬菜进出口影响重大的、过去被忽视的安全卫生问题。目前，全世界在倡导采用有机粪肥替代化学肥料的绿色种植业。鉴于中国农村的卫生状况及蔬菜种植方式，从理论上讲，寄生虫卵污染新鲜及冷藏蔬菜的可能性更大，若不解决泡菜携带寄生虫虫卵问题并研制相关检验手段，将对人类健康构成潜在威胁，并有可能波及到其他腌渍菜、新鲜及冷藏蔬菜乃至动物性食品的出口，必将对我国食品出口造成灾难性打击。
在污染蔬菜的几种寄生虫卵中，以蛔虫卵的几率很大，我国曾报道蔬菜携带蛔虫卵的情况并引起蛔虫病暴发的情况，如国内曾有人群因生食带有感染期卵的甘薯、胡萝卜、、瓜果、生菜、泡菜等腌菜后，引起暴发性蛔虫性哮喘的报道，也说明蛔虫非常容易污染蔬菜。
这是因为蛔虫生活史简单，不需中间宿主，而且蛔虫产卵量大，雌蛔虫一昼夜排出的虫卵约234000-245000个，因此，在人粪中的虫卵数量巨大，虫卵对外界环境抵抗力强；在荫蔽的土壤中或蔬菜上，一般可活数月至一年；食用醋、酱油或腌菜、泡菜的盐水，不能将虫卵杀死。蛔虫卵对一些化学药物具有抵抗力，主要是由于卵壳蛔甙层的保护作用，如10％的硫酸、福尔马林、盐酸、硝酸或磷酸溶液均不能影响蛔虫卵内幼虫的发育。
传统上，蛔虫虫卵的种类鉴定多是采用人兽粪便，经过离心、漂浮等集卵方式处理后，直接采用显微镜进行观察。对于泡菜等产品中携带的蛔虫卵而言，由于泡菜汁液的长期浸泡，外形会发生一定的变化(如外层的蛋白膜不完全脱落等)，这给识别带来了一定困难；同时，泡菜中的大白菜等植物的很多组织和细胞在外形上和蛔虫卵也不容易分辨，常规的显微镜形态学鉴定技术已经不能满足泡菜等产品中蛔虫卵的检测需要。这都需要一种更加敏感、特异的检测方法。特别是单虫卵的寄生线虫种类鉴定方法。
由于寄生虫的种类繁多，但是ITS等DNA序列差异却很小，采用传统的PCR方法很难区分。Zhu等以ITS-2为模板，采用PCR-RFLP(限制性酶切片段长度多态性)方法，对形态上非常相似的人蛔虫和猪蛔虫进行了区分。Jacobs等指出，在形态上非常相似的犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和狮弓首蛔虫的ITS可以为这3种寄生虫提供种特异性遗传标记。根据这些标记，利用PCR-RFLP方法，这3种寄生虫可以彼此准确区分，并且可以与其他寄生于犬体内的寄生虫进行区分。以上研究都是采用PCR-RFLP方法，即根据ITS核酸序列的差异，采用PCR反应后酶切、然后电泳的方法进行的，很是耗时费力，而且对DNA的起始量要求较高，无法在单个虫卵水平上进行操作。
荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异性强(在普通PCR一对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引物和探针均完全配对，才可能得到扩增，可对少至2个核苷酸的序列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方便(无须凝胶电泳，避免了EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。目前，荧光PCR技术在寄生虫学领域的应用很少，无疑有着广阔的发展空间。
泡菜等食品中蛔虫卵检测方法的建立同时也适用于其它寄生虫卵的检测，还可为组织中携带的其它寄生虫(如囊尾蚴)、细菌等的检测、鉴定所借鉴。这既是加强出入境检疫工作、打破相关技术贸易壁垒的需要，也是消除食品安全隐患、保障国民身体健康的需要。开展蛔虫卵的分子鉴定技术研究，不仅具有重要的学术意义，而且具有明显的经济价值和社会效益。

发明内容
本发明目的在于提供用于泡菜等植物源性产品中携带的蛔虫卵检测的荧光PCR引物和探针序列。
本发明的目的通过下述技术方案实现从Genebank中获得猪蛔虫和人蛔虫18S-28SrDNA基因序列(NO.AB110029、AB110030)，应用MegAlign软件分析其基因序列，根据引物和探针的设计原则，用Beacon Designer 5.0在这些序列的保守区域筛选到一对具有相同碱基序列的通用引物。并在该引物对的扩增区域内设定一条通用的荧光TaqMan探针。报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同DNA模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对蛔虫卵的检测。
一方面，本发明提供了用于对植物源性产品中蛔虫卵进行实时荧光PCR检测的引物对和荧光素探针，其中所述的引物对特异性针对猪和人蛔虫18S-28S rDNA基因的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。
在本发明的一个优选实施方案中，其中所述的特异性地针对蛔虫超科保守基因的引物对和探针的核苷酸序列为蛔虫卵特异性的正向引物序列为5′-TGCGATAAATAGTGCGAATTGC-3′，正向引物的反向互补序列为GCAATTCGCACTATTTATCGCA，反向引物序列为5′-TCTTTCAATAATTCAACCCTCAGC-3′，反向引物的反向互补序列为GCTGAGGGTTGAATTGAAAGA，以及该引物对的上游引物向5’延伸10个碱基、下游引物向3’延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列及互补序列；探针设计为特异性地针对待扩增序列间的高GC含量区，序列为5′-ACGTGCCAACGGGAATGAACCC-3′，5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。探针的反向互补序列为GGGTTCATTCCCGTTGGCACGT以及该探针向5’延伸10个碱基、向3’延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。
蛔虫卵特异性的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特异性。结果表明蛔虫卵特异性的引物和探针设计区域为蛔虫超科寄生虫所特有，没有发现同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。
一个优选实施方案中，所述报告荧光染料为FAM，所述淬灭荧光染料为Eclipse。
在一个优选实施方案中，所述引物对扩增产物长度为87bp。
优选地，其中所述的植物源性产品为其中含有在显微镜下与寄生虫卵或虫体不易区分的组织或细胞的植物源性产品。更优选，包括但不限于，例如，泡菜或辣椒酱。
泡菜等植物源性产品中携带的蛔虫卵的荧光PCR检测采用如下步骤进行在蛔虫超科寄生虫的18S-28S rDNA基因序列及相应区域内设计引物对和探针，引物对和探针合成后分别进行稀释并确定反应需要量，通过调整反应体系中的镁离子浓度和对退火温度进行优化，以蛔虫组织DNA或者蛔虫卵为检测样本，确定荧光PCR检测蛔虫卵的最佳反应体系和反应条件，采用不同数量的蛔虫卵作为模板进行敏感性试验，采用其它的动植物寄生虫或者线虫作为对照进行特异性试验，以确保所建立检测方法的实际应用效果。
另一方面，本发明提供了对植物源性产品中蛔虫卵进行检测的实时荧光PCR检测方法，其中包括1)从植物源性产品中分离疑似蛔虫卵，放入PCR管；2)通过液氮反复冻融对蛔虫卵样品进行前处理；3)向经过处理的蛔虫卵样品加入上述引物对和荧光标记探针以及PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液、MgCl2、ddH2O及聚合酶，得到PCR扩增反应液；4)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；5)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；6)根据各样本的反应Ct值，按照蛔虫卵阳性判定标准判定待检样本中是否存在蛔虫卵。
一个实施方案中，所述的从植物源性产品中分离疑似蛔虫卵包括i)洗脱用SDS溶液充分清洗，合并洗脱液备用；ii)过滤过滤洗脱液，留取滤液备用，如果为流体产品，也可不经洗脱直接过滤；iii)离心将滤液1500g离心，加去离子水洗涤，离心取沉淀备用；iv)漂浮在沉淀物中加入饱和食盐溶液，振荡混匀，1500g离心，使疑似虫卵的漂浮物上浮于液面；v)疑似虫卵分离小心吸取液面上的漂浮物，加于1％低熔点琼脂糖胶上，10×物镜观察，用灭菌针头挑取含疑似虫卵小胶块，放于PCR管内备用。
在一个实施方案中，其中所述的植物源性产品为泡菜，所述洗脱用的SDS溶液优选为0.5％SDS溶液。其中所述过滤优选使用40目筛(筛网孔径0.2mm以上)过滤。
一个优选实施方案中，对分离的蛔虫卵的前处理采用液氮反复冻融法，简而言之为，向装有蛔虫卵的PCR管内加入超纯水，瞬时离心，液氮冷冻1min，转入37℃微量恒温器1min，重复上述步骤14-15次，瞬时离心。
一个优选实施方案中，所述荧光PCR扩增条件为94℃ 5min；94℃ 5s，51℃ 10s，45个循环。
一个优选实施方案中，所述的猪链球菌2型致病性判定标准为如果扩增曲线的Ct值＜30，判定待检物质为蛔虫卵，否则待检物质不是蛔虫卵。
另一方面，提供了本发明所述引物对和荧光探针在检测及鉴定植物源性产品中寄生虫卵中的用途，特别是蛔虫超科寄生虫的虫卵。
另一方面，提供了本发明所述引物对和荧光探针在制备用于检测及鉴定植物源性产品中寄生虫卵的试剂中的用途，特别是蛔虫超科寄生虫的虫卵。


图1图示的是荧光PCR对猪蛔虫卵的敏感性实验结果。图中曲线1为阳性对照；曲线2-6分别代表当采用5、4、3、2、1个蛔虫卵作为模板时的扩增情况；曲线7为阴性对照。
图2图示的是荧光PCR检测蛔虫卵的特异性实验结果。
图3图示的是荧光PCR方法对模拟阳性泡菜样品中的猪蛔虫卵的检测结果。其中曲线1代表阳性对照，曲线2和3均为检测样品，曲线4为阴性对照。
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
实施例实施例1引物和探针的制备1.1引物和探针的设计和合成根据猪蛔虫和人蛔虫18S-28S rDNA基因的公开序列(GenBank NO.AB110029和AB110030)，应用MegAlign软件分析其基因序列，根据引物和探针的设计原则，用BeaconDesigner 5.0在这些序列的保守区域筛选到一对具有相同碱基序列的通用引物。并在该引物对的扩增区域内设定一条通用的荧光TaqMan探针。
引物序列为P1(正向)5′-TGCGATAAATAGTGCGAATTGC-3′P2(反向)5′-TCTTTCAATAATTCAACCCTCAGC-3′，扩增产物长度为87bp；所述探针的序列为5′-ACGTGCCAACGGGAATGAACCC-3′
该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料Eclipse标记。
该探针的设计针对于所扩增序列间的高GC含量区。
1.2引物和探针的准备引物和探针合成后，引物稀释为10μmol/l，探针稀释为20μmol/l，上、下游引物和探针按照1∶1∶1等体积混合后，将引物+探针混合液-20℃避光保存备用。
实施例2荧光PCR检测方法的建立2.1泡菜中疑似蛔虫卵的分离I.洗脱取泡菜(含汤汁部分)样品200克放入大烧杯内，用1.0L 0.5％SDS溶液分3次充分清洗每个叶片，合并洗脱液备用。
II.过滤将洗脱液用40目筛(筛网孔径0.2mm以上)过滤，并用去离子水清洗筛网上的残渣，留取滤液备用；如果检验辣椒酱等流体产品，则可直接过筛，并用0.5％SDS溶液冲洗残渣。
III.离心将滤液1500g离心10min，小心倒去上清液，加入去离子水洗涤、离心2次，取沉淀备用。
IV.漂浮在沉淀物中加入5倍体积的饱和食盐溶液，用振荡器旋涡混匀，1500g离心20min，使虫卵上浮于液面。
V.低熔点琼脂糖制备配制1％低熔点琼脂糖分离胶，微波炉加热融化，取200μl均匀涂布于载玻片上，待胶冷却凝固后，用医用手术刀将凝胶切成小块，4℃湿盒保存备用。
VI.疑似虫卵分离采用大口径的吸管(也可将1.0ml吸头切去尖端而成)，与液面平行接触、小心吸取漂浮液顶部的漂浮物，加于低熔点琼脂糖胶上，10×物镜观察，用灭菌针头挑取含疑似虫卵小胶块，放于PCR管内备用。
2.2荧光PCR反应体系及反应条件的建立采用上述方法从泡菜中分离出单个疑似虫卵，放于PCR管内，然后在管内加入4μl超纯水，瞬时离心，液氮冷冻1min，转入37℃微量恒温器1min，重复冻融15次；瞬时离心后，加入扩增反应所需的试剂组成表1所示的反应体系，反应同时设置阴性对照(以无菌水代替DNA模板进行)。
表1.泡菜中蛔虫卵检测的荧光PCR反应体系

反应液配好后，瞬时离心，将样品管放入Real-time PCR仪后，采用如下条件进行反应94℃5min；94℃5s，51℃10s，45个循环；循环结束后，根据扩增曲线判定结果。
2.3结果判定采用已知的单个猪蛔虫卵进行荧光PCR检测发现，荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数(Ct)小于30。据此，泡菜等植物源性产品中携带蛔虫卵的PCR检测标准设定为如果阴性对照Ct＞40或者没有扩增曲线，阳性对照Ct值＜30，则判定实验成立。在实验成立的基础上，如果扩增曲线的Ct值＜30，判定待检物质为蛔虫卵，否则不是蛔虫卵。
实施例3.蛔虫卵荧光PCR检测方法的敏感性试验在PCR反应管中分别加入1-5个猪蛔虫卵，以提取的猪蛔虫DNA作为阳性对照，以灭菌ddH2O作为阴性对照，确定上述蛔虫卵荧光PCR检测方法对虫卵的敏感程度。
3.1猪蛔虫卵的收集采用饱和食盐水漂浮法进行。具体操作为取从猪场采集的粪便10克，加饱和食盐水100ml，混合，通过250μm(60目)铜筛，滤入烧杯中，静置半小时或低速离心10min，则虫卵上浮，用一直径5-10mm的铁丝圈，与液面平行接触以沾取表面液膜，抖落于预先加有少量灭菌水的载玻片上，待检。
3.2单个虫卵的分离采用有限稀释法分离单个虫卵，操作步骤如下显微镜下，调整载玻片观察，发现虫卵后，用移液器吸取虫卵，将其转移至另一预先加有灭菌水的载玻片上，加水，用移液器轻轻吹打，使虫卵和粪渣分离，直至整个视野中只有虫卵存在，用0.5μl枪头吸取单个虫卵至PCR管中。
3.3蛔虫卵的前处理向5支分别装有1、2、3、4或5个猪蛔虫卵的PCR管内各加入4μl超纯水，瞬时离心，液氮冷冻1min，转入37℃微量恒温器1min，重复上述步骤14次，瞬时离心。
3.4蛔虫卵的荧光PCR反应体系(μl)向上述PCR管中加入下列扩增反应所需的试剂组成反应体系10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5μl、MgCl2(25mM)3μl、dNTP(各25mM)2μl、引物和探针1.5μl、rTaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，加入灭菌水使反应体系的总体积为25μl。
3.5荧光PCR反应条件94℃5min；94℃5s，51℃10s，45个循环。
3.6反应结果反应过程中，仪器自动检测各反应管中探针水解后释放出的荧光信号并作出反应曲线(如图1)。从图中可以看出，试验样品中虫卵个数分别为1-5个，随着虫卵数的减少，荧光信号到达仪器自己设定的阈值所经历的循环数(Ct值)增加，但均在22.13-25.82范围之间，而且在单个虫卵或多个虫卵的检测中不存在显著差异，说明单个蛔虫卵所含模板拷贝数能够满足检测的需要。
实施例4.蛔虫卵荧光PCR检测方法的特异性试验分别以污染植物源性产品几率较高的鞭虫卵、毛圆线虫卵及植物的腐烂茎线虫卵等为对照样品，同时以提取的猪蛔虫DNA作为阳性对照，以灭菌ddH2O作为阴性对照，检验基于蛔虫卵基础上的荧光PCR检测方法的特异性。
4.1实验材料猪蛔虫卵(同前述)、鞭虫卵(本研究室自猪粪便中分离)、毛圆线虫卵(自羊的粪便中分离获得)、植物腐烂茎线虫卵(动植物检疫研究所植物检疫研究室分离后鉴定、保存)。
4.2样品前处理分别取1个上述虫卵放于PCR管内，加入4μl超纯水，瞬时离心，液氮冷冻1min，转入37℃微量恒温器1min，重复上述步骤14次，离心。
4.3荧光PCR反应体系及反应条件同实施例3中的3.4和3.5部分。
4.4反应结果反应过程中，仪器自动检测各反应管中探针水解后释放出的荧光信号并作出反应曲线(如图2)。由图2可见，采用本发明所述的液氮反复冻融法对包括猪蛔虫卵在内的四种虫卵进行前处理后，荧光PCR检测发现，只有蛔虫卵反应呈阳性(Ct为28.94)，其余均为阴性，表明本发明所设计的引物、探针及采用的反应条件能够满足特异性检测的需要，并且与检测样品中可能存在的其它虫卵不存在交叉干扰现象。
实施例5.荧光PCR方法对模拟阳性泡菜样品中猪蛔虫卵的检测本实验采用掺入猪蛔虫卵的模拟阳性泡菜样品进行实验，以验证本研究所建立的泡菜中蛔虫卵的分离和荧光PCR鉴定方法对于泡菜样品中携带的蛔虫卵的检验效果。
5.1模拟阳性泡菜样品的准备取市售泡菜样品，按照2000个猪蛔虫卵/200g泡菜掺入猪蛔虫卵后，4℃保存备用。
5.2泡菜中寄生虫卵的分离按照实施例2中所述漂浮法，从模拟阳性泡菜中分离出2个疑似猪蛔虫卵，按照“一管一卵”原则，分别放入2个PCR管内。
5.3荧光PCR检测泡菜中分离的单个蛔虫卵虫卵前处理及荧光PCR反应体系和条件同实施例2。同时设置以双蒸水作为模板的阴性对照。
5.4实验结果反应过程中，仪器自动检测各反应管中探针水解后释放出的荧光信号并作出反应曲线(见图3)。对模拟样品中分离出的2个蛔虫卵检测阳性率达100％，说明分离的2个疑似虫卵均为蛔虫卵，也说明本检测方法完全适合对泡菜等植物源性产品中携带的蛔虫卵进行检测，不受泡菜汁液对虫卵的影响。
权利要求
1.用于对植物源性产品中蛔虫卵进行实时荧光PCR检测的引物对和荧光素探针，其中所述的引物对特异性针对猪和人蛔虫18S-28S rDNA基因的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。
2.权利要求1所述的引物对和探针，其中所述引物对的序列为正向引物P15′-TGCGATAAATAGTGCGAATTGC-3′；反向引物P25′-TCTTTCAATAATTCAACCCTCAGC-3′；其中所述探针的序列为5′-ACGTGCCAACGGGAATGAACCC-3′，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料Eclipse标记。
3.权利要求1或2所述的引物对和探针，其中所述的植物源性产品为其中含有在显微镜下与寄生虫卵或虫体不易区分的组织或细胞的植物源性产品。
4.权利要求3所述的引物对和探针，其中所述的植物源性产品为泡菜或辣椒酱。
5.一种对植物源性产品中蛔虫卵进行检测的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤1)从植物源性产品中分离疑似蛔虫卵，放入PCR管；2)通过液氮反复冻融对蛔虫卵样品进行前处理；3)向经过处理的蛔虫卵样品加入权利要求1所述引物对和荧光素标记探针以及PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液、MgCl2、ddH2O及聚合酶，得到PCR扩增反应液；4)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；5)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；6)根据各样本的反应Ct值，按照蛔虫卵阳性判定标准判定待检样本中是否存在蛔虫卵。
6.权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，该方法使用权利要求2所述的引物对及探针。
7.权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述的从植物源性产品中分离疑似蛔虫卵包括1)洗脱用SDS溶液充分清洗，合并洗脱液备用；2)过滤过滤洗脱液，留取滤液备用，如果为流体产品，也可不经洗脱直接过滤；3)离心将滤液1500g离心，加去离子水洗涤，离心取沉淀备用；4)漂浮在沉淀物中加入饱和食盐溶液，振荡混匀，1500g离心，使疑似虫卵的漂浮物上浮于液面；5)疑似虫卵分离小心吸取液面上的漂浮物，加于1％低熔点琼脂糖胶上，10×物镜观察，用灭菌针头挑取含疑似虫卵小胶块，放于PCR管内备用。
8.权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，其中荧光PCR扩增条件为94℃5min；94℃5s，51℃10s，45个循环。
9.权利要求5所述的多重实时荧光PCR检测方法，其中所述的猪链球菌2型致病性判定标准为如果扩增曲线的Ct值＜30，判定待检物质为蛔虫卵，否则待检物质不是蛔虫卵。
10.权利要求1或2所述引物对和探针在制备用于检测及鉴定植物源性产品中寄生虫卵的试剂中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于检测蛔虫卵的实时荧光PCR引物和探针以及使用其进行检测的方法。蛔虫卵为泡菜等植物源性产品中最容易污染的寄生虫卵，由于数量较少，而且受泡菜汁液的浸泡，因而难以直接借助显微镜进行形态学鉴定。通过设计蛔虫超科寄生虫的引物和探针，从泡菜中分离疑似寄生虫卵，并进行液氮反复冻融的基础上进行荧光PCR操作，可对从泡菜中分离出的疑似蛔虫卵进行鉴定，从而提高了鉴定的准确性。敏感性可以满足单个虫卵的鉴定需要，而且特异性强，与其它寄生虫、植物线虫卵没有交叉反应。
文档编号C12Q1/68GK1932034SQ20061010957
公开日2007年3月21日 申请日期2006年8月10日 优先权日2006年8月10日
发明者吴绍强, 林祥梅, 陈洪俊, 韩雪清, 葛建军, 朱水芳, 梅琳, 刘建, 贾广乐, 孙晓智, 石鑫 申请人:中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所