专利名称：经培养的胰腺细胞及其培养方法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及干细胞，尤其涉及从糖尿病动物(特别是哺乳动物)胰腺组织分离得到的胰岛细胞团中培养和扩增胰岛干细胞，并将其进一步诱导分化成为胰腺内分泌细胞的方法。
背景技术：
从1998年，James Thomson首次成功分离培养人胚胎干细胞以来，由于干细胞对将来疾病的治疗有着重要的应用前景，因此干细胞技术毋庸质疑已成为当今生物科技领域的研究热点之一。而中国目前有3000多万糖尿病患者，而且正以每年75万新患者的速率递增，糖尿病现已成为心脑血管病、肿瘤之后的“人类第3大杀手”严重危及人类健康。I型糖尿病(其也被称作胰岛素依赖型糖尿病)的患者必须每天依靠注射胰岛素来维持。虽然最近在加拿大Edmonton，研究人员采用新的免疫抑制疗法使胰岛移植取得很好的疗效，但该疗法仍然没有解决组织供体来源不足的问题。
干细胞是一类能够自我复制、自我更新并具有分化为相应组织细胞潜能的细胞，因此发现一种能够在体外大量扩增并能分化为胰岛β细胞的干细胞，已成为目前的一个研究重点。
目前研究已证实，在体外可分化为胰岛β细胞的干细胞主要有以下三类胚胎干细胞(ES)、胰腺腺管来源的干细胞和胰岛来源的干细胞。有关研究细节在Shi，Y.，Hou，L.，Tang，F.，Jiang，W.，Wang，P.，Ding，M.，& Deng，H.(2005).Inducing embryonic stem cells todifferentiate into pancreatic β-cells by a novel three-step approach withactivin A and all-trans retinoic acid.Stem Cells，2005，23，656-662.；Bonner-Weir，S.，Taneja，M.，Weir，G.C.，Tatarkiewicz，K.，Song，K.H.，Sharma，A.，& O’Neil，J.J.(2000).In vitro cultivation of humanislets from expanded ductal tissue.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United State of America，97，7999-8004.；Huang，H.X.，& Tang，X.M.(2003).Phenotypic determination andcharacterization of nestin-positive precursors derived from human fetalpancreas.Laboratory Investigation，83，539-547.；Wu，F.，Jagir，M.，&Powell，J.S.(2004).Long-term correction of hyperglycemia in diabeticmice after implantation of cultured human cells derived from fetalpancreas.Pancreas，29，e23-e29.；Zulewski，H.，Abraham，E.J.，Gerlach，M.J.，Daniel，P.B.，Moritz，W.，Muller，B.，Vallejo，M.，Thomas，M.K.，& Habener，J.F.(2001).Multipotential nestin-positivestem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo intopancreatic endocrine，exocrine，and hepatic phenotypes.Diabetes，50，521-533.，等文章中已有详尽描述。
胚胎干细胞是一种全能干细胞，在适当的条件下它可分化为体内任何组织的体细胞。Lumelsky等人报道，通过体外五步诱导的方法，可将胚胎干细胞诱导分化为胰岛β细胞，而Shi等在他们的研究中报道，他们通过三步法可将胚胎干细胞诱导成为胰岛β细胞，并且这些细胞移植入糖尿病老鼠体内后可使动物的体重增加，存活时间延长，血糖下降。但是，由于胚胎干细胞存在目前尚无法解决的致瘤性问题，因此目前离临床运用还有一定的距离。
对于胰腺腺管来源的干细胞，Bonner-Weir等在他们的研究报告中报道，在胰腺的腺管中存在一种CK19阳性的干细胞，此种细胞在有KGF和Matrigel存在的情况下，可大量扩增并分化为胰岛β细胞。
对于胰岛来源的干细胞，Zulewski等报道，他们从正常胰腺的胰岛团中分离培养出了一种表达神经干细胞标志nestin蛋白(巢蛋白)的细胞，此种细胞可在体外大量扩增，并且可在exendin-4、activinA、HGF、Betacellulin和nicotiamide的作用下分化为胰腺内分泌细胞。
巢蛋白是一高分子量中间丝蛋白，在分化细胞中巢蛋白表达于纤维母细胞，而未见表达于上皮细胞，但在未分化始祖上皮细胞中却可见其表达，通过将表达有巢蛋白的胰腺导管未分化上皮样细胞诱导分化成胰岛细胞的1个亚群，证明巢蛋白是胰腺干细胞的1种分子标记物，它可能起着促进胰腺内分泌干细胞分化的作用。参见Peters K，Panienka R，Li J，Kloppel G，Wang R.Expression of stem cellmarkers and transcription factors during the remodeling of the ratpancreas after duct ligation.Virchows Arch 2005；44656-63。
Huang & Tang，2003；Zulewski et al.，2001文章中披露的胰腺干细胞为胰岛来源的成体干细胞。Zulewski等所用的组织为正常的人或鼠的胰腺组织。由于在实践中难以获得足够数量的正常的人胰腺组织，所以将该技术应用于临床时仍会面临来源不足的问题。
因此，需要解决胰岛移植中胰腺组织来源不足的问题，还需要解决异体移植中使用免疫抑制剂所带来的毒性问题。
发明内容
本发明的主要目的是用糖尿病动物自身残存的胰腺干细胞在体外分离培养扩增后，在诱导因子的作用下分化为有功能的成熟的胰岛β细胞，然后再移植入该动物或者其它动物体内。这种自体移植的方法，既解决了胰岛移植中胰腺组织来源不足的问题，也解决了异体移植中使用免疫抑制剂所带来的毒性问题。
本领域技术人员可以理解，利用根据本发明的方法获得的可分泌胰岛素的成熟的胰岛β细胞也可以进行异体移植，该异体移植的方法可以解决胰岛移植中胰腺组织来源不足的问题。
根据本发明的第一方面，提供了一种检测糖尿病动物胰腺组织中是否存在胰腺干细胞的方法，包括a)免疫组化检测，包括胰腺组织固定，制作石蜡包埋切片，封闭后接触一抗抗体，接触二抗抗体，然后封片观察，其中所述一抗抗体包括兔抗巢蛋白抗体；b)RT-PCR分析，包括提取总RNA，逆转录形成cDNA，然后利用引物进行PCR扩增；c)根据步骤a)和b)的结果确定糖尿病动物胰腺组织中是否存在胰腺干细胞。
根据本发明的第二方面，提供了一种从糖尿病动物胰腺组织中分离残存的胰岛细胞团的方法，包括以下步骤a)将胰腺组织剪碎成块；b)对块状的胰腺组织进行酶消化，然后终止消化；c)离心分离，去上清，清洗；d)得到分离后的胰岛细胞团。
根据本发明的第三方面，提供了一种胰岛干细胞的分离、培养的方法，包括以下步骤a)将从糖尿病动物胰腺组织中分离出的胰岛细胞团加入装有培养基A的培养皿中，培养2-5天；b)将悬浮的胰岛细胞接种于含有培养基B的培养皿中培养；c)经过6-20天，生长出星形胰岛干细胞；d)在所述星形胰岛干细胞将汇合时进行传代，得到胰岛干细胞。
所述培养基A包括基础培养基、缓冲液、血清、氨基酸和抗生素等。所述基础培养基包括RPMI 1640等；所述血清包括FBS等；所述缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、丙酮酸钠缓冲液等；所述氨基酸包括L-谷氨酸等；所述抗生素包括青霉素-链霉素等。培养基A的一个实例为RPMI 1640、8-15％FBS、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、1mM丙酮酸钠缓冲液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100ug链霉素；另一实例为RPMI 1640，FBS，HEPES(100X)，丙酮酸钠(100X)，L-glutamine(100X)，Antibiotic(100X)。当然，根据本发明披露的内容，本领域的技术人员可以根据本领域的常识和具体情况对培养基A的成分和数量做一些变动或修改，例如，基础培养基可以为DMEM，血清可以为马血清、新生牛血清，缓冲液可以为碳酸氢钠缓冲液，所有这些变动和修改都应包括在本发明的范围内。
所述培养基B包括基础培养基、缓冲液、血清、氨基酸、抗生素和生长因子。所述基础培养基包括RPMI 1640等；所述血清包括FBS等；所述缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、丙酮酸钠缓冲液等；所述氨基酸包括L-谷氨酸等；所述抗生素包括青霉素-链霉素等；所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等。培养基B的一个实例为RPMI 1640、8-15％FBS、10mM4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、1mM丙酮酸钠缓冲液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100ug链霉素、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-20ng/ml表皮细胞生长因子；另一实例为RPMI 1640，FBS，HEPES(100X)，丙酮酸钠，L-glutamine(100X)，Antibiotic(100X)，Human bFGF，Human EGF。当然，根据本发明披露的内容，本领域的技术人员可以根据本领域的常识和具体情况对培养基B的成分和数量做一些变动或修改，例如，基础培养基可以为DMEM，血清可以为马血清、新生牛(胎牛)血清，缓冲液可以为碳酸氢钠缓冲液，所有这些变动和修改都应包括在本发明的范围内。
根据本发明的第四方面，提供了一种诱导胰岛干细胞(PPC)或者胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法。联合使用胰高血糖素样生长因子(GLP-1)、肝细胞生长因子(HGF)、betacellulin和烟酰胺等诱导分化因子，诱导PPC分化为胰腺内分泌细胞。一种将胰岛干细胞培养成为胰腺内分泌细胞的方法，包括以下步骤a)将胰岛干细胞接种于含有培养基C的培养皿中，培养约2-5天；b)将培养基C更换为培养基D，但仍然在培养皿中，培养大约4-15天，得到可分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞。
其中所述培养皿为细菌培养皿或涂有0.01％多聚鸟氨酸或多聚赖氨酸的细胞培养皿。发明人发现，在第四方面的方法中，使用传统的细胞培养皿难以得到可分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞。当使用细菌培养皿或涂有0.01％多聚鸟氨酸或多聚赖氨酸的细胞培养皿时可以获得好的效果。
所述培养基C包括基础培养基、培养添加剂、白蛋白、抗生素和生长因子。其中所述基础培养基包括DMEM和NutrientMixture Ham’s F-12’；所述培养添加剂包括B27或者(胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸钠)ITS；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-链霉素；所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子。所述培养基C的一个实例为48％DMEM、48％NutrientMixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/L ITS(即5mg/L胰岛素+5mg/L转铁蛋白+5ml/L亚硒酸钠)、0.05％-0.2％BSA、100u青霉素-100ug链霉素、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-20ng/ml表皮细胞生长因子；另一实例为DMEM/F12 1∶1(8mM glucose)，B27(50X，GIBCO)，0.075％BSA，bFGF 20ng/ml，EGF 20ng/ml，Antibiotics(100X，GIBCO)。当然，本领域的技术人员可以根据本领域的常识和具体情况对培养基C的成分和数量做一些变动或修改，所有这些变动和修改都应包括在本发明的范围内。
所述培养基D包括基础培养基、培养添加剂、白蛋白、抗生素、有诱导功能的多肽和生长因子。所述基础培养基包括DMEM和Nutrient Mixture Ham’s F-12’；所述培养添加剂包括B27或者ITS(即胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸钠)；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-链霉素；所述多肽和生长因子包括烟酰胺、GLP-1、HGF、Betacellulin。所述培养基D的一个实例为48％DMEM、48％Nutrient Mixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/L ITS(即5mg/L胰岛素+5mg/L转铁蛋白+5mg/L亚硒酸钠)、0.05％-0.1％BSA、100u青霉素-100ug链霉素、10mM烟酰胺、10-100nM GLP-1、10ng/ml HGF、500pmol/L Betacellulin；另一实例为DMEM/F12 1∶1(5.6mM glucose)，B27(50X，GIBCO)，0.075％BSA，10mM nicotinamide，Antibiotics(100X，GIBCO)，GLP-1(7-36amide)，HGF，Betacellulin。当然，本领域的技术人员可以根据本领域的常识和具体情况对培养基D的成分和数量做一些变动或修改，所有这些变动和修改都应包括在本发明的范围内。
根据本发明的第五方面，提供了一种利用前述的从糖尿病动物胰腺组织中分离胰岛细胞团的方法得到的胰岛细胞团。
根据本发明的第六方面，提供了一种利用前述的胰岛干细胞的分离、培养的方法得到的胰岛干细胞。
根据本发明的第七方面，提供了一种利用前述的将胰岛干细胞培养成为胰腺内分泌细胞的方法得到的胰腺内分泌细胞。
根据下文结合附图进行的描述，本发明以及其另外的目的和优点将更为明了，其中图1A显示正常和糖尿病动物胰腺组织的RT-PCR结果。图1B显示正常猴胰腺组织中胰岛的免疫组化结果(a，c，e)和糖尿病猴胰腺组织中胰岛的免疫组化结果(b，d，f)。其中，a和b分别表示正常猴和糖尿病猴的胰岛β细胞情况；c和d分别表示正常猴和糖尿病猴的胰高血糖素细胞(α细胞)情况；e和f分别表示正常猴和糖尿病猴的δ细胞情况。结果显示糖尿病猴胰岛β细胞几乎全部被破坏(b和a)，胰高血糖素细胞明显增多，而分泌生长抑素的δ细胞无明显改变。图1C显示针对Nestin基因的免疫组化结果，a是正常猴的结果，b是糖尿病猴的结果。图1C显示，对于正常猴和糖尿病猴，胰腺组织中均有Nestin的表达，只是Nestin阳性细胞的分布有所变化，在正常猴的胰腺组织内，Nestin阳性细胞分布于胰腺腺管和胰岛团的周边，而在糖尿病猴的胰腺组织中，Nestin阳性细胞主要分布于胰岛内，并且数量明显增多。
图2A、2B、2C、2D显示胰岛、胰腺前体细胞和胰岛样细胞团的培养结果。其中图2A显示在Petri dish(细菌培养皿)中可见漂浮的圆形或椭圆形胰岛细胞团；图2B显示将得到的分离后的巢蛋白阳性的胰岛细胞团加入培养基A，接种于Petri dish中培养约3天的结果；图2C显示将图2B中所示的胰岛细胞团接种于含有培养基B的普通细胞培养皿中培养15天左右的结果；图2D显示将得到的星形胰岛干细胞(图2C所示)用0.25％的胰酶消化下来后，Hank’s液中洗1遍，然后将细胞接种于含有培养基C的细菌培养皿中3天，得到前类胰岛团样结构(pre-ICC)。
图3A为胰腺前体细胞(PPC)和ICC的RT-PCR结果。
图3B显示胰腺前体细胞，为巢蛋白阳性细胞。
图3C显示ICC中胰岛素阳性细胞主要分布于ICC的中央而胰高血糖素阳性细胞主要分布于ICC的周边。
图4A和4B显示Pre-ICCs、ICCs和正常胰岛团在30mM高糖刺激下胰岛素和C肽的分泌情况。其中图4A显示胰岛素的分泌情况，图4B显示C肽的分泌情况。
图5A-5D显示胰腺组织细胞在V型胶原酶中的消化和培养后得到的胰岛细胞团的照片。其中图5A显示消化5分钟，培养2天的结果；图5B显示消化5分钟，培养5天的结果；图5C显示消化10分钟，培养2天的结果；图5D显示消化10分钟，培养5天的结果。
图6A-6D显示根据实施例4在含培养基C和培养基D的培养皿中得到的类胰岛团样结构和胰腺内分泌细胞的照片。图6A显示在培养基C中培养2天得到的类胰岛团样结构，图6B显示在培养基C中培养5天得到的类胰岛团样结构。图6C显示在培养基D中培养10天得到的胰腺内分泌细胞，图6D显示在含培养基D中培养15天所得到的胰腺内分泌细胞。
图7显示正常和糖尿病动物胰腺组织的RT-PCR结果。
图8显示PPC和ICC的RT-PCR结果。
图9结果显示当ICC和成体胰岛在不同浓度的葡萄糖或在同时含有10mM L-精氨酸的刺激下，胰岛素和C-肽的分泌情况，其中图9A1显示ICC在存在不同浓度的葡萄糖或葡萄糖与10mM L-精氨酸同时存在的情况下胰岛素的分泌情况；图9A2显示成体胰岛在存在不同浓度的葡萄糖或葡萄糖与10mM L-精氨酸同时存在的情况下胰岛素的分泌情况；图9B1显示ICC在存在不同浓度的葡萄糖或葡萄糖与10mM L-精氨酸同时存在的情况下C-肽的分泌情况；图9B2显示成体胰岛在存在不同浓度的葡萄糖或葡萄糖与10mM L-精氨酸同时存在的情况下C-肽的分泌情况。
在以上图中，insulin表示胰岛素基因，Glucagon表示胰高血糖素基因，Somatostatin表示生长抑素基因，PDX-1表示胰十二指肠同源异型盒基因，nestin表示巢蛋白基因，β-actin表示β肌动蛋白基因，“-”、“Normal”表示正常猴，+STZ表示糖尿病猴，Glut-2表示葡萄糖转运蛋白-2基因，Pre-ICC表示进入培养基D之前的ICC，ICC表示经培养基D分化后的ICC，Islet表示胰岛。
具体实施例方式
对于患有糖尿病的动物(哺乳动物例如人或猴子)，由于其胰腺不能正常分泌胰岛素，人们认为不能或难以从患有糖尿病的动物的胰腺内分离出胰腺干细胞。如果从异体动物的正常的胰腺内分离出胰腺干细胞，不可能进行自体移植，排异反应的问题依然存在，并且从正常的胰腺内分离出的胰腺干细胞的来源问题也无法解决。
本发明的发明人发现在糖尿病动物的胰腺内仍然残存有巢蛋白阳性的胰腺干细胞。并且根据本发明提供的实施方式，已经成功地在体外分离和培养出这种细胞，该细胞具有以下干细胞的分子生物学特征巢蛋白基因表达阳性、ABCG2基因表达阳性，如图1A-1C所示。在有丝分裂原存在的情况下，这些细胞可长期扩增，在特殊诱导分化因子的作用下可分化为胰岛内分泌细胞。
ABCG2ABCG2是ABC超家族的一员，它不但使肿瘤细胞具有多种药物的耐药性，而且最近发现它在维持干细胞的单一特性方面(即不分化方面)也有重要作用，目前多数学者把它也看作干细胞的标志物之一。根据本发明的方法得到的胰腺干细胞中ABCG2基因表达阳性。
CK19细胞角质蛋白19(cytokeratin-19，CK-19)，Gmyr et al发现成人CK19阳性细胞能在体外再表达胰岛素促进因子1(insulinpromoter factor 1)，进一步表明人胰腺多能前体细胞的存在，也表明CK-19可能为胰腺前体细胞的分子标志之一。参见Gmyr V，Kerr-Conte J，Belaich S，Vandewalle B，Leteurtre E，Vantyghem MC，Lecomte-Houcke M，Proye C，Lefebvre J，Pattou F.Adult humancytokeratin 19-positive cells reexpress insulin promoter factor 1 invitrofurther evidence for pluripotent pancreatic stem cells in humans.Diabetes 2000；491671-1680。但是，根据本发明的方法得到的胰腺干细胞中CK19基因表达阴性。
pdx-1是胰十二指肠同源异型盒基因(pdx-1)，胰腺干细胞发育过程中表达的第1种分子标记是1种同源区蛋白，即PDX-1。pdx-1对于出现在肠内胚层背侧及腹侧的胰腺萌芽的生长分化起重要作用，pdx-1的纯合子缺失突变会导致胰腺无法形成。pdx-1阳性胚胎胰腺干细胞向胰腺内分泌细胞分化是多步骤的，pdx-1阳性导管样细胞也可产生外分泌腺泡细胞。根据本发明的方法得到的胰腺干细胞中pdx-1基因表达阴性。
ISL-1是一个重要的转录因子，它在胰岛细胞的形成方面起着重要的作用。它所编码的蛋白能够结合到胰岛素基因的增强区。在成体的所有胰腺内分泌细胞均有表达。根据本发明的方法得到的胰腺干细胞中ISL-1基因表达阴性。
Glut-2葡萄糖转运蛋白-2，是胰岛β细胞的特定标记物，它参与β细胞的增殖和对葡萄糖的识别和转运。根据本发明的方法得到的胰腺干细胞中Glut-2基因表达阴性。Somatostatin是生长抑素基因。
根据本发明，将来源于糖尿病动物自身的干细胞进行体外培养、分化，可以将其用于糖尿病动物的自体干细胞移植治疗，也可以用于糖尿病的基因治疗中的载体细胞。
本发明的发明人发现，虽然在糖尿病动物的胰岛内，β细胞被完全破坏，但通过3mg/ml V型胶原酶的消化，仍然可以分离出残存的胰岛细胞团，并且这些胰岛团贴壁后，可迅速长成单层扁平细胞，这些细胞在7-8天时开始死亡，但是同时一种多角的星状细胞开始迅速增殖，大概14-16天这些细胞可汇合。细胞免疫组化结果显示，这些多角形细胞为巢蛋白阳性细胞，但CK19染色为阴性，故这种多角的星状细胞是胰岛干细胞(PPC)。RT-PCR结果显示，这些细胞除表达巢蛋白外，还同时表达另外一种干细胞的标志ABCG2。当这些细胞达到汇合后，继续生长，可自发形成假胰岛团样结构(ICC)。当这些细胞在分化培养基中，诱导分化为ICC，免疫组化结果显示，在ICC结构中，胰岛素阳性细胞分布于ICC结构的中央，而胰高血糖素阳性细胞主要分布于ICC结构的周边。RT-PCR结果显示，与PPC的RT-PCR结果比较，巢蛋白基因、ABCG2基因表达减弱或消失，而胰岛相关基因开始表达，胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和PDX-1、ISL1、GLUT2等基因表达呈阳性，如图3A-C所示。本发明中所诱导分化得到的ICC在30mM的葡萄糖刺激下可合成分泌胰岛素和C肽，分泌量约为正常胰岛的1/8左右，如图4A、4B所示。
根据本发明的一种检测糖尿病动物胰腺组织中胰腺干细胞的方法，包括a)免疫组化检测，包括胰腺组织固定，制作石蜡包埋切片，封闭后接触一抗抗体，接触二抗抗体，然后封片观察，其中所述一抗抗体包括兔抗巢蛋白抗体；b)RT-PCR分析，包括提取总RNA，形成cDNA，然后利用引物进行PCR扩增；c)根据步骤a)和b)的结果确定糖尿病动物胰腺组织中是否存在胰岛干细胞。胰岛干细胞的主要标志是巢蛋白。如果糖尿病动物胰腺组织中是存在巢蛋白表达，则存在胰岛干细胞。
根据本发明的第二方面，提供了一种从糖尿病动物胰腺组织中分离残存的胰岛细胞团的方法，包括以下步骤a)将胰腺组织剪碎成块；b)对块状的胰腺组织进行酶消化，然后终止消化；c)离心分离，去上清，清洗；d)得到分离后的胰岛细胞团。
根据本发明的第三方面，提供了一种胰岛干细胞的分离、培养的方法，包括以下步骤a)将从糖尿病动物胰腺组织中分离出的胰岛细胞加入装有培养基A的培养皿中，培养2-5天；b)将悬浮的胰岛细胞接种于含有培养基B的培养皿中培养；c)经过6-20天，生长出星形胰岛干细胞；d)在所述星形胰岛干细胞将汇合时传代，直到长满传代后的培养皿，得到胰岛干细胞。
其中，培养基A包括RPMI 1640(厂家Invitrogen公司，加利福尼亚州，美国)、8-15％FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)(厂家Invitrogen公司)、10mM HEPES Buffer Solution(4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液)(厂家Invitrogen公司)、1mMSodium pyruvate(丙酮酸钠缓冲液)(厂家Invitrogen公司)、2mM L-glutamine(L-谷氨酸)(厂家Invitrogen公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-链霉素)(厂家Invitrogen公司)。所述培养基B包括RPMI 1640(厂家Invitrogen公司)、8-15％FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)(厂家Invitrogen公司)、10mM HEPES Buffer Solution(4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液)(厂家Invitrogen公司)、1mMSodium pyruvate(丙酮酸钠缓冲液)(厂家Invitrogen公司)、2mM L-glutamine(L-谷氨酸)(厂家Invitrogen公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-链霉素)(厂家Invitrogen公司)、10-20ng/ml Human RecombinantBasic Fibroblast Growth Factor(bFGF)(碱性成纤维细胞生长因子)(R&D Systems公司，明尼苏达州，美国)、10-20ng/ml HumanRecombinant Epidermal Growth Factor(EGF)(表皮细胞生长因子)(R&D Systems公司)。
根据本发明的第四方面，提供了一种诱导PPC分化为胰腺内分泌细胞的方法。联合使用胰高血糖素样生长因子(GLP-1)、肝细胞生长因子(HGF)、betacellulin和烟酰胺等诱导分化因子，诱导PPC分化为胰腺内分泌细胞。一种将胰岛干细胞培养成为胰腺内分泌细胞的方法，包括以下步骤a)将胰岛干细胞接种于含有培养基C的培养皿中，培养2-5天；b)将培养基C更换为培养基D，但仍然在培养皿中，培养大约4-15天，得到可分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞。
其中，所述培养基C包括48％DMEM(厂家Invitrogen公司，货号11966)、48％Nutrient Mixture Ham’s F-12，(厂家Invitrogen公司，货号11765)、2％B27(厂家Invitrogen公司)或者1g/L(5mg/L胰岛素+5mg/L transferring+mgyliter selenium)ITS(厂家Sigma公司，密苏里州，美国)、0.05％-0.2％BSA(牛血清白蛋白)(厂家Sigma公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-链霉素)(厂家Invitrogen公司)、10-20ng/ml Human RecombinantBasic Fibroblast Growth Factor(bFGF)，(碱性成纤维细胞生长因子)(R&D Systems公司)、10-20ng/ml Human Recombinant EpidermalGrowth Factor(EGF)，(表皮细胞生长因子)(R&D Systems公司)；或者包括DMEM/F12 1∶1(8mM glucose)，B27(50X，GIBCO)，0.075％BSA，bFGF 20ng/ml，EGF 20ng/ml，Antibiotics(100X，GIBCO)。
其中所述培养基D包括48％DMEM(厂家Invitrogen公司，货号11966)、48％Nutrient Mixture Ham’s F-12’(厂家Invitrogen公司，货号11765)、2％B27(厂家Invitrogen公司)或者(5mg/L胰岛素+5mg/L transferring+mgyliter selenium)ITS(厂家Sigma公司)、0.05％-0.1％BSA(牛血清白蛋白)(厂家Sigma公司)、100uPenicillin-100ugStreptomycin(青霉素-链霉素)(厂家Invitrogen公司)、10mM烟酰胺(厂家sigma公司)、10-100nM GLP-1(7-36amide)(胰高血糖素样肽1，7-36氨基酸残基)(厂家sigma公司)、10ng/ml HGF(肝细胞生长因子)(厂家R&D Systems公司)、500pmol/L Betacellulin(厂家R&D Systems公司)或者包括DMEM/F12 1∶1(5.6mM glucose)，B27(50X，Invitrogen公司)，0.075％BSA，10mM nicotinamide，Antibiotics(100X，Invitrogen公司)，10-100nM GLP-1(7-36 amide)(厂家sigma公司)，10ng/mlHGF(厂家R&D Systems公司)，500pmol/L Betacellulin(厂家R&DSystems公司)。
实施例1糖尿病动物模型胰腺组织中nestin阳性细胞的检测患有糖尿病的食蟹猴胰腺组织的获得麻醉Ketamine 10mg/kg Atropine 0.04mg/kg 安定1mg/kg腹部备皮于剑突下腹正中切口，切开腹膜进入腹腔，分离大网膜及肠管，于胃大弯下缘可见略带粉红色的胰腺，猴子的胰尾大多游离，于胰尾边缘先缝一针，然后其周围合包缝合一块大约0.5×1cm大小的一块胰腺组织，放入含有抗生素的冰冷Hank’s液中并洗2遍。
对胰腺干细胞的检测1)免疫组化方法胰腺组织在4℃ 4％的多聚甲醛中固定24小时，然后0.01M PBS洗三遍(胰腺组织石蜡包埋切片)，5％封闭用正常羊血清室温下封闭1小时，然后4℃一抗孵浴过夜，0.01MPBS洗三遍，荧光二抗室温孵浴2小时，0.01MPBS洗三遍，封片后于Nikon2000U荧光显微镜下观察。
所用到的抗血清有兔抗nestin抗体(厂家Chemicon公司，加利福尼亚州，美国)、豚鼠抗胰岛素抗体(厂家Zymed Laboratories公司，南加利福尼亚州，美国)、小鼠抗胰高血糖素抗体(厂家Sigma公司)、兔抗生长抑素抗体(DAKO公司，丹麦)。荧光二抗有Texasred羊抗兔IgG，Texas red羊抗小鼠IgG，Texas red羊抗豚鼠IgG，Cy2羊抗兔IgG，所有荧光抗体都按1∶200稀释。
兔抗nestin抗体主要用来检测Nestin蛋白。Nestin蛋白是一种中等纤维骨架蛋白，在神经发育的研究中被确定为神经干细胞的标志物，目前多数学者认为Nestin蛋白也可作为胰腺干细胞的标志物。
兔抗胰岛素抗体主要用来检测胰岛β细胞，胰岛β细胞是胰腺内分泌部的主要功能细胞，它是体内唯一可分泌胰岛素的细胞。
小鼠抗胰高血糖素抗体主要用来检测胰岛内的α细胞，α细胞是胰岛内分泌胰高血糖素的细胞。
兔抗生长抑素抗体主要用来检测胰岛内的δ细胞，δ细胞是胰岛内分泌生长抑素的细胞。
结果本发明动物模型免疫组化结果显示，胰岛的β细胞被完全破坏，同时残存在胰岛内的α细胞明显增生。Nestin阳性细胞在正常情况下存在于胰岛团的边缘和胰腺腺管，而在实施例的模型胰腺内，nestin阳性细胞主要存在于胰岛团内，腺管内分布明显减少。
图1B显示正常猴胰腺组织中胰岛的免疫组化结果(a、c、e)和糖尿病猴胰腺组织中胰岛的免疫组化结果(b、d、f)。结果显示糖尿病猴的胰岛β细胞全部被破坏(b和a)，胰高血糖素细胞明显增多(d和c)，而分泌生长抑素的δ细胞无明显改变(f和e)。
图1C显示针对Nestin基因的免疫组化结果，a是正常猴的结果，b是糖尿病猴的结果。图1C显示，对于正常猴和糖尿病猴，胰腺组织中均有Nestin的表达，只是Nestin阳性细胞的分布有所变化，在正常猴的胰腺组织内，Nestin阳性细胞分布于胰腺腺管和胰岛团的周边，而在糖尿病猴的胰腺组织中，Nestin阳性细胞主要分布于胰岛内，并且数量明显增多。
2)RT-PCR分析方法细胞或组织的总RNA采用TRIZOL法提取，2微克的总RNA被逆转录为cDNA，RT-PCR的反应体系由50mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM spermidine，20 U ofRnasin，0.5mM dNTP，0.5μg of Oligo(dT)15，50 U of SuperScriptTMIIRT(Invitrogen)，和无核酶水构成，然后反应体系在42℃水浴60分钟和72℃水浴15分钟。然后通过30-45循环的PCR扩增目标基因，PCR的反应体系由10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1.75mM MgCl2，0.4mM dNTP，0.2μM of sense and antisense primer，6.25 U Taq DNA polymerase and 3μg of cDNA构成。变性温度为94℃时间为45秒，退火温度根据具体引物决定，时间为30秒，延伸温度为72℃时间为7分钟。PCR产物通过1.5％的凝胶电泳分离。
引物序列Insulin上游引物TCA CAC CTG GTG GAA GCT C(序列1)，下游引物ACA ATG CCA CGC TTC TGC(序列2)(179bp)。
Glucagon上游引物ATT CAC AGG GCA CAT TCA CC(序列3)，下游引物AAC AAT GGC GAC CTC TTC TG(序列4)(260bp)。
Somatostatin上游引物GTT TCT GCA GAA GTC TGG G(序列5)，下游引物AGT TCT TGC AGC CAG CTT TG(序列6)(223bp)。
PDX-1上游引物GGA TGA AGT CTA CCA AAG CTC ACG C(序列7)，下游引物CCA GAT CTT GAT GTG TCT CTC GGTC(序列8)(218bp)。
Nestin上游引物AGA GGG GAA TTC CTG GAG(序列9)和CTG AGG ACC AGG ACT CTC TA(序列10)(496bp)。
ABCG2上游引物GGT CTC AGG AAG ACT TAT GT(序列11)，下游引物AAG GAG GTG GTG TAG CTG AT(序列12)(323bp)。
Isl1上游引物CTT AAA TTG GAC TCC TAG AT(序列13)，下游引物GGA TTT GGA ATG GCA TGC GG(序列14)(280bp)。
Glut2上游引物TCC TGG CCT TTA CCC TGT TTA C(序列15)，下游引物CAG ACG GTT CCC TTA TTG TTT C(序列16)(209bp)β-actin上游引物TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAGC(序列17)，下游引物GCA CAG CTT CTC CTT AAT GTC ACGC(序列18)(396bp)。
结果本发明动物模型胰腺组织的RT-PCR分析结果显示如图1A所示，其中左侧的是正常猴的胰腺组织细胞的结果，右侧是糖尿病动物的胰腺组织的结果。如图1A所示，胰岛素基因(Insulin)表达转为阴性，胰高血糖素基因(Glucagon)和生长抑素基因(Somatostatin)表达仍呈现阳性，PDX-1基因表达转为阴性，β-actin基因表达仍呈现阳性，干细胞标志Nestin基因表达仍呈现阳性。这说明在本发明使用的模型中，虽然胰岛β细胞被严重破坏，但在残存的胰岛内，nestin阳性的胰腺干细胞仍然存在于糖尿病动物的胰腺组织中(见图1A)。
实施例2从糖尿病动物胰腺组织中分离残存的胰岛细胞团将实施例1中获得的胰腺组织剪碎成1mm3大小的组织块，3mg/ml的V型胶原酶中37℃消化10分钟，然后加入等体积的冰冷的Hank’s液终止消化，1000rpm离心2-3分钟后，去上清，冰冷Hank’s液中洗3遍，100目钢网过滤，除去大块组织后，将分离得到的细胞团接种于含有培养基A的60mm的细菌培养皿中3天，每天用10ml的移液管吹打一次，防止细胞团贴壁，然后于解剖镜下挑取胰岛细胞团。参见图2A，分离得到的胰岛细胞团在细菌培养皿中为漂浮的圆形或椭圆形胰岛细胞团。
另外，根据实验数据，当在V型胶原酶中的消化时间为5-10分钟，并且细胞团在培养皿中培养2-5天时，均可以得到基本相同的胰岛细胞团，以下分别为消化5分钟，培养2天(见图5A)；消化5分钟，培养5天(见图5B)；消化10分钟，培养2天(见图5C)；消化10分钟，培养5天得到的胰岛细胞团(见图5D)实施例3胰岛干细胞的分离、培养将实施例2中得到的分离后的巢蛋白阳性的胰岛细胞团再加入培养基A，接种于60mm的Petri dish中3天，每天用10ml的移液管吹打细胞一次，防止胰岛贴壁。3天后，将挑取的胰岛细胞团接种于含有培养基B的普通细胞培养皿中培养15天左右，当生长出来的星形胰岛干细胞将汇合时传代，参见图2B、2C。
以下为培养基A和培养基B的成分，在实施例3中，采用的具体配方是配方4，但是采用文中提到的其他配方也可以同样得到胰岛干细胞。
培养基A成分比例厂家RPMI 1640 86％InvitrogenFBS 10％Invitrogen配方1 HEPES(1M) 1％ Invitrogen丙酮酸钠(100mM) 1％ InvitrogenL-谷氨酰胺(200mM) 1％ Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenRPMI 1640 81％InvitrogenFBS 15％Invitrogen配方2 HEPES(1M) 1％ Invitrogen丙酮酸钠(100mM) 1％ InvitrogenL-谷氨酰胺(200mM) 1％ Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenRPMI 1640 88％InvitrogenFBS 8％ Invitrogen配方3 HEPES(1M) 1％ Invitrogen丙酮酸钠(100mM) 1％ InvitrogenL-谷氨酰胺(200mM) 1％ Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenRPMI 1640 43mlInvitrogen配方FBS 5ml Invitrogen4(等同 HEPES(100X) 0.5ml Invitrogen于配方 丙酮酸钠(100X) 0.5ml Invitrogen1) L-glutamine(100X) 0.5ml InvitrogenAntibiotic(100X)0.5ml Invitrogen
培养基B成分 比例 厂家RPMI 1640 86％ InvitrogenFBS 10％ InvitrogenHEPES(1M) 1％Invitrogen丙酮酸钠(100mM) 1％Invitrogen配方1 L-谷氨酰胺(200mM) 1％Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素1％InvitrogenbFGF 20ng/mlR&D SystemsEGF 20ng/mlR&D SystemsRPMI 1640 81％ InvitrogenFBS 15％ InvitrogenHEPES(1M) 1％Invitrogen丙酮酸钠(100mM) 1％Invitrogen配方2 L-谷氨酰胺(200mM) 1％Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素1％InvitrogenbFGF 20ng/mlR&D SystemsEGF 20ng/mlR&D SystemsRPMI 1640 88％ InvitrogenFBS 8％InvitrogenHEPES(1M) 1％Invitrogen丙酮酸钠(100mM) 1％Invitrogen配方3 L-谷氨酰胺(200mM) 1％Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素1％InvitrogenbFGF 20ng/mlR&D SystemsEGF 20ng/mlR&D SystemsRPMI 1640 43ml InvitrogenFBS 5mlInvitrogen配方HEPES(100X) 0.5ml Invitrogen4(等同 丙酮酸钠(100X)0.5ml Invitrogen于配方 L-glutamine(100X) 0.5ml Invitrogen1) Antibiotic(100X) 0.5ml InvitrogenHuman bFGF20ng/mlR&D SystemsHuman EGF 20ng/mlR&D Systems
多角的星状细胞(胰岛干细胞或称为胰腺前体细胞)进行细胞免疫组化检测。该细胞的免疫组化染色按以下方法培养细胞在4℃4％的多聚甲醛中固定20分钟，然后0.01MPBS洗三遍(培养细胞接种于涂有明胶的盖玻片上)，5％封闭用正常羊血清室温下封闭1小时，然后4℃一抗孵浴过夜，0.01MPBS洗三遍，荧光二抗室温孵浴2小时，0.01MPBS洗三遍，封片后于Nikon2000U荧光显微镜下观察。一抗和二抗的抗体同实施例1。
多角的星状细胞进行RT-PCR扩增，RT-PCR分析采用以下方法细胞的总RNA采用TRIZOL法提取，2微克的总RNA被逆转录为cDNA，RT-PCR的反应体系由50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亚精胺、20U Rnasin、0.5mMdNTP、0.5μg Oligo(dT)15、 50U SuperScriptTMII RT(厂家Invitrogen)、和无核酶水构成，然后反应体系在42℃水浴60分钟和72℃水浴15分钟。然后通过30-45循环的PCR扩增目标基因，PCR的反应体系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％Triton X-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有义和反义引物、6.25U TaqDNA聚合酶、以及3μg cDNA构成。变性温度为94℃时间为45秒，退火温度根据具体引物决定，时间为30秒，延伸温度为72℃时间为7分钟。PCR产物通过1.5％的凝胶电泳分离。
引物序列胰岛素上游引物TCA CAC CTG GTG GAA GCT C(序列19)，下游引物ACA ATG CCA CGC TTC TGC(序列20) (179bp)
Somatostatin上游引物GTT TCT GCA GAA GTC TGG G(序列21)，下游引物AGT TCT TGC AGC CAG CTT TG(序列22)(223bp)PDX-1上游引物GGA TGA AGT CTA CCA AAG CTC ACG C(序列23)，下游引物CCA GAT CTT GAT GTG TCT CTC GGTC(序列24)(218bp)。
巢蛋白上游引物AGA GGG GAA TTC CTG GAG(序列25)和CTG AGG ACC AGG ACT CTC TA(序列26)(496bp)。
ABCG2上游引物GGT CTC AGG AAG ACT TAT GT(序列27)，下游引物AAG GAG GTG GTG TAG CTG AT(序列28)(323bp)。
Isl1上游引物CTT AAA TTG GAC TCC TAG AT(序列29)，下游引物GGA TTT GGA ATG GCA TGC GG(序列30)(280bp)。
Glut2上游引物TCC TGG CCT TTA CCC TGT TTA C(序列31)，下游引物CAG ACG GTT CCC TTA TTG TTT C(序列32)(209bp)。
β-actin上游引物TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(序列33)，下游引物GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(序列34)(396bp)。
免疫组化结果显示这些多角形细胞为巢蛋白基因阳性细胞，如图3B所示。RT-PCR结果如图3A中左侧的PPC所示，对于该多角形细胞，下列基因表达为阳性巢蛋白，ABCG2，β-actin，而下列基因表达为阴性PDX-1、ISL-1、Glut-2、胰岛素基因、生长激素抑制素基因(Somatostatin)。
实施例4将胰岛干细胞培养成为胰腺内分泌细胞将实施例3中得到的星形胰岛干细胞用0.25％的胰酶将细胞消化下来后，Hank’s液中洗1遍，然后将细胞接种于含有培养基C的细菌培养皿中3天，得到前类胰岛团样结构(pre-ICC)，图2D。3天后将培养基更换为培养基D，但仍然在细菌培养皿中，培养大约4-6天，得到ICC结构的胰腺内分泌细胞。
以下为培养基C和培养基D的成分，在实施例4中，我们采用的具体配方都是配方7，但是采用文中提到的其他配方也可以同样得到胰腺内分泌细胞。
另外，根据实验结果，在含培养基C(配方7)的培养皿中的培养可以为2-5天，如图所示，分别为培养2天(图6A)和5天(图6B)得到的类胰岛团样结构。根据实验结果，在培养基D(配方7)中培养4-15天均可以得到胰腺内分泌细胞，如图所示，分别为培养10天(图6C)和15天(图6D)所得到的胰腺内分泌细胞。
培养基C成分 比例 厂家DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen配方1 5％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF 20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素1％ Invitrogen配方2 DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Sigma10％BSA 1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF 20ng/ml Invitrogen
10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)48％ InvitrogenF1248％ InvitrogenB272％ Sigma配方3 20％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)49％ InvitrogenF1249％ InvitrogenITS1g/L Sigma配方4 5％BSA 1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l萄萄糖)49％ InvitrogenF1249％ InvitrogenITS1g/L Sigma配方5 10％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)49％ InvitrogenF1249％ InvitrogenITS1g/L Sigma配方6 20％BSA1％ InvitrogenbFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml Invitrogen10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM/F12(5.6mM葡萄糖) 48ml InvitrogenB27(50×) 1ml Invitrogen7.5％BSA 0.5mlInvitrogen配方7 bFGF 20ng/ml InvitrogenEGF20ng/ml InvitrogenAntibiotics(100×) 0.5mlInvitrogen
培养基D成分 比例 厂家DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen5％BSA 1％ Invitrogen配方1 烟酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pM R&D Systems10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen10％BSA 1％ Invitrogen配方2 烟酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pM R&D Systems10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 48％ InvitrogenF12 48％ InvitrogenB27 2％ Invitrogen20％BSA 1％ Invitrogen配方3 烟酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pM R&D Systems10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ Invitrogen配方4 DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 49％ InvitrogenF12 49％ InvitrogenITS 1g/L Sigma5％BSA 1％ Invitrogen烟酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM Sigma
HGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D Systems10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 49％ InvitrogenF12 49％ InvitrogenITS 1g/L Sigma10％BSA 1％ Invitrogen配方5 烟酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D Systems10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖) 49％ InvitrogenF12 49％ InvitrogenITS 1g/L Sigma20％BSA 1％ Invitrogen配方6 烟酰胺 10mM SigmaGLP-1(7-36 amide)10nM SigmaHGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D Systems10000u青霉素-10000ug链霉素 1％ InvitrogenDMEM/F12(5.6mM葡萄糖)48ml InvitrogenB27 1ml Invitrogen配方7 7.5％BSA(100×) 0.5mlInvitrogen(等同 烟酰胺 10mM Sigma于配方 GLP-1(7-36 amide)10nM Sigma1) HGF 10ng/ml R&D SystemsBetacellulin 500pMR&D SystemsAntibiotics(100×) 0.5mlInvitrogen对ICC结构的胰腺内分泌细胞进行细胞免疫组化检测。免疫组化染色按以下方法ICC在4℃ 4％的多聚甲醛中固定1小时，然后0.01M PBS洗三遍(ICC接种于涂有明胶的盖玻片上)，5％封闭用正常羊血清室温下封闭1小时，然后4℃一抗孵育过夜，0.01MPBS洗三遍，荧光二抗室温孵育2小时，0.01MPBS洗三遍，封片后于Nikon2000U荧光显微镜下观察。一抗和二抗的抗体同实施例1。
ICC结构的胰腺内分泌细胞进行RT-PCR扩增。RT-PCR分析采用以下方法细胞的总RNA采用TRIZOL法提取，2微克的总RNA被逆转录为cDNA，RT-PCR的反应体系由50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亚精胺、20U Rnasin、0.5mMdNTP、0.5μg Oligo(dT)15、50U SuperScriptTMII RT(Invitrogen)、和无核酶水构成，然后反应体系在42℃水浴60分钟和72℃水浴15分钟。然后通过30-45循环的PCR扩增目标基因，PCR的反应体系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％Triton X-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有义和反义引物、6.25U Taq DNA聚合酶、以及3μg cDNA构成。变性温度为94℃时间为45秒，退火温度根据具体引物决定，时间为30秒，延伸温度为72℃时间为7分钟。PCR产物通过1.5％的凝胶电泳分离。
RT-PCR分析结果显示，ICC与PPC比较，ICC的巢蛋白基因、ABCG2基因表达减弱或消失，而胰岛相关基因开始表达，胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和PDX-1、ISL1、GLUT2等基因表达呈阳性，见图3A。免疫组化检测显示，ICCs中胰岛素阳性细胞主要分布于ICC的中央而胰高血糖素阳性细胞主要分布于ICC的周边，见图3C。
胰岛素和C肽含量的测定镜下挑选200个正常胰岛、Pre-ICC(进入培养基D之前的)或ICC(指经培养基D分化后的ICC)，放入0.5ml的小离心管中，用无糖DMEM洗两遍，每遍5分钟，然后用30mM的葡萄糖于37℃(O2/CO2，95∶5)孵育90分钟，然后再收集上清用ACTIVE InsulinELISA和ACTIVE C-Peptide of Insulin ELISA试剂盒分析测定，结果见图4。
图4显示Pre-ICCs、ICCs和正常胰岛团在30mM高糖刺激下胰岛素(图4A)和C肽(图4B)的分泌情况。
胰岛素的分泌情况是(μIU/ml)pre-ICCs，3.47±1.55；ICC，45.02±2.94；胰岛团，330.63±31.70。
C肽的分泌情况是(ng/ml)pre-ICC，0±0；ICC，2.19±0.40；胰岛团，19.85±2.34。
实施例5糖尿病动物模型胰腺组织与正常动物胰腺组织各个基因转录水平比较的检测RT-PCR分析采用以下方法细胞或组织的总RNA采用TRIZOL法提取，2微克的总RNA被逆转录为cDNA，RT-PCR的反应体系由50mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亚精胺、20URnasin、0.5mM dNTP、0.5μg Oligo(dT)15、50 U SuperScriptTMII RT(厂家Invitrogen)、和无核酶水构成，然后反应体系在42℃水浴60分钟和72℃水浴15分钟。然后通过30-45循环的PCR扩增目标基因，PCR的反应体系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％TritonX-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有义和反义引物(senseand antisense primer)、6.25U Taq DNA聚合酶、以及3μgcDNA构成。变性温度为94℃时间为45秒，退火温度根据具体引物决定，时间为30秒，延伸温度为72℃时间为7分钟。每个基因的PCR扩增的标准曲线(即被扩增的DNA片段的数量与循环圈数关系的曲线)用Real-time PCR(MJ Research，CFD-3220)的方法建立。为了比较各个基因的转录水平，各个PCR所采用的是循环圈数是Real-timePCR标准曲线上的最大循环圈数。PCR产物通过1.5％的凝胶电泳分离。
引物序列胰岛素上游引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC(序列35)，下游引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA(序列36)(67bp)Glucagon上游引物ATTCACAGGGCACATTCACC(序列37)，下游引物AACAATGGCGACCTCTTCTG(序列38)(260bp)。
Somatostatin上游引物GCTGCTGTCTGAACCCAAC(序列39)，下游引物CGTTCTCGGGGTGCCATAG(序列40)(138bp)PDX-1上游引物TGATACTGGATTGGCGTTGT(序列41)，下游引物GCATCAATTTCACGGGATCT(序列42)(270bp)巢蛋白上游引物AAGAGCTGGAGGGCGTGGTG(序列43)和TCCTGATAGCCGCGCACTG(序列44)(328bp)ABCG2上游引物GGCCTCAGGAAGACTTATGT(序列45)，下游引物AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT(序列46)(342bp)Isl1上游引物TGTTTGAAATGTGCGGAGTG(序列47)，下游引物GTTCTTGCTGAAGCCGATG(序列48)(144bp)Glut2上游引物TTGCTGGAAGAAGCATATCAGG(序列49)，下游引物TGACTAATAAGAATGCCCGTGAC(序列50)(148bp)
β-actin上游引物TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(序列51)，下游引物GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(序列52)(396bp)。
本发明动物模型胰腺组织的RT-PCR分析结果显示如图7所示，其中左侧的是正常猴的胰腺组织细胞的结果，右侧是糖尿病猴的胰腺组织的结果。如图所示，糖尿病动物胰腺组织中胰岛素基因(Insulin)表达减少，胰高血糖素基因(Glucagon)表达增加和生长抑素基因(Somatostatin)表达无明显改变，PDX-1基因表达无明显改变，β-actin基因表达无明显改变，干细胞标志巢蛋白基因表达有所增加，Glut-2基因表达减少。这说明在本发明使用的模型中，虽然胰岛β细胞被严重破坏，但在残存的胰岛内，巢蛋白阳性的胰腺干细胞仍然存在于糖尿病动物的胰腺组织中。
实施例6对多角的星状胰腺干细胞与诱导分化后的ICC各个基因转录水平的检测对实施例3的多角的星状胰腺干细胞与实施例4的诱导分化后的ICC各个基因转录水平的检测。细胞总RNA采用TRIZOL法提取，2微克的总RNA被逆转录为cDNA，RT-PCR的反应体系由50mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM亚精胺、20U Rnasin、0.5mM dNTP、0.5μg Oligo(dT)15、50 U SuperScriptTMII RT(厂家Invitrogen)、和无核酶水构成，然后反应体系在42℃水浴60分钟和72℃水浴15分钟。然后通过30-45循环的PCR扩增目标基因，PCR的反应体系由10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1％Triton X-100、1.75mM MgCl2、0.4mM dNTP、0.2μM有义和反义引物(sense and antisense primer)、6.25U Taq DNA聚合酶、以及3μgcDNA构成。变性温度为94℃时间为45秒，退火温度根据具体引物决定，时间为30秒，延伸温度为72℃时间为7分钟。每个基因的PCR扩增的标准曲线(即被扩增的DNA片段的数量与循环圈数关系的曲线)用Real-time PCR(MJ Research，CFD-3220)的方法建立。为了比较各个基因的转录水平，各个PCR所采用的是循环圈数是Real-time PCR标准曲线上的最大循环圈数。PCR产物通过1.5％的凝胶电泳分离引物序列胰岛素上游引物GCAGCCTTTGTGAACCAACAC(序列53)，下游引物CCCCGCACACTAGGTAGAGA(序列54)(67bp)Somatostatin上游引物GCTGCTGTCTGAACCCAAC(序列55)，下游引物CGTTCTCGGGGTGCCATAG(序列56)(138bp)。
PDX-1上游引物TGATACTGGATTGGCGTTGT(序列57)，下游引物GCATCAATTTCACGGGATCT(序列58)(270bp)巢蛋白上游引物AAGAGCTGGAGGGCGTGGTG(序列59)和CTGTCCTGATAGCCGCGCACTG(序列60)(328bp)。
ABCG2上游引物GGCCTCAGGAAGACTTATGT(序列61)，下游引物AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT(序列62)(342bp)Isl1上游引物TGTTTGAAATGTGCGGAGTG(序列63)，下游引物GTTCTTGCTGAAGCCGATG(序列64)(144bp)Glut2上游引物TTGCTGGAAGAAGCATATCAGG(序列65)，下游引物TGACTAATAAGAATGCCCGTGAC(序列66)(148bp)。
β-actin上游引物TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(序列67)，下游引物GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(序列68)(396bp)。
RT-PCR结果如图8所示ICC与PPC比较，ICC的巢蛋白基因、ABCG2基因表达减弱或消失，而胰岛相关基因开始表达，胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和PDX-1、GLUT2等基因表达呈阳性。
实施例7正常胰岛和诱导分化得到的ICC在不同刺激物的作用下胰岛素和C肽分泌量的测定镜下分别挑选200个正常胰岛或来自实施例4的ICC，放入0.5ml的小离心管中，用无糖DMEM洗两遍，每遍5分钟，然后分别用200ul含有不同浓度葡萄糖(0mM，5.6mM或者16.7mM)的DMEM或者200ul含有10mML-精氨酸和不同浓度葡萄糖(0mM，5.6mM或者16.7mM)的DMEM，37℃(O2/CO2，95∶5)孵育90分钟，然后再收集上清用超敏感的胰岛素ELISA和超敏感的C-Peptide胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia，Uppsala，Sweden)分析测定，结果见图9。
图9结果显示当ICC和成体胰岛在不同浓度的葡萄糖或在同时含有10mM L-精氨酸的刺激下，胰岛素(图9A1、9A2)和C-肽(图9B1、9B2)的分泌情况如下在不同浓度葡萄糖的刺激下，胰岛素分泌量分别为(mIU×10-6/min/ICC or islet)在0mM浓度的葡萄糖刺激下正常成体胰岛的胰岛素分泌量为0.2174±0.0632，ICC为0.0561±0.0258；在5.6mM浓度的葡萄糖刺激下成体胰岛的胰岛素分泌量为0.9305±0.0896，ICC为0.0845±0.0339；在16.7mM浓度的葡萄糖刺激下成体胰岛的胰岛素分泌量为2.0907±0.2644，ICC为0.1801±0.0542；C-肽的分泌量为(pmol×10-6/min/islet or ICC)在0mM浓度的葡萄糖刺激下成体胰岛的C-肽分泌量为4.441±1.218，ICC为0.0585±0.1013；在5.6mM浓度的葡萄糖刺激下成体胰岛的C-肽分泌量为7.3336±1.9997，ICC为0.1295±0.1323；在16.7mM浓度的葡萄糖刺激下成体胰岛的C-肽分泌量为9.4841±3.3433，ICC为0.5423±0.1382.当在不同浓度的葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，胰岛素的分泌量为(mIU×10-6/min/ICCor islet)在0mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，成体胰岛的胰岛素分泌量为0.6003±0.0419，ICC为0.0641±0.0279；在5.6mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，成体胰岛的胰岛素分泌量为2.7675±0.8867，ICC为0.1809±0.0211；在的16.7mM葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，成体胰岛的胰岛素分泌量为6.1731±2.4574，ICC为0.2677±0.0792；C-肽的分泌量为(pmol×10-6/min/islet or ICC)在0mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，成体胰岛的C-肽分泌量为5.5077±1.2808，ICC为0.2984±0.0301，在5.6mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，成体胰岛的C-肽分泌量为7.9897±0.4765，ICC为0.4901±0.1382，在16.7mM的葡萄糖和10mML-精氨酸同时刺激下，成体胰岛的C-肽分泌量为12.6138±2.8141，ICC为0.6295±0.2471。
结果显示，根据本发明的方法，从糖尿病动物的胰腺细胞可以获得的ICC结构的胰腺内分泌细胞，该胰腺内分泌细胞可以分泌胰岛素和C肽。该体外培养的胰腺内分泌细胞可以同体或者异体移植给糖尿病动物，使糖尿病动物可以摆脱胰岛素注射的依赖。并且解决了异体移植的排斥反应和干细胞来源不足的问题。另外，本发明所提及的引物序列是由人工合成的(可由上海生工合成)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种检测糖尿病动物胰腺组织中胰腺干细胞的方法，包括a)免疫组化检测，包括胰腺组织固定，制作石蜡包埋切片，封闭后接触一抗抗体，接触二抗抗体，然后封片观察，其中所述一抗抗体包括兔抗巢蛋白抗体；b)RT-PCR分析，包括提取总RNA，通过逆转录形成cDNA，然后利用引物进行PCR扩增；c)根据步骤a)和b)的结果确定糖尿病动物胰腺组织中是否存在胰腺干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)中PCR扩增使用的引物包括巢蛋白基因的上游引物AGAGGGGAATTC CTGGAG和下游引物AGGACCAGGACTCTCTA(496bp)或者上游引物AAGAGCTGGAGGGCGTGGTG和下游引物CTGTCCTGATAGCCGCGCACTG(328bp)。
3.一种从糖尿病动物胰腺组织中分离残存的胰岛细胞团的方法，包括以下步骤a)将胰腺组织剪碎成块；b)对块状的胰腺组织进行酶消化，然后终止消化；c)离心分离，去上清，清洗；d)得到分离后的胰岛细胞团。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤b)中酶消化是在V型胶原酶中在37℃消化5-10分钟。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤b)中通过加入等体积的冰冷的Hank’s液终止消化。
6.一种胰岛干细胞的分离、培养的方法，包括以下步骤a)将从糖尿病动物胰腺组织中分离出的胰岛细胞团加入装有培养基A的培养皿中，培养2-5天；b)将悬浮的胰岛细胞团接种于含有培养基B的培养皿中培养；c)经过6-20天，生长出星形胰岛干细胞；d)在所述星形胰岛干细胞将汇合时传代，直到长满传代后的培养皿，得到扩增的胰岛干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基A包括基础培养基、缓冲液、血清、氨基酸和抗生素。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述基础培养基包括RPMI1640；所述血清包括FBS；所述缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、丙酮酸钠缓冲液；所述氨基酸包括L-谷氨酸；所述抗生素包括青霉素-链霉素。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基A包括RPMI1640、8-15％FBS、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、1mM丙酮酸钠缓冲液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100ug链霉素。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基A的按体积计算的配方可以为86％RPMI 1640、10％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸钠(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者81％RPMI 1640、15％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸钠(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者88％RPMI 1640、8％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸钠(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者43ml RPMI 1640、5ml FBS、0.5mlHEPES(100X)、0.5ml丙酮酸钠(100X)、0.5ml L-glutamine(100X)、0.5ml Antibiotic(100X)。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养基B包括基础培养基、缓冲液、血清、氨基酸、抗生素和生长因子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基础培养基包括RPMI1640；所述血清包括FBS；所述缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、丙酮酸钠缓冲液；所述氨基酸包括L-谷氨酸；所述抗生素包括青霉素-链霉素；所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述培养基B包括RPMI1640、8-15％FBS、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲液、1mM丙酮酸钠缓冲液、2mM L-谷氨酸、100u青霉素-100u链霉素、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-20ng/ml表皮细胞生长因子。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养基B包括86％RPMI 1640、10％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸钠(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug链霉素、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF；或者81％RPMI1640、15％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸钠(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug链霉素、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF；或者88％RPMI 1640、8％FBS、1％HEPES(1M)、1％丙酮酸钠(100mM)、1％L-谷氨酰胺(200mM)、1％10000u青霉素-10000ug链霉素、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF；或者43ml RPMI 1640、5ml FBS、0.5ml HEPES(100X)、0.5ml丙酮酸钠(100X)、0.5mlL-glutamine(100X)、0.5ml Antibiotic(100X)、20ng/ml HumanbFGF、20ng/ml Human EGF。
15.一种将胰岛干细胞培养成为胰腺内分泌细胞的方法，包括以下步骤a)将胰岛干细胞接种于含有培养基C的培养皿中，培养2-5天；b)将培养基C更换为培养基D，但仍然在培养皿中，培养大约4-15天，得到可分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞。
16.根据权利要求15所述的将胰腺干细胞培养成为胰腺内分泌细胞的方法，其中所述培养皿为细菌培养皿或涂有0.01％多聚鸟氨酸或多聚赖氨酸的细胞培养皿。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基C包括基础培养基、培养添加剂、白蛋白、抗生素和生长因子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述基础培养基包括DMEM和Nutrient Mixture Ham’s F-12’；所述培养添加剂包括B27或者1g/LITS；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-链霉素；所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述培养基C包括49％DMEM、49％Nutrient Mixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/LITS、0.05％-0.2％BSA、100u青霉素-100ug链霉素、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-20ng/ml表皮细胞生长因子。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基C包括48％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％5％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者48％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％10％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者48％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％20％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者49％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/L ITS、1％5％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者49％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％10％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者49％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％20％BSA、20ng/mlbFGF、20ng/ml EGF、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者DMEM/F12 1∶1(8mM glucose)、B27(50X)、0.075％BSA、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、Antibiotics(100X)。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基D包括基础培养基、培养添加剂、白蛋白、抗生素、有诱导功能的多肽和生长因子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述基础培养基包括DMEM和Nutrient Mixture Ham’s F-12’；所述培养添加剂包括B27或者1g/L ITS；所述白蛋白包括BSA；所述抗生素包括青霉素-链霉素；所述多肽和生长因子包括烟酰胺、GLP-1、HGF、Betacellulin。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述培养基D包括49％DMEM、49％Nutrient Mixture Ham’s F-12’、2％B27或者1g/LITS、0.05％-0.2％BSA、100u青霉素-100ug链霉素、10mM烟酰胺、10-100nM GLP-1、10ng/ml HGF、500pmol/LBetacellulin。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基D包括48％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％的5％BSA、10mM烟酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者48％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％的10％BSA、10mM烟酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者48％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、48％F12、2％B27、1％20％BSA、10mM烟酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者49％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％5％BSA、10mM烟酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；49％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％10％BSA、10mM烟酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；49％DMEM(无糖)或(3mmol/l葡萄糖)、49％F12、1g/LITS、1％20％BSA、10mM烟酰胺、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pM Betacellulin、1％10000u青霉素-10000ug链霉素；或者DMEM/F12 1∶1(5.6Mm glucose)、B27(50X)、0.075％BSA、10mM nicotinamide、Antibiotics(100X)、10nM GLP-1(7-36amide)、10ng/ml HGF、500pmol/LBetacellulin。
25.利用权利要求3至5中任一项所述的从糖尿病动物胰腺组织中分离得到的胰岛细胞团。
26.利用权利要求6至14中任一项所述的胰岛干细胞的分离、培养的方法得到的胰岛干细胞，所述胰岛干细胞为多角形细胞，其中巢蛋白基因表达为阳性。
27.利用权利要求15至24中任一项所述的将胰岛干细胞培养成为胰腺内分泌细胞的方法得到的胰腺内分泌细胞。
全文摘要
本发明涉及从糖尿病动物的胰腺组织中分离、培养胰岛干细胞和将胰岛干细胞诱导分化为可分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞的方法。从糖尿病动物胰腺组织中分离胰岛细胞团，然后a)将从糖尿病动物胰腺组织中分离出的胰岛细胞团加入装有培养基A的培养皿中，培养2－5天；b)将悬浮的胰岛细胞团接种于含有培养基B的培养皿中培养；c)经过6－20天，生长出星形胰岛干细胞；d)在所述星形胰岛干细胞将汇合时传代，至到长满传代后的培养皿，得到胰岛干细胞。将胰岛干细胞接种于含有培养基C的培养皿中，培养2－5天；将培养基C更换为培养基D，但仍然在培养皿中，培养大约4－15天，得到可分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞。
文档编号C12Q1/68GK1982440SQ200610098769
公开日2007年6月20日 申请日期2006年7月14日 优先权日2005年7月15日
发明者张愚, 邹春林, 陈彪 申请人:北京市赛诺科生物工程技术有限公司